Akční Mechanismy Du Huo Ji Sheng-Tang na Degradaci Chrupavky v Králičí Model Osteoartrózy

Abstrakt

Du Huo Ji Sheng-Tang (DHJST) je tradiční Čínské bylinné medicíny používá k léčbě osteoartrózy. V této studii byl zkoumán terapeutický účinek DHJST na degradaci chrupavky u králičího modelu osteoartrózy. V kolenních kloubech králíků byla provedena transekce předního zkříženého vazu (ACLT) k vyvolání experimentální osteoartrózy. Na konci šestého týdne bylo 30 králíků s ACLT rozděleno do šesti skupin, kontrolní skupiny, skupiny DHJST a skupiny Osaminethacinu (OSA), které byly sledovány další 4 týdny. Ostatní tři skupiny králíků s ACLT byly neléčené s DHJST nebo OSA, které byly obětovány, po 6 týdnech, a sloužil jako 6-ti týdenní časový bod kontroly. Výsledky ukázaly, že na konci šestého týdne po operaci došlo v kontrolní skupině K významně histologické degeneraci ve srovnání s normální skupinou. V kontrolní skupině, průměrné skóre pro histologické degenerace byly dále zvyšuje na 10. týden, a tam byl výrazně nižší průměrné skóre pro histologické degenerace v DHJST skupiny ve srovnání s kontrolní skupinou. Pro výzkum potenciálního mechanismu byla zjištěna úroveň exprese VEGF A HIF-1α. Exprese mRNA VEGF a mRNA HIF-1α jsou v normální skupině nízké, zatímco aktivity se v kontrolní skupině postupně zvyšují. Ve srovnání se skupinou stejného modelu časových bodů však aktivita VEGF A HIF-1α ve skupině DHJST významně poklesla. Závěrem lze říci, že DHJST má významný terapeutický účinek na králíky osteoartrózy a mechanismy jsou spojeny s inhibicí exprese VEGF A HIF-1α.

1. Úvod

osteoartróza (OA) je progresivní a oslabující onemocnění, které může trvat roky, než se klinicky projeví u postižených jedinců. Stárnutí chrupavky a senescence chondrocytů hrají důležitou roli v patogenezi a vývoji OA. Během vývoje OA dochází často k ohniskovému zvýšení buněčné smrti. Mnoho zpráv ukázalo, že senescence chondrocytů přispívá k riziku degenerace chrupavky snížením schopnosti chondrocytů udržovat a opravovat tkáň kloubní chrupavky . Protože to je se domníval, že každý chondrocytů je zodpovědný za udržování extracelulární matrix obklopující ji, a že matrix molekuly produkované v jedné oblasti tkáně mají velmi omezenou schopnost procházet tkáně, fokální úbytek životaschopných buněk by mohl být částečně zodpovědný za neschopnost tkání na opravu drobných poškození .

V současné době neexistuje lék na OA a dostupné léčby pouze zpomalují progresi onemocnění . Za posledních 20 let zaznamenala Tradiční čínská medicína (TCM) významný pokrok proti OA, například při zlepšování klinických nálezů pacientů, inhibici zánětlivé reakce a degeneraci chrupavky . In vivo a in vitro studie také ukázala, že čínské byliny vzorec je více komplexních opatření proti OA . Du Huo Ji Sheng-Tang, který je složen z Radix Angelicae Pubescentis, Herba Taxilli, Herba Taxilli, Radix Acanthopanacis Bidentatae, Herba Asari, Radix Gentianae Macrophyllae, Cortex Cinnamoni a Poria, byl široce používán pro léčbu OA. Může zlepšit klinické příznaky, funkci kolen a kvalitu života pacientů . Na základě našich znalostí o patogenezi OA v TCM jsme zkoumali účinek DHJST na prevenci degenerace OA chrupavky u králíků a pozorovali její mechanismy.

2. Metody

2.1. Materiály

slepá ulička kolorimetrický detekční systém apoptózy (TUNELŮV test) byl získán od společnosti Nanjing Jiancheng Biotech Company (Čína). Trizol total RNA extraction kit, DNA molecular marker, SYBR Premix EX TaqTM a Perfect Real Time kit byly zakoupeny od Invitrogen Co. (USA). Bylinky v DJST (složený z Radix Angelicae Pubescentis, Herba Taxilli, Herba Taxilli, Radix Acanthopanacis Bidentatae, Herba Asari, Radix Gentianae Macrophyllae, Cortex Cinnamoni a Poria, poskytované Shanghai Huayu Čínské Byliny Co. Ltd., Čína) byly akreditovány pharmacognosist podle standardních protokolů, připravil Shanghai Městská Nemocnice Tradiční Čínské Medicíny, komponenty byly smíchány v pořadí s poměrem 2 : 1 : 1 : 1 : 0.2 : 1 : 0.3 : 1 (suchá hmotnost), léky byly získány pomocí standardní metody podle Čínského Lékopisu (Čína Lékopisu a Výboru, 2000). Tyto surové drogy byly namočené v destilované vodě a vaří se po dobu 30 min dvakrát, a lék roztok byl filtrován přes pletivo, pak filtrátu byla soustředěna do 4 g mL−1 pomocí vakuového čerpadla a pak uloženy při teplotě -20°C až do použití. Osaminethacine (OSA), jedna tableta obsahuje indomethacinum 25 mg a aminoglukosa 75 mg (dodává Hebei Jizhong Pharmaceutical Co. Ltd., Čína), byl použit jako pozitivní kontrolní lék.

2.2. Králíci a Přípravu Tkáně

Čtyřicet-osm-měsíc-staré novozélandské bílé králíky byly dodány Experimentální Zvíře Středisko Čínské Akademie Věd. Třicet králíků podstoupilo jednostrannou transekci předního zkříženého vazu (ACLT) v celkové anestezii. Normální králíci nepodstoupili proceduru.

na konci šestého týdne bylo 30 králíků s ACLT rozděleno do šesti skupin, kontrolní skupiny, skupiny DHJST a skupiny OSA, které byly sledovány další 4 týdny. Ostatní tři skupiny králíků s ACLT byly neléčené s DHJST nebo OSA, které byly obětovány, po 6 týdnech, a sloužil jako 6-ti týdenní časový bod kontroly. Odvary byly podávány perorálně v dávce 0.923 g (kg−1·d−1) po dobu 4 týdnů, králíci v OSA skupině byly podávány OSA 0.09 g (kg−1·d−1) po dobu 4 týdnů, model kontrolní skupina a normální skupiny byly perorálně podávanými s stejný objem fyziologického roztoku.

králíci byli obětováni pro odběr vzorků. Protokol získal souhlas Výboru pro pokusy na zvířatech University Medical Center, Šanghaj, Čína. Králičí tibie byly odstraněny a kloubní chrupavka holenní kosti byla okamžitě uložena při -80°C. Na holenní kosti byly pečlivě pitval a vymazána z přilehlých svalů a ihned fixovat v 10% formalínu po dobu 24 hodin. Tibie byly následně odvápňuje dobu 4 týdnů při 100 g/L ethylendiamin ethylendiamintetraoctové kyseliny, promyty v PBS, dehydratované prostřednictvím řady ethanolu a vloženy do parafinu standardizovaným způsobem zajistit správnou orientaci. Řezy parafínové tkáně (7 µm) byly řezány standardizovaným způsobem. Sekce byly deparafinizovány pro histochemické analýzy.

2.3. Histologické hodnocení chrupavky

histologické hodnocení bylo provedeno na femorotibiálních kloubech králíků ve skupině DHJST, OSA a kontrolní skupině. Sekce byly obarveny Safraninem O-fast green. Tyto histologické úseky z každého místa byly hodnoceny pomocí modifikovaného systému klasifikace Mankin (Tabulka 1) dvěma nezávislými veterinárními patology certifikovanými na palubě.

2.4. TUNEL Assay

H2O2-indukované apoptózy byla detekována provedením terminálu deoxynucleotidedyl transferase-mediated dUTP nick end-labeling (TUNEL) testu pomocí Apo-DirectTM Kit (CalBiochem, San Diego, CA). TUNEL byl proveden podle pokynů výrobce. Krátce po pretreatments a působení H2O2, buňky byly sklizeny, promyty, pevné, permeabilized a označeny pro DNA zlomů, pak analyzovány na Coulter Epics Elite průtokovým cytometrem (Beckman-Coulter, Miami, USA). Všechny testy byly provedeny ve třech vyhotoveních.

2.5. Fluorescenční Kvantitativní PCR

Celková RNA byla extrahována z 50 mg chrupavky v holenní kosti kloubní pomocí Trizol reagent. Syntéza cDNA byla provedena pomocí 4 µg celkové RNA na vzorek s náhodnými primery a reagencie obsažené v Vrátí První Pomoc Strand cDNA synthesis kit. Dva mikrolitry (2 µL) každého vzorku byly použity pro PCR v reálném čase v systému Rotor-Gen 2000 (Austrálie). Relativní kvantifikace byla vypočtena pomocí prahové hodnoty delta cyklu () relativní kvantifikace. Práh cyklu () pro endogenní kontrolu CAPDH mRNA a cílové signály byly určeny, a relativní kvantifikaci RNA byla vypočítána pomocí srovnávací metody, kde

Sekvence primerů použitých pro vaskulární endoteliální růstový faktor (VEGF) jsou: 5′-TGCCCACCGAGGAGTTCA-3(vpřed) a 5′-GGCCCTGGTGAGGTTTGAT-3(reverzní) (výrobku délka: 75 bp).Sekvence primerů použitých pro hypoxií indukovatelných faktor-1α (HIF-1α): 5′-CAGTGCAAAAGACAGGTGGAAG-3(vpřed) a 5′-CCCTGTATGGTGGTGATGTTGT-3(reverzní) (výrobku délka: 107 bp).Sekvence primerů používaných pro GAPDH jsou: 5′ – CCGAGGGCCCACTAAAGG-3 (vpřed) a 5 ‚ – GCTGTTGAAGTCACAGGAGACAA-3 (vzad) (délka produktu: 88 bp).

2.6. Statistická analýza

všechny výsledky byly vyjádřeny jako průměr a směrodatná odchylka (SD). Naměřená data byla analyzována pomocí jednosměrné analýzy odchylek (ANOVA, SPSS 11.0). Rank data byla analyzována s ridit. Výsledek p < .05 byl považován za statisticky významný.

3. Výsledky

3.1. Histologická degenerace vyvolaná ACLT u králíků byla snížena DHJST

reprezentativní histologické řezy jsou znázorněny na obrázku 1. Na konci 10. týdne jsme pozorovali normální integritu kloubního povrchu v normální skupině(Obrázek 1 (a)). V kontrolní skupině, se zvýšenou degenerací, tam byla ztráta Safranin O-rychlá zelené barvení doprovází rozštěp formaci, která je rozšířena do střední a hluboké zóny (Obrázek 1(b)), a v DHJST skupiny, tam byl prohrál s počátku mírné síní, a ztráta Safranin O-rychlá zelené barvení byl pozorován spolu s chondrocytů clustering (Obrázek 1(c)). OSA skupina, se ztrátou Safraninu O-rychlé zelené zbarvení tyto změny byly podobné skupině DHJST (Obrázek 1(d)). Na konci šestého týdne po operaci byly v kontrolní skupině významně histologické rozdíly ve srovnání s normální skupinou (P < .01). V kontrolní skupině, průměrné skóre pro Safranin O-rychlá zelené skvrny byly dále zvyšuje v 10. týdnu ve srovnání s, že v 6. týdnu (P < .01) (Obrázek 2 písm. a)). V 10 víkendu, existují výrazné rozdíly v Mankin skóre mezi kontrolní skupinou a DHJST skupiny, tam byla výrazně nižší průměrné skóre pro Safranin O-rychlá zelené barvení v DHJST skupiny ve srovnání s kontrolní skupinou (P < .01) (Obrázek 2(b)), a žádné statisticky významné rozdíly v Mankin skóre mezi DHJST skupiny a OSA skupině (P >.05).

(a)

(b)

(c)

(d)

(a)
(b)
(c)
(d)

Figure 1

Histological examination of cartilage (Safranin O-fast green staining, ×100).

(a)

(b)

(c)

(d)

(a)
(b)
(c)
(d)

Figure 2

The influence of DHJST on histological parameters and apoptotic of chondrocytes. Výsledky byly prezentovány jako prostředky ± SD (n = 5 na skupinu) v každém sloupci. *P < .01 versus kontrolní skupina osteoartrózy v 6. týdnu, * * P < .01, ve srovnání s těmi v kontrolní skupině osteoartrózy.

3.2. DHJST Inhibuje Buňky Chrupavky Apoptózy

Na konci šestého týdne po operaci, index apoptózy buněk v kontrolní skupině ve srovnání s, že v normální skupině byly výrazně rozdíly (P < .01). V kontrolní skupině, index apoptózy buněk byl ještě výrazně zvýšil (průměr ± SD 0.35 ± 0.13 v šestém týdnu 0,62 ± 0.10 v 10. týdnu, P < .01) (Obrázek 2 písm. c)). Na konci 10. týdne ve srovnání se skupinou DHJST se index buňky apoptózy v kontrolní skupině výrazně zvyšuje (p < .01) (Obrázek 2 písm. d)). Nebyly zjištěny žádné významné rozdíly v indexu buněk apoptózy mezi skupinou OSA a skupinou DHJST (p >.05).

3.3. Inhibice VEGF a HIF-1α Výraz v Buňky Chrupavky Jsou Spojeny s DHJST Vykazuje Terapeutický Účinek

Fluorescenční kvantitativní PCR je uvedeno, že exprese VEGF mRNA a HIF-1α mRNA jsou nízké v normální skupině, zatímco aktivity postupně zvyšovat, a výrazně v kontrolní skupině ve srovnání s normální skupinou (P < .01); V kontrolní skupině, HIF-1α v kloubních chondrocytů se začíná zvyšovat v šestém týdnu po operaci, dále se zvyšuje v 10. týdnu ve srovnání s tím, v šestém týdnu (průměr ± SD 94.21 ± 20.12 v šestém týdnu, a 160.35 ± 72.27 v 10. týdnu, P < .05) (Tabulka 2). V 10. víkend, exprese VEGF mRNA a HIF-1α mRNA v DHJST skupiny byla významně snížena ve srovnání s kontrolní skupinou po podání (P < .01). Ačkoli hladina mRNA VEGF a HIF-1α mRNA ve skupině OSA měla tendenci být snížena o 4 týdny léčby OSA ve srovnání s kontrolní skupinou, nebyl zjištěn žádný významný rozdíl (Tabulka 3).

4. Diskuse

model ACLT je jedním z nejpoužívanějších experimentálních modelů OA. Králík ACLT se stále častěji používá ve studiích OA, protože nástup onemocnění je rychlý. Použití experimentálních modelů ACLT má zvláštní klinický význam, protože prasknutí ACL se vyskytuje u lidí a také vede k rozvoji OA. Studie ukazuje, že velké množství apoptózy chondrocytů existuje během progresivního stadia OA u králíků vyvolaných chirurgickým zákrokem. Chondrocytová apoptóza je jednou z charakteristických změn chrupavky OA. Patologická apoptóza pod podmínkou škodlivé stimulace by mohla vést k uvolnění chemotaxe nebo zánětlivé faktory, což zhoršuje chrupavky zranění a aktivuje bolest . Proto inhibice apoptózy chondrocytů může být důležitou strategií proti degenerativním změnám v kolenních kloubech králíků. Apoptóza chondrocytů index v DHJST skupiny výrazně snižuje ve srovnání s tím v modelu skupiny, což naznačuje, že inhibice apoptózy chondrocytů by mohl být jeden z důležitých mechanismů DHJST proti degenerativní změny.

předchozí studie prokázaly hypoxickou povahu mikroprostředí kloubních chondrocytů. Zajímavé je, že osteoartritické klouby vykazovaly další snížení hladiny kyslíku, role hypoxie během patogeneze OA . Nedávná studie popisuje, že v kloubních chondrocytů katabolické a hypoxického stresu jsou silné induktory transkripční faktor HIF-1, který je hlavním regulátorem buněčné adaptace na nízké hladiny kyslíku. HIF-1 má zásadní význam pro přežití a růst zatčení chondrocyty chrupavky během vývoje, stejně jako energie a matice syntézu chondrocytů ve zdravé, stejně jako osteoartrózou chrupavky. V osteoartritické chrupavce jsou hladiny bílkovin HIF-1 významně zvýšeny a jeho aktivita koreluje se závažností degenerativních změn chrupavky . Tato práce dokumentuje význam transkripčního faktoru HIF-1α pro udržení integrity hypoxické kloubní chrupavky. Nadbytečné hladiny HIF-1α se shodovaly se zvýšenou apoptózou kloubních chondrocytů a vedly k degenerativním změnám v kolenních kloubech králíků. Po podání DHJST se exprese HIF-1α ve srovnání s modelovou skupinou snižuje. Výsledky ukazují, že působení DHJST na regulační funkci chondrocytů může být inhibicí aktivity HIF-1α.

je zajímavé, že rozdílnost exprese VEGF A HIF-1α mezi skupinou DHJST a skupinou OSA je po podání významná. Několik studií prokázalo, že některé nesteroidní protizánětlivé léky, jako je indomethacin, protože protizánětlivé účinky nezávislé na HIF-1α činnost, protože indometacin nepodařilo inhibují fosfatidylinositol 3-kinázy nebo extracelulární signálem regulované kinázy/mitogen-aktivované protein kinázy dráhy, stejně jako Erk činnosti . Naproti tomu indomethacin je schopen aktivovat receptor-γ aktivovaný peroxisomovým proliferátorem, který není citlivý na salicylát sodný nebo aspirin. Inhibice fosfatidylinositol-3-kinázy nebo dráhy Erk souvisí s inhibicí HIF-1α a angiogenních faktorů .

hypoxie a různé růstové faktory / cytokiny zvyšují expresi VEGF . VEGF je nejen jedním z nejdůležitějších angiogeneze faktory, ale je zapojen také v zánětlivých procesů v OA a přispívají k příznaky, jako je bolest a otok zaměřením synoviální membrány , chronické zánětlivé reakce jsou často spojeny s produkcí angiogenních faktorů, které vyvolat vaskulární proliferaci, a u revmatoidní artritidy VEGF je vysoce exprimován v synoviální buňky . Od mechanického přetížení je jedním z příčinných faktorů pro OA, studovali jsme jeho účinek na VEGF výraz králičí chrupavek, že exprese VEGF se snižuje po podání DHJST, výsledek ukazuje, že DHJST může chránit kloubní chrupavky prostřednictvím potlačení exprese VEGF v chondrocyty (Obrázek 3).

Obrázek 3

Hypotetické ochranné mechanismy DHJST na degradaci chrupavky.

5. Závěry

Až do teď, bioaktivních složek v DHJST je neznámý, ale naše studie ukazuje, že DHJST vykazuje významný léčebný účinek na OA u králíků, a to prostřednictvím mechanismů inhibice apoptózy chondrocytů, a reguluje expresi VEGF, HIF-1α v chondrocyty. To poskytuje vědecké důkazy pro kliniku pro použití DHJST při léčbě OA.

financování

přírodovědná nadace Šanghaje (číslo grantu: 08JC1418800).