Actomyosin kontraktility váhy s myoblast tažnost a zvyšuje diferenciace prostřednictvím YAP jaderný exportní

Myoblastů přijmout protáhlý tvar rozlišovat a regulovat jejich aktinová síť k šíření oblast

posoudit vztah mezi buňce tvar, aktinová síť a fokální adheze, jsme kultivované C2C12 myoblastů na homogenní vrstvu fibronektin (FN). Po 24 hodinách v kultuře byly myoblasty fixovány a obarveny na aktin, aby se určily jejich morfologické parametry (obr. 1A). Substráty potažené FN umožnily vytvoření specifických interakcí buňka-substrát náborem specifických transmembránových integrinů. Opravdu, několik integrin α podjednotky, které se kombinují s β1 podjednotky jsou exprimovány během kosterní myogenesis, je pro nás důležité, myogenní buňky, migrace, myoblast syntézy svalových vláken zrání nebo v udržování svalové integrity32,33. Další experimenty prováděny na lamininu(LAM)-potažené substráty uvedeno, že morfologické parametry (tvar buňky index, buňka obvod a oblast buněk, Doplňující Obr. 1A) a interakce buňka-substrát (počet a oblast fokálních adhezí, Doplňkový obr. 1B) byly statisticky podobné na FN a LAM, validující FN povlak pro studium in vitro morfologií myoblastů C2C12 během procesu fúze/diferenciace.

Jsme kvantifikované tvaru buňky index (CSI), která se vyznačuje morfologie myoblastů tím, že informace na buněčné prodloužení. Zaoblené buňky mají CSI Blízko 1, zatímco podlouhlé buňky mají CSI blízko 0. Našli jsme CSI v rozmezí od 0,1 do 0,8 se střední hodnotou 0.37 ± 0,15 (n = 101), což naznačuje velkou variabilitu morfologií buněk (obr. 1B). Myoblasty vykazovaly střední obvod 259 ± 82 µm (obr. 1C, n = 101 ) a široký rozsah rozmetacích ploch (od ~1000 do ~4000 µm2), se střední hodnotou 2057 ± 618 µm2 (obr. 1D, n = 101). Tyto poznatky získané na C2C12 myoblastů byla posílena provedením dalších morfologických měření (CSI, buňka obvod a oblast buněk) na primárních lidských myoblastů (16UBic, Doplňující Obr. 2A), které pocházejí z bicepsu pacienta neovlivněného FSHD (tj. u kterých bylo potvrzeno, že chybí odstranění 4qA). Jak je znázorněno na doplňkovém obr. 2B–D, naše výsledky ukazují, že ČŠI z 16UBic myoblastů v rozmezí od 0,14 do 0.86, s průměrnou hodnotou 0,44 ± 0.17 (n = 90), což naznačuje, že velká variabilita morfologie buněk lidských myoblastů, jak bylo pozorováno u C2C12 buněk. Společně naše výsledky ukazují, že variabilita buněčných morfologií nezávisí na typu buňky nebo na artefaktu buněčné kultury.

dále Jsme studovali distribuci aktinová filamenta v populaci C2C12 myoblastů pro pochopení, zda variabilita šíření oblastech může modulovat aktin cytoskeletu. Naše zjištění ukázala, že celková intenzita fluorescence sítě F-aktinu byla lineárně spojena s buněčnou oblastí (obr. 1E, n = 31, R2 = 0,748), což naznačuje, že čím větší je šíření myoblastů, tím více se tvoří aktinová vlákna. Jak je znázorněno na doplňkovém obr. 3, dále jsme se vyznačuje distribuce vinculin-obsažené srůsty určit, jak změny tvaru buňky ovlivnit buňka-substrát interakce v C2C12 myoblastů. Zjistili jsme, že celková plocha adhezí buněk a substrátů na buňku se zvyšovala s plochou buněk (obr. 1F, n = 31, R2 = 0,783) a s intenzitou fluorescence F-aktinu (obr. 1G). Naše výsledky ukazují, že myoblasty C2C12 předpokládají různé tvary buněk a rozšiřující se oblasti, ale zase přizpůsobují množství aktinových vláken a vinkulinových adhezí jejich šíření. Chcete získat větší vhled do role tvaru buňky pro myoblast diferenciace, dále jsme zvážit, evoluce buňky, poměr stran během proliferace (P0 v 6 hodin a P2 na 48 hodin) a diferenciace (D2 na 96 hodin) fázích (Obr. 1H). Jak je znázorněno na obr. 1I,J., naše zjištění ukazují, že myoblastů zvýšil jejich poměr od 0.40 ± 0.16 (P0) na 0,36 ± 0.09 (P2) a 0,24 ± 0.07 (D2), což naznačuje, že myoblastů prodlužují výrazně a přijmout poměrem 1:4 na rozlišení. Kromě toho naše výsledky ukázaly, že aktinová stresová vlákna byla vysoce orientována na D2 (Doplňkový obr. 4A, B), odpovídající také významným jaderným prodloužením (Doplňkový obr. 4C). Společně naše zjištění ukazují, že síť F-aktinu je modulována modifikacemi morfologie myoblastů a naznačují, že diferenciace myoblastů vyžadovala buněčné prodloužení až do poměru stran 1: 4.

prostorové organizaci aktinové sítě a jádro je v režii myoblast tvarosloví

Jsme kontrolovali vnitřní variabilita v myoblast morfologií pomocí lepicí micropatterns standardizovat jejich šíření oblastech a kontrolu jejich tvary. Použitím technologie mikrokontaktního tisku20 jsme vytvořili adhezivní mikropattery fibronektinu (FN) s konstantní plochou 1600 µm2 a různými geometriemi. Použili jsme zaoblené (CSI = 1), čtvercové (CSI = 0.79), trojúhelníkové (CSI = 0.60) a různé poměry stran pravoúhlé (CSI = 0.50 a 0.34 pro 1: 4 a 1:7 poměry stran, respektive) FN mikropattery ke kultivaci jednotlivých myoblastů (obr. 2A). Tyto různé geometrie mikropatternů umožnily standardizovat in vitro tvar myoblastů v širokém rozsahu a řídit jejich oblast šíření.

kvantitativně určit, do role buňky geometrie na prostorové organizaci aktin cytoskeletu, zjistili jsme, orientace aktinová filamenta pro každou buňku shape34,35. Aktinová filamenta potřísněné phalloidin byly barevně odlišeny v závislosti na jejich orientaci s barevný gradient v rozmezí od světle modré při aktinová filamenta jsou organizována paralelně (0°) od vodorovné osy a červené (+90°) nebo oranžová (-90°) pro ty, organizované kolmo k vodorovné ose (Obr. 2B). Pozorovali jsme, že aktinová vlákna v zaoblených buňkách byla distribuována náhodně, s orientací v rozmezí od -90° do + 90°. Čtvercové buňky vykazovaly aktinová vlákna uspořádaná ve třech hlavních úhlových doménách: 0° až 25°, 50° až 90 ° a -50° až -90°, zatímco trojúhelníkové buňky vykazovaly aktinová vlákna hlavně uspořádaná podle tří stran vzoru při 0°, 60° a -60°. Zajímavé je, že jsme zjistili, že aktinová vlákna byla vysoce orientována rovnoběžně s osou dlouhé buňky (0°) pro obdélníkové buňky o poměru stran 1:4 (CSI = 0,50) a 1:7 (CSI = 0,34). Kvantifikace adhezí obsahujících vinkulin nenaznačovala žádné statistické rozdíly adhezních oblastí mezi morfologiemi buněk (Doplňkový obr. 5A-C–, zatímco orientace fokálních adhezí byla modulována tvarem buňky (Doplňkový obr. 5D, E), jak bylo pozorováno u aktinových vláken. Naše zjištění ukazují, že jak pravoúhlé myoblasty 1:4, tak 1:7 umožňují silnější organizaci aktinového cytoskeletu (obr. 2C) a fokální adheze, což naznačuje, že prodloužení myoblastu vede k tvorbě kontraktilních dipólů.

vzhledem k roli buněčného jádra v diferenciaci myoblastů v myotubách jsme dále zkoumali, zda změny tvaru buňky a architektury cytoskeletu mohou modulovat tvar a orientaci jádra36. Zjistili jsme, že poměr jaderných stran se výrazně zvýšil se snížením CSI (obr. 2D). Opravdu, zaoblené buňky (CSI = 1) na kruhové micropatterns ukázal zaoblené jádro vyznačuje tím, průměrný poměr stran 1.11 ± 0.06, vzhledem k tomu, obdélníkové buňky s poměrem stran 1:4 (CSI = 0.50) a 1:7 (CSI = 0.34) vykazoval velké jaderné deformace s poměrem stran 1,39 ± 0.21 a 2,19 ± 0.23, resp. Také jsme si všimli, že orientace jádra byla modulována morfologií buněk (obr. 2E). Zjistili jsme, že orientace jádra v zaoblené, hranaté a trojúhelníkové buňky rozložené v širokém rozsahu úhlů (od ~15° ~60°), s průměrnou orientace ~40° (kruhové, n = 11), ~33° (čtverec, n = 14) a ~43° (trojúhelník, n = 10) vzhledem k horizontální ose. Pro obdélníkové buňky, naše výsledky ukázaly, že jádro je orientovaný rovnoběžně s mobilní osy s průměrem úhel ~14° (1:4, n = 15) a ~2° (1:7, n = 10).

prodloužení buněk zvyšuje kontraktilitu myoblastů

Další otázkou, kterou jsme řešili, bylo, jak změny tvaru buněk ovlivňují kontraktilitu myoblastů. K zodpovězení této otázky jsme použili mikroskopii trakční síly (TFM) k určení trakčních napětí vyvíjených mikropatterními myoblasty. Jak je znázorněno na obr. 3A Pozorovali jsme, že maximální napětí bylo vyvíjeno na koncích mikropatterovaných myoblastů, bez ohledu na tvar buňky. Jak bylo pozorováno dříve na jiné buňky types37, kontraktilní stres nahromaděné přednostně v rozích (čtverce a trojúhelníky) nebo na obou koncích (1:4 a 1:7 obdélníky) micropatterned myoblastů. Kvantifikovali jsme celkový stres vyvíjený jednotlivými mikropatterními myoblasty, abychom zjistili, zda morfologie buněk moduluje kontraktilitu buněk. Jak je znázorněno na obr. 3B, zaoblené buňky (CSI = 1) působí celkem stres 170.7 ± 46.4 N/m2, zatímco obdélníkové buňky (CSI = 0.34, poměr stran 1:7) vyvíjen větší celkové množství stresu (295.9 ± 156.8 N / m2), což naznačuje, že protáhlé tvary článků vedou ke zvýšenému trakčnímu namáhání. Dále jsme zjistili, že buňky obdélníkového tvaru (CSI = 0,34, poměr stran 1:7) vykazovaly větší maximální hodnotu napětí (684,3 ± 257,8 Pa, obr. 3C), zatímco zaoblené myoblasty vykazovaly nejnižší maximální hodnotu napětí (351,5 ± 123,6 Pa). Vzhledem k tomu, že kontraktilní zdůrazňuje, byli působící na buňky periferie a že snížení CSI vede ke zvýšené trakci zdůrazňuje, jsme vyneseny maximální hodnoty napětí jako funkce vzdálenosti od těžiště na konec buňky (Obr. 3D), což představuje 22.6 µm (CSI = 1), 28.28 µm (CSI = 0.79), 33.98 µm (CSI = 0.60), 41.23 µm (CSI = 0.50) a 53.45 µm (CSI = 0.34). Jak je znázorněno na obr. 3D, jsme zjistili, že maximální kontraktilní stresu zvýšené lineárně se vzdáleností od středu na konec buňky (R2 = 0.958, n = 65), což naznačuje, že protáhlou morfologii z myoblastů vyvinout větší trakcí síly.

aby bylo možné určit příspěvek actomyosin síť na zřízení kontraktilní síly v myoblastů, C2C12 byly buňky ošetřeny s G-aktin izolovat léčivo Latrunculin B (LatB) a s myosin II inhibitor Blebbistatin (Puchýřek). Imunostainované myoblasty s phalloidinem ukázaly, že buňky ošetřené LatB a Bleb vykazovaly difúzní aktinovou síť (obr. 3E), což dokazuje, že obě léky významně ovlivnily organizaci F-aktinu. Použili jsme TFM na micropatterned myoblastů léčeni léky k určení role actomyosin síť na zřízení kontraktilní síly v myoblastů různých geometrií. Naše zjištění naznačují, že léčba LatB vyvolala významnou ztrátu kontraktility, která se zvyšovala s prodloužením buněk. Opravdu, zaoblené buňky vykazovaly ztráta kontraktilní stres ~62%, vzhledem k tomu, že 1:4 a 1:7 obdélníkové buňky ošetřené LatB byly charakterizovány ztrátou kontraktilních stres ~88% a ~86%, respektive (Obr. 3F). Kromě toho jsme zjistili, že kontraktilní stres 1:4 obdélníkové buňky ošetřené Puchýřek byly charakterizovány ztrátou ~80% kontraktilní síly, které prokazují, že myosin II, molekulární motory jsou klíčovými hráči myoblast kontraktilní síly.

dohromady tyto výsledky naznačují, že kontraktilitu actomyosin síť je posílena v prodloužené myoblastů prostřednictvím vytvoření husté sítě paralelní actomyosin vlákna.

kontraktilita buněčných párů se zvýšila po jejich fúzi a zvýšila se na podlouhlých mikropaternách

abychom pochopili, jak morfologie myoblastů může ovlivnit kontraktilní vlastnosti myotub, uvažujeme minimální model dvou myoblastů. Nejprve jsme určili trakční síly vyvíjené buněčnými dublety při P1 (24 h v proliferačním médiu)pokovené na mikropaternách různých tvarů (Doplňkový obr. 6A). Nebyly zjištěny žádné statistické rozdíly kontraktilního napětí mezi širokým rozsahem CSI (Doplňkový obr. 6B), navzdory dobře definované orientaci aktinové sítě (Doplňkový obr. 6C) a jádra (Doplňkový obr. 6D, E)na 1:4 a 1: 7 obdélníkové mikropattery. Na základě tohoto pozorování jsme pak kvantifikované kontraktilní stres vyvíjený mobilní kabátce kultivovány na kruhové (CSI = 1) a obdélníkové (CSI = 0.50, 1:7 poměr stran) FN micropatterns během pěti dalších dní (D5, Obr. 1H) v diferenciačním médiu. Použili jsme MitoTracker Red CMXRos (ThermoFisher Scientific), živé mitochondriální barvení, aby se zajistilo, že myoblast kabátce byly zničeny (Obr. 4A) 38. Jak je znázorněno na obr. 4B,C, zjistili jsme, že celkové kontraktilní stresu byla mírně zvýšena v taveného mobilní dvojic pěstované na kruhové micropatterns (267 ± 64 Pa) ve srovnání s kruhovým unfused mobilní kabátce (157 ± 37 Pa), vzhledem k tomu, že jištěný prodloužený kabátce byly více než dvakrát více kontraktilních (543 ± 193 Pa), než unfused prodloužený kabátce (211 ± 73 Pa). Tyto výsledky naznačují, že buněčná kontraktilita se po fúzi buněk zvýšila a byla významně zvýšena pro prodloužené morfologie.

Actomyosin kontraktility podporuje myotube diferenciace

pak se zeptal, zda actomyosin kontraktilitu myoblastů by mohly ovlivnit myotube diferenciace. Myoblasty C2C12 byly kultivovány na substrátech potažených FN v proliferačním médiu po dobu 2 dnů (P2, obr. 1H) k dosažení buněčného soutoku. Potom se po dobu 30 minut přidaly buď LatB nebo Bleb a proliferační médium bylo nahrazeno médiem diferenciační kultury. Po 4 dnech v diferenciačním médiu (D4, obr. 1h), buňky C2C12 byly fixovány a obarveny na DNA a TroponinT, marker diferenciace (obr. 5). Hodnotili jsme vliv LatB a Puchýřek ošetření barvením alfa-actinin na kontrolu myotubes (CTRL) a myotubes léčeni Latrunculin B (+LatB) a blebbistatin (+Puchýřek). Jak je pozorováno na doplňkovém obr. 7, kontrolní myotubes představují typické pruhované vzory z-pásma, zatímco ošetření LatB a Bleb narušují pruhované vzory v myotubách. Kontrolní myotrubice (CTRL)byly charakterizovány středním poměrem stran 7,99 ± 3,38 (obr. 5A) a pozitivní Troponinová t Plocha 51,7 ± 5,6% (obr. 5B). Naše zjištění naznačují, že léčba LatB a Bleb snížila frakci Troponinové t oblasti na 44,9 ± 5,2% a 44,4 ± 5,1%. Kromě toho jsme zjistili, že fusion indexem byla statisticky nižší u LatB (27 ± 3%) a Blebb léčených (29 ± 3%) buněk než u kontrolních buněk (38 ± 5%), posílení role actomyosin kontraktility v myoblast diferenciace (Obr. 5C). Celkově tyto výsledky ukázaly, že kontraktilita myoblastů aktomyosinu podporuje diferenciaci myotub.

Myoblast prodloužení spouští YAP jaderný export, který je nezbytný pro diferenciaci myoblastů do myotubes

získat větší vhled do intracelulární mechanismy, které řídí myotube diferenciace, považujeme roli YAP o určení jeho lokalizace v cytoplazmě nebo jádro myoblastů, kde se váže na a aktivuje TEAD přepis factors39. Za tímto účelem jsme kvantifikovali poměr cytoplazmatické / jaderné YAP v mikropatterních myoblastech (obr. 6A a doplňkový obr. 8). Prodloužení buněk na 1:4 a 1: 7 obdélníkové mikropattery zvýšily poměr cytosolic / nukleární YAP (obr. 6B), což naznačuje, že prodloužení buněk spouští jaderný export YAP prostřednictvím jaderných tlakových sil vyvíjených sítí actomyosin40. Ověřit, zda lokalizace YAP buď v cytoplazmě nebo v jádře je spojena s konkrétní fází diferenciace procesu, jsme barevného YAP v C2C12 buněk po 24 h (P1) a 48 h (P2) šíření krok a na 96 h (D2) a 264 h (D9) rozlišení kroku (Obr. 6C a doplňkový obr. 9). Zajímavé je, že naše výsledky ukázaly, že cytoplazmatické/jaderné YAP poměr zvýšil z 0,37 ± 0.07 na P1 0,68 ± 0.06 v P2 a 0.67 ± 0.06 na D2 a pak klesl 0,42 ± 0.10 na D9 (Obr. 6D). Je zajímavé, že poměr cytoplazmatické / jaderné YAP na D9 se statisticky neliší od hodnot P1, což naznačuje, že poměr cytoplazmatické/jaderné YAP v diferencovaných myotubách je podobný poměru myoblastů. Pro ověření těchto výsledků, jsme sklizené myoblastů na šíření etapa P1 (24 h) a diferenciační fázi D2 (96 h) a jsme izolovali jejich cytoplazmatických a jaderných materiálů. Provedli jsme test proteinů kyseliny bicinchoninové (BCA)a proteiny obsažené v cytoplazmatických a jaderných extrakcích byly analyzovány elektroforézou (obr. 6E). Naše Western blot zjištění vyplynulo, že cytoplazmatické/jaderné YAP poměr se zvýšil z 0.62 ± 0.08 u P1, aby 0.87 ± 0.24 v D2 (Obr. 6F). Tato biochemická kvantifikace YAP prokázala významný jaderný export YAP v diferenciaci buněk C2C12 a posílila naše zjištění.

na Základě těchto výsledků jsme hodnotili roli YAP pomocí leptomycin B blokovat aktivní export z jádra přímo vazbou na exportin141. Opravdu, Alberto Elosegui-Artola a spolupracovníci nedávno ukázaly, že leptomycin B (LMB), mohou být použity efektivně studovat, jak kontraktilní síly vyvíjený cytoskeletu disk YAP jaderné translocation39. Ošetřením myoblastů C2C12 při P2 (48 h) S LMB jsme zjistili, že poměr cytoplazmatického a jaderného YAP byl významně nižší v buňkách léčených LMB při D2 (96 h, obr. 6G), což naznačuje, že YAP je koncentrován hlavně uvnitř jádra, když je inhibován jaderný export. Kromě toho naše zjištění ukázala, že index fúze na D4 buněk ošetřených LMB (obr. 6H) byl velmi nízký (3,8 ± 1.5%) ve srovnání s kontrolními buňkami (42,4 ± 9,1%), což dokazuje, že aktivní jaderný export je nutný pro diferenciaci C2C12.