α-Hemolyzinový z Escherichia coli využívá vnitřního zesílení přes P2X receptor aktivace vyvolat hemolýzu

Výsledky

HlyA-Indukovaná Hemolýza Vyžaduje Aktivaci Purinergic Receptors.

Supernatant z α-hemolyzinový (HlyA)–produkující E. coli–kmen ARD6 zajímá koní, lidských a myších erytrocytů (Obr. 1). Obrázek 1 ukazuje hemolýzu vyvolanou HlyA jako funkci času. Časosběrné experimenty s myší a lidskými erytrocyty připojenými k krycím sklům odhalily, že hemolýza vyvolaná HlyA je sekvenční proces. Během prvních 20 minut, HlyA vyvolané crenation červených krvinek v důsledku smrštění buňky, následuje postupné zvýšení hlasitosti a nakonec lýza buňky (Obr. 1A a 1B, film S1). Toto postupné smrštění a otok platí také na úrovni jedné buňky. Tak, to není odlišné populace červených krvinek, které buď zmenšit nebo zvětšit, ale spíše, že jeden erytrocyt nejprve zmenšuje a pak se zvětší v důsledku HlyA aplikace. Suspenze erytrocytů (1,25%) byla inkubována se zředěným supernatantem E. coli (50 µl * ml−1). Erytrocyty ze tří testovaných druhů vykazovaly výrazný rozdíl v reakci na HlyA (obr. 1C) s NEJNIŽŠÍ citlivostí na HlyA v lidských erytrocytech. Ve všech následujících experimentech bylo množství přidaného supernatantu E. coli upraveno tak, aby po 60 minutách inkubace vzniklo ≈50% hemolýzy.

obecně používáme filtrovaný supernatant E. coli (ARD6) k vyvolání hemolýzy, pokud není uvedeno jinak. Tento přístup byl zvolen, aby se zajistilo, že naše výsledky budou platit také in vivo, kde se HlyA uvolňuje z E. coli spolu s různými dalšími složkami. Při výběru tohoto přístupu jsme však museli ověřit, že hemolýza vyvolaná E. coli produkující HlyA může být ve skutečnosti připisována HlyA. Proto jsme vyčistili HlyA z naší ARD6-kultury. Po čištění se suspenze purifikované HlyA oddělí na 5-15% dodecylsulfátu sodného (SDS) gelu. Po barvení Coomassie R se objevilo jediné pásmo 100 kDa a hmotnostní spektroskopie identifikovala pásmo jako HlyA (obr. S1 A A B). Jako další kontrolu jsme použili supernatant z E. coli kmen D2103, non-patologické laboratorní kmen E. coli, které neprodukuje HlyA. Supernatant z těchto bakterií nevyvolával hemolýzu u lidských, myších nebo koňských erytrocytů (obr. S1D). Dále, porovnali jsme naše zjištění s HlyA laskavě dodaným Prof. Sucharit Bhakdi, University of Mainz, Německo (s aktivitou 10 ng * ml-1 pro ≈50% hemolýzu, obr. S2). V následujícím textu, když je zmíněna čištěná HlyA, je to s odkazem na tento přípravek. Během našich počátečních testů biologické aktivity HlyA jsme zjistili, že apyrasa vychytávače ATP zcela inhibovala hemolýzu koňských erytrocytů indukovanou HlyA. Toto zjištění bylo skutečně překvapivé, protože to znamenalo extracelulární ATP nezbytný pro hemolýzu způsobenou E.coli produkující HlyA. Protože extracelulární ATP je signální molekula, která aktivuje receptory P2, naše zjištění by mohla naznačovat, že převládající model pórů pro hemolýzu indukovanou HlyA může být zjednodušením. Proto jsme testovali účinek úklidu ATP důkladněji. Zjistili jsme, že apyrasa zcela inhibuje hemolýzu nejen koní, ale také myší a lidských erytrocytů (obr. 2A). Kromě toho, hexokináza, která se rychle degraduje adenosin trifosfátu (ATP) na adenosindifosfát (ADP), podobně snižuje HlyA-indukovaná hemolýza červených krvinek, myšího a lidského původu v závislosti na koncentraci způsobem (Obr. 2B). Toto zjištění bylo ověřeno vyčištěnou HlyA (obr. 2B, vložka). Je třeba poznamenat, že v lidských erytrocytech apyrasa i hexokináza potencovaly hemolýzu indukovanou HlyA při nižších koncentracích. Rozdíl může naznačovat rozdíl ve vzorci exprese receptoru P2 na červených krvinkách mezi jednotlivými druhy.

pro ověření relevance tohoto nálezu bylo důležité zjistit, zda antagonisté receptoru P2 ovlivnili hemolýzu indukovanou HlyA. Neselektivní antagonista P2 receptoru PPADS v závislosti na koncentraci snížil hemolýzu indukovanou E. coli produkující HlyA u koní, myší a lidských erytrocytů (obr. 2C). Hodnota EC50 pro PPADS byla 520 µM, 400 µM a 180 µM pro lidské, myší a koňské erytrocyty. Toto zjištění bylo doloženo pro celý rozsah koncentrací HlyA (obr. 2D) testováno na lidských erytrocytech vystavených purifikované HlyA. Vztah koncentrace a odpovědi byl slučitelný s kompetitivním antagonismem a je třeba poznamenat, že účinek i maximálních koncentrací toxinu byl snížen blokátorem receptoru P2. Zdá se tedy, že aktivace receptoru P2 se podílí na hemolýze vyvolané HlyA. Neselektivní antagonista receptoru P2 suramin také v závislosti na koncentraci snížil hemolýzu indukovanou HlyA u všech tří druhů (údaje nejsou uvedeny). Ve vyšších koncentracích však suramin způsobuje dramatické smrštění erytrocytů, a proto nemusí být vhodný pro hodnocení implikace P2 receptoru v erytrocytech.

posoudit, zda účinek purinergic antagonista na hemolýza byl pouze výsledkem zvýšené osmolality, jsme testovali vliv extracelulární sacharózy na HlyA-indukovaná hemolýza (údaje nejsou uvedeny). Sacharóza (1 mM) pouze mírně snížila hemolýzu (5, 1% ± 1, 7%), zatímco 10 mM a 75 mM sacharóza výrazně snížila hemolýzu (28.5% ± 5.0%, 82.8% ± 5.2%). Vzhledem k tomu, že koncentrace antagonistů a Atpáz použitých v této studii nikdy nepřesáhly 1 mM, nemůže být účinek výsledkem zvýšené osmolarity. Ani naše výsledky neodrážely neselektivní vazbu mezi antagonisty a toxinem. To byl testován v koňské erytrocyty, které byly preincubated s HlyA po dobu 10-15 minut při 37 °C nebo po dobu 30 minut při 4 °C, důkladně umýt, a re-suspendován s nebo bez antagonisté. Protože je HlyA začleněna do membrány během preinkubace, erytrocyty pokračovaly v lýze v nepřítomnosti volné HlyA. Obr. S2 ukazuje, že různé farmakologické intervence snížily hemolýzu poté, co byl HlyA prebound na erytrocyty. Antagonisté však byli méně účinní, když byli přidáváni do promytých erytrocytů, ve kterých byl lytický proces již zahájen.

který Receptor (receptory) P2 se podílí na hemolýze vyvolané HlyA?

erytrocyty exprimují různé typy receptorů P2. P2 receptory, které byly hlášeny být vyjádřeny v dospělých lidských erytrocytů patří P2Y1 (14), P2Y2 (15), P2Y13 (15), P2X1 (15), a P2X7 (16), vzhledem k tomu, že P2Y1, P2X1, P2X4 a P2X7 se zdají být přítomen v erytroidních progenitorových buněk (17). Abychom otestovali, který z těchto purinergních receptorů se účastní hemolýzy indukované HlyA, Oslovili jsme dotyčné receptory individuálně. Jako P2Y1 receptor je zapojen do sorbitol-indukovaná hemolýza plasmodium-infikovaných lidských a myších erytrocytů (14), testovali jsme, zda tento receptor je zodpovědný za HlyA-indukovaná hemolýza. Antagonista receptoru P2Y1 MRS2179 neovlivnil hemolýzu indukovanou HlyA (obr. S3A) v koncentracích (až 500 µM) nad rámec toho, co bylo zapotřebí k inhibici hemolýzy v erytrocytech infikovaných Plasmodium berghei (14). Protože neexistují žádné specifické antagonisty receptorů P2Y2, zkoumali jsme účinek HlyA u transgenních myší. Hemolýza vyvolaná HlyA byla podobná u erytrocytů u myší P2Y2 – / – a P2Y2+/+ (obr. S3B). V případě P2Y13 jsme testovali antagonistu MRS2211, u kterého bylo hlášeno, že vykazuje určitou selektivitu vůči receptoru P2Y13 (18). MRS2211 významně snížil hemolýzu indukovanou HlyA u lidských a myších erytrocytů (obr. S3C). Toto zjištění je v rozporu s našimi výsledky s hexokinázou (degradující ATP na ADP), která by měla spíše stimulovat než inhibovat receptor P2Y13 citlivý na ADP. Proto by hexokináza a MRS2211 měly poskytnout protichůdné výsledky, pokud se jedná o receptor P2Y13. Protože tomu tak není, receptor P2Y13 je nepravděpodobným kandidátem na receptor P2 zapojený do hemolýzy vyvolané HlyA. Nemůžeme vyloučit možnost, že inhibice produkovaná MRS2211 je zprostředkována jiným receptorem P2.

v zásadě to ponechává pouze P2X receptory, které mají být vzaty v úvahu. Obr. 3A ukazuje, že neselektivní blokátor P2X receptorů Evans blue silně snížil hemolýzu indukovanou HlyA, což naznačuje, že se na této hemolýze podílí P2X receptor. Z P2X-receptorů exprimovaných v erytrocytech jsme považovali P2X7 za nejpravděpodobnější mediátor hemolýzy vyvolané HlyA z následujících důvodů. Je známo, že receptory P2X7 procházejí přechodem do stavu větší permeability, což nakonec vede k lýze v určitých buňkách (12). Na P2X7 receptoru byla hlášena interakce s kanálem bílkovin pannexin1 (12), a komplex vytváří značný pór propustný pro větší molekuly, jako je ethidium bromidu (13). Pannexin1 je exprimován v lidských červených krvinkách (19) a nedávno byl navržen jako kanál uvolňování ATP v erytrocytech (20). Otestovat, zda P2X7 receptory se účastní HlyA-indukovaná hemolýza, použili jsme antagonisté s relativní selektivitou pro P2X7: Brilliant Blue G (BBG), ATP-2′,3′-dialdehyde (OxATP), a KN-62 (21). Všichni antagonisté v závislosti na koncentraci snížili hemolýzu u koní, myší a lidských erytrocytů (obr. 3). Koňské a lidské erytrocyty byly citlivější na všechny testované látky ve srovnání s myšími erytrocyty. V této souvislosti je třeba zmínit, že je známo, že myší receptor P2X7 je méně citlivý na KN-62 ve srovnání s lidským receptorem (22). Ochrana proti hemolýze antagonismem receptoru P2X byla opět doložena pro celé koncentrační rozmezí purifikované HlyA v lidských erytrocytech pomocí BBG jako příkladu antagonisty P2X7(obr. 3D). Antagonista opět vykazuje podstatný účinek na hemolýzu indukovanou HlyA i při koncentracích HlyA, které vyvolaly maximální hemolýzu. Inhibice hemolýzy OxATP byla ověřena pomocí purifikované HlyA v myších a lidských erytrocytech (obr. 3E, vložka). Román selektivní, konkurenční P2X7 receptoru A438079 snižuje hemolýza lidských erytrocytů, ale byl méně účinný v myších erytrocytech (Obr. 3F). Imunobloty plazmatických membránových frakcí pro receptor P2X7 potvrzují, že lidské a myší erytrocyty exprimují protein příslušné velikosti (66 kDa, obr. 3G a v plném rozsahu na obr. S4B). Bude vyžadovat další vyšetřování k úplnému stanovení relativního příspěvku P2X receptorů v hemolýze vyvolané HlyA. S našimi současnými nástroji nemůžeme vyloučit možnost příspěvků od jiných P2X receptorů v hlya indukované hemolýze u některého ze studovaných druhů.

Obr. S4A ukazuje hemolýzu indukovanou HlyA u myších (P2X7+/+ a P2X7−/−) erytrocytů. Myší erytrocyty vykazují podobný stupeň hemolýzy v reakci na HlyA bez ohledu na jejich genotyp. P2X7 – / – myši a P2X7+/+ myši byly původně generovány společností Pfizer a byly zpětně kříženy na pozadí BALB/c. Jsme neobjevili žádné rozdíly mezi citlivostí na HlyA-indukovaná hemolýza erytrocytů izolované z BALB/c a C57BL/6 myší (data nejsou zobrazena), i když C57BL/6 kmen je známo, že mají genetické variace v C terminus P2X7 receptoru (23). Tyto údaje jsou v souladu s minimální účinek A438079 na myších erytrocytů a low protein exprese P2X7 receptoru v myších erytrocytech (Obr. 3F a 3G).

tyto výsledky naznačují, že na hemolýze vyvolané hlya v myších erytrocytech je zapojen alespoň jeden další receptor P2. Protože P2X1 a P2X7 sdílejí podobné profily inhibitorů pro BBG, kn-62 a OxATP (24), Testovali jsme antagonisty P2X1 MRS2159 a NF449. MRS2159 v závislosti na koncentraci inhibuje hemolýzu v erytrocytech koní (EC50: 150 µM)a myší (EC50: ≈250 µM). Lidské erytrocyty byly relativně necitlivé na antagonisty, ale při koncentraci nad 250 µM jsme pozorovali malé a statisticky významné snížení (obr. 4A). Tento účinek byl mnohem výraznější, pokud byl použit vyčištěný HlyA (obr. 4C). To znamená, že mohou existovat rozdíly v buněčné odpovědi, pokud jde o to, zda jsou vystaveny HlyA v čisté formě nebo v kombinaci s jinými složkami E. coli. NF449 v závislosti na koncentraci inhibuje hemolýzu indukovanou HlyA u člověka (obr. 4B). NF449 byl mnohem méně účinný v myších erytrocytech v souladu s tím, že myší P2X1 receptor byl relativní rezistentní na tento inhibitor (25). Je třeba zdůraznit, že i když NF449 je derivát suraminu, nevyvolával stejné objemové změny v erytrocytech jako suramin. Immunoblots na P2X1 receptor je známo, ukáže až 4 kapely v různých tkáních; 45 kDa neglykosylovaný, 60 kDa glykosylovaný a 95/120 kDa kapela, která by mohla být polymerované formě receptoru (26, 27). V našich rukou P2X1 receptoru protilátky uznal 45 KD kapela a velmi slabé 60 kDa kapela skvrny z plazmatické membrány z myších a lidských erytrocytů (Obr. 4D). Zajímavé je, že jsme zjistili, že úroveň exprese 60 kDa pásmo bylo mnohem vyšší u myší P2X7−/− ve srovnání s kontrolami (podobné ve třech přípravcích, obr. 4D). V tomto immunoblot proteinu úrovně jsou upraveny tak, aby se zabránilo přetížení kapel z P2X7−/− myší, což ponechává 60 kDa kapela téměř nezjistitelné v P2X7+/+ myší. Tato zjevná up-regulace receptoru P2X1 může potenciálně zakrývat hemolytický fenotyp u myší s deficitem receptoru P2X7. Dohromady tato data podporují hypotézu, že receptor P2X1 i P2X7 jsou relevantní pro hemolýzu indukovanou HlyA. Naše výsledky ukazují na významné mezidruhové variace, ve kterých je receptor P2X7 důležitější pro hemolýzu v lidských erytrocytech.

Hlya indukované hemolýze je zabráněno antagonisty Pannexinu 1.

Karbenoxolon (28), meflochin a probenecid (30) byly použity jako antagonisté s relativní selektivitou pro pannexin1. Karbenoxolon významně snížil hladinu hemolýzy u všech tří druhů s podobnou citlivostí (obr. 5A). Účinek karbenoxolonu byl znovu testován pro celé rozmezí koncentrací HlyA(purifikovaný toxin, obr. 5B), rovněž vykazující značné účinky při maximálních koncentracích HlyA. Meflochin a probenecid byly testovány pouze na myších a humánních erytrocytech. EC50 pro meflochin byl 25 µM u lidí a 18 µM u myších erytrocytů. Probenecid inhiboval hemolýzu v lidských erytrocytech s EC50 2 mM, ale byl méně účinný u myších erytocytů. Nedávno bylo prokázáno, že známé antagonisty Cl-kanálu NPPB a kyselina niflumová inhibují také pannexinové kanály (31). Obě látky snížily hemolýzu indukovanou HlyA s podstatně výraznějším účinkem na lidské erytrocyty (obr. S5).