Duální blokáda CD47 a HER2 eliminuje radiosenzitivní buňky rakoviny prsu

Buněčné linie

Lidské rakoviny prsu MCF-7, MDA-MB-231, BT474, BT549, SKBR3 buněčných linií glioblastomu U251, a rakovina tlustého střeva HCT116 buněčné linie byly zakoupeny z ATCC. MCF-7, MDA-MB-231, BT474, BT549, a U251 buňky byly udržovány v DMEM médium doplněno 10% FBS, a SKBR3 buňky udržovány v RPMI-1640 médiu s 10% FBS. Hct116 buňky byly udržovány v Mccoyově 5a médiu s 10% FBS. Na radiosenzitivní MCF7/C6 a MDA-MB-231/C5 buněčné linie, které byly klonovány z dochovaných zlomků MCF7 a MDA-MB-231 buněk po opakovaném ozařování; HER2-prsu se zvýšenou expresí nádorových kmenových buněk (HER2+/CD44+/CD24−/low BCSCs) byly izolovány z MCF7/C626. Myší triple-negativní karcinom prsu 4T1 buňky byly udržovány v médiu DMEM s 10% FBS. Lidských monocytů THP-1 byly kultivovány v ATCC-formuloval RPMI-1640 médium doplněno 10% FBS, 15 mM HEPES, 4,5 g/l glukózy, a 2-merkaptoethanolu do konečné koncentrace 0,05 mM. Myš Mφ RAW 264.7 buněk bylo kultivováno v médiu DMEM s 10% FBS po kultivační metodě ATCC. Všechny buněčné linie byly testovány negativní kontaminace mykoplazmy pomocí Mycosensor PCR Assay kit (Agilent Technologies, Katalog # 302108).

Plazmidy a činidla

CD47 promotorem-řízené luciferase vektor byl postaven klonování lidských CD47 promotorové oblasti (-1554 nt) do pGL2-základní plasmidu z KpnI/Hind III stránek. Delece domnělých vazebných míst NF-kB (TGGAAGCT-764-757)byla provedena pomocí soupravy rychlé mutace (Stratagene, La Jolla, CA). Použité primerové sekvence: 5 ′-GTGGTCGGGTACCTGCCCGCTCGCCCCTCGCGGGCTCTGCG-3′ (sense) and 5 ′-CGCAGAGCCCGCGAGGGGCGAGCGGGCAGGTACCCGACCAC-3′ (antisense).

pGL2-NF-κB-luc plasmid was constructed with the 3 NF-κB-binding sites: GTGGGTTCCC, TCGCCACTCCCC, and TGGAAAGTCCCC by blunt-end ligation. IMD-0354 (Catalog # I3159) and TNF-α (Catalog # T0157) were purchased from Sigma. The lentiCRISPR v2 vector was purchased from the Addgene plasmid repository (Catalog # 52961). Herceptin was obtained from the UC Davis Comprehensive Cancer Center Pharmacy as left-over medicine (Genentech, NDC 50242-132-01). Lapatinib (Katalog # S1028) byl zakoupen od Selleckchem. Anti-CD47 (B6H12) protilátka pro IHC, ICC a western blot byla zakoupena od Santa Cruz (Katalog # sc-12730). Anti-CD47-FITC pro průtokovou cytometrii byl zakoupen od BD Biosciences (Katalog # 556045). Protilátka proti lidskému CD47 (B6H12) pro test fagocytózy byla extrahována z hybridomu B6H12. 2 (ATCC® HB-9771™). Protilátka proti myším CD47 pro inhibici nádoru in vivo byla extrahována z hybridomu MIAP301 poskytnutého Dr. Williamem Frazierem (Washington University School of Medicine). Anti-CD11b protilátka pro barvení IHC byla zakoupena od Invitrogen (Katalog # MA5-17857). Myší monoklonální anti-α-tubulinová protilátka pro western blot byla zakoupena od Sigma-Aldrich (Katalog # T6074). Myší monoklonální anti-β-aktinová protilátka pro western blot byla zakoupena od Sigma-Aldrich (Katalog # A5441). Anti-HER2 / ERBB2 (Katalog # 29D8) protilátka pro barvení IHC a western blot byla zakoupena od technologie buněčné signalizace (Katalog # 2165). Anti-HER2-APC protilátka pro analýzu průtokové cytometrie byla zakoupena od BD Biosciences (Katalog # 340554).

Imunoblotingu

Proteiny z buněk, nebo nádorových tkání byly získány v RIPA lyzačního pufru (Pierce), doplněné proteázy a fosfatáza inhibitor cocktail (buněčná Signalizace). Koncentrace proteinu byla stanovena pomocí testu BCA (Pierce). Lyzáty byly následně denaturovány a vzorky obsahující 30 µg proteinů byly podrobeny elektroforéza v 10% SDS-poly-akrylamidu gel, následuje transfer do polyvinylidene difluoride membrány (Bio-Rad). Po blokování 5% netučného suchého mléka byla membrána vystavena primární protilátce a inkubována při 4 °C přes noc. Skvrny byly vizualizovány značení s HRP-spolu sekundární protilátky (Sigma-Aldrich) a inkubace s Amersham ECL western blotting detection reagent (Katalog # RPN2106). Bloty byly vyvinuty na vývojáři Konica SRX101A a kvantifikovány pomocí ImageJ.

průtoková cytometrie analýzy

Shromážděné buňky byly opláchnuty PBS s obsahem 0,5% BSA v PBS a buněčné pelety byly inkubovány s fluorescenční značené primární protilátky při 37 °C po dobu 30 min, následuje mytí třikrát s 0,5% BSA/PBS. Všechny protilátky byly titrovány pro optimalizaci stavu před aplikací na experiment. Průtoková cytometrie analýza byla provedena pomocí FACS Canto II cytometrem (BD) a následná analýza byla provedena pomocí FlowJo (Tree Star, Ashland, OR, USA) software. Strategie bránění byly založeny na vlastnostech FSC a SSC a byly nastaveny pro pozitivní buněčné populace v kanálech FITC, APC.

Lidské rakoviny prsu tkání

Čerstvé mražené HER2 pozitivní a negativní rakoviny prsu tkání byly poskytnuty UC Davis Komplexní onkologické Centrum Biorepository (IRB # 283665, a IRB # 218204) financovaný UC Davis Komplexní onkologické Centrum Podpory Grantu (CCSG) vydaný National Cancer Institute (NCI P30CA093373) se všechny informace o pacientovi blokovány, s výjimkou diagnostických výsledků. Další lidské rakoviny prsu, patologických vzorků, včetně neposkvrněný 4-µm-silné oddíly z formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) spárované rakoviny prsu primární a recidivující rakoviny prsu byly získány z oddělení patologie, Ohio State University s výzkumnými IRB schválení (#2002H0089).

imunohistochemie (IHC)

imunohistochemické barvení bylo provedeno na tkáňových sekcích FFPE o tloušťce 4 µm. Krátce, snímky byly deparaffinized a zvlhčena, a antigeny byly získány za 40 minut v citrátovém pufru (pH 6.1) na 95 °C. Aktivita endogenní peroxidázy byla blokována 3% roztokem H2O2. Inkubace primární protilátky byla provedena při 4 °C přes noc, následovaná sadou VECTASTAIN ABC (Vector Laboratories) při RT po dobu 30 minut podle pokynů výrobce. Reakční produkty byly detekovány pomocí Peroxidázy Substrátu Kit a kontrastním hematoxylinem (Vector Laboratories). Dva starší patologové měli na starosti diagnostiku klinického karcinomu prsu a hodnocení experimentálních nádorů. Exprese CD47 byla hodnocena za použití intenzity barvení i procenta obarvených buněk. Intenzita barvení byla hodnocena jako 0: negativní; 1: slabá; 2: střední; 3: silná. Vysoká exprese byla definována jako silná intenzita barvení ve více než 25% nádorových buněk; střední exprese byla střední intenzita barvení ve více než 25% nádorových buněk; nízká exprese byla slabé intenzity barvení ve více než 25% nádorových buněk nebo mírné barvení v <25% nádorových buněk pomocí ASCO CAP guidelines63 byla použita pro výklad HER2 imunohistochemie (IHC) a HER2 exprese proteinů byla hodnocena jako negativní IHC 0 (žádné barvení nebo membránové barvení, které je neúplné a je slabé/stěží rozeznatelné a během ≤10% invazivních nádorových buněk) nebo negativní IHC 1+ (neúplné membránové barvení, které je slabé/stěží rozeznatelné a do >10% invazivních nádorových buněk); nejednoznačný výsledek IHC 2+ (obvodové membránové barvení, které je neúplné a/nebo slabý/mírný a do >10% invazivních nádorových buněk; a nebo kompletní a obvodové membránové barvení, které je intenzivní a v rámci ≤10% invazivních nádorových buněk); Pozitivní IHC 3+ (obvodové membránové barvení, že je kompletní, intenzivní ve více než 10% invazivních nádorových buněk). Pokud byly výsledky nejednoznačné (2+), reflexní testování bylo provedeno pomocí in situ hybridizace (ISH). V detekci exprese CD47 in vivo ozáření nádorů, léčených myší nádory byly odstraněny a stanoveny ve 4% paraformaldehydu v PBS po dobu 24 h. Vzorky byly dehydrovány série ethanolu (70%, 95% a 100%) pro 48 h před vložené do parafínu řešení (Polysciences).

Imunocytochemie (ICC)

Buňky byly nasazeny na kolo coverslips a vzrostl na 60-80% soutoku, následuje opláchnutí PBS, kterým se v 4% paraformaldehydu (pH 7.2), a permeabilization s 0,1% Triton X-100 v PBS. Buňky byly poté inkubovány v blokujícím roztoku po dobu 15 minut před inkubací s primární protilátkou přes noc při 4 °C s ředěním 1:250. Buňky byly inkubovány sekundárními protilátkami konjugovanými TR nebo FITC zředěnými 1: 1000 v blokujícím roztoku po dobu 1 hodiny při pokojové teplotě ve tmě a analyzovány konfokální mikroskopií.

identifikace antigenních proteinů asociovaných s zářením

myš C57/B6 byla použita jako imunizační hostitel s buňkami 5 × 106 MCF7/C6 v 0.1 ml objem injekčně u kořene ocasu nebo tlapky za myš, následuje posílení se stejným objemem buněk na 14. den. V 5.–7. den po druhé výzvě myši bylo utraceno a bylo odebráno sérum pro detekci antigenní molekuly vyjádřená v radiosenzitivní BC buněk. Za účelem odlišení Raap od nespecifických molekul exprimovaných v normálních epiteliálních buňkách prsu a buňkách divokého typu MCF7 byl proveden předběžný postup se surovým sérem následujícími kroky. Dva miliony lidských normálních prsních epiteliálních buněk MCF10A byly připraveny v roztoku obsahujícím 1 mm EDTA / PBS bez trypsinu, aby se zabránilo trávení některých citlivých proteinů, následované dvakrát opláchnutím PBS. Buňky byly peletovaného a pak povolte klepnutím na dně zkumavky následovalo přidání 1 ml mouse anti-sera a otočit na 4 °C po dobu 2 h. Směs byla poté centrifugována při 9391 × g po dobu 5 min při 4 °C a supernatant byly shromážděny, která byla jednou opakovat. První vyčištěné antisérum bylo dále vyčištěno inkubací s buňkami mcf7 divokého typu za použití stejných postupů a opakováno šestkrát. Poslední čištěná protilátka byla poté testována pomocí western blot proti proteinu lyzátu z MCF10A buněk MCF7 buněk MCF7/C6 a RD-BCSC buňky, které byly seřazeny podle prsu kmenové buňky markery HER2+/CD44+/ CD24− stejně jako aldehyd dehydrogenázy (ALDH)64. CD47 a HER2 spolu s dalšími RAAPs v radiosenzitivní BC buňky byly identifikovány metodou western blot nebo immunoprecipitation membránové proteiny čistí od RD-BCSC buněk a eluované frakce byly analyzovány pomocí LC/MS. výsledná membrána RAAPs shlukli s řadou proteinů a proteinových funkčních kategorií.

CRISPR editace HER2 a CD47

sgRNAs byly navrženy následující instrukce publikované Dr. Zhang Laboratoře CRISPR design software (http://crispr.mit.edu) a protokol, který byl popsán v předchozí publication65. Byly navrženy čtyři Oligos odpovídající lidským sgrna byly syntetizovány a klonovány do vektoru lenticrispr v2 podle protokolu zesílení knihovny Zhang Lab Gecko. Aby se minimalizovala možnost nespecifického cílení, byly syntetizovány a testovány tři sgrna oligos každého cíleného genu. Pro následné experimenty byla vybrána sgRNA s nejlepší knockoutovou účinností určenou western blotting. Sekvence sgRNA byly použity pro lidské a myší buňky takto:

hHer2gRNA_F: CACCGCGGCACAGACAGTGCGCGTC

hHer2gRNA_R: AAACGACGCGCACTGT CTGTGCCGC

hCD47gRNA_F: CACCGTAAATATAGATCCGGTGGTA

hCD47gRNA_R: AAACTACCAC CGGATCTATATTTAC

mHer2gRNA_ F: CACCGTGATGGCCCTCGCCCCTCGG

mHer2gRNA_ R: AAACCCGAGGGGCGAGGGCCATCAC

mCD47gRNA_F: CACCGCCCTTGCATCGTCCGTAATG

mCD47gRNA_R: AAACCATTACGGACGATGCAAGGGC

The lentiviral particles were generated using 293T cells following the protocol from Addgene. For gene editing, the isolated BCSC sphere cells or MCF7/C6 cells were trypsinized into single cells and plated 1. 2.5 × 105 cells/0.5 ml per well in the 12-well plates. Po inkubaci po dobu 12 h, 1 ml obsahující virus, supernatant s 8 ng polybrene byl přidán do buňky následuje inkubace po dobu 6 h. Pak, 0,5 ml další pravidelné médium obsahující 10% tepelně inaktivovaného FBS byl přidán a dále kultivovány přes noc. Infekce médium bylo nahrazeno 2 ml čerstvého média s 10% FBS a kultivovány po dobu 72 h. Buňky byly pasážovány do 60 mm tkáňové kultury jídla a vybrané kultivace v 0,3 µg/ml Puromysin pro 1 týden a vyřazovací cílového genu byla ověřena pomocí imunoblotingu.

luciferázy

Buňky byly transfektovaly s pGL2-základní-CD47 nebo pGL2-základní-CD47-ΔNF-kB nebo pGL2-NF-kB luciferase novinářům, a luciferase aktivita byla měřena pomocí Luminometru (Promega, Madison, WI). Pro normalizaci reportér transfekci účinnosti, celkové bílkoviny koncentrace lyzáty byla měřena s BCA Protein Assay kit (Pierce, Rockford, IL), s BSA jako standardu.

Chromatin immunoprecipitation (Čip) test

Buňky jsou cross-spojeny s formaldehydem (1% konečné) na 10 min., promyje s ledovým PBS, a shromážděné v SDS lyzačního pufru (1% SDS, 10 mM EDTA, 50 mM Tris, pH 8. 1). Chromatin byl stříhaný podle ultrazvuku, pre-zúčtování s proteinem G konjugovaná agarózového korálky a inkubovány s anti-p65, anti-c-Rel, nebo normální IgG při 4 ° C přes noc. Po přidání proteinu G po dobu 2 h při teplotě 4 °C byl komplex promyt postupným způsobem promývacími pufry imunitního komplexu s nízkou a vysokou solí (0. 1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris-HCl pH 8.1 plus 150 mM NaCl pro nízkou sůl a 500 mM NaCl pro vysoké solné pufry) následované te pufrem (dvakrát). Interakce dna-transkripčního faktoru byla obrácena po přidání NaCl a inkubaci při 65 °C přes noc. Po rozštěpení Rnázy A a proteinázy K byly fragmenty DNA purifikovány extrakcí fenol / chloroform a srážením ethanolu. Dna byly purifikovány a použity pro PCR s primery specifickými pro oblast genového promotoru zahrnující místa vázající NF-kB. Primery CD47 byly:

5′-CGTGGACCAGGACACCTAGG-3′ (sense)

5′-AGGGAAGAGAACCGCATAGG-3′ (antisense)

The PCR amplification of the IκB promoter region (1134/902) was also included as positive. The primers for NF-κB-binding site in the IκB promoter were:

5′-TGTAGCACCCATTAGAAACACTTC-3′ (sense)

5′-TTCTTGTTCACTGACTTCCCAAT-3′ (antisense).

Preparation of anti-human and anti-mouse CD47 antibodies

Hybridoma for monoclonal mouse anti-human CD47 antibody (B6H12.2), IgG2b were obtained from ATCC. Monoklonální krysí anti-myší protilátka CD47 IgG2a (MIAP301) a hybridom byly získány od Dr. Williama Fraziera (Washington University School of Medicine). Obě buněčné linie hybridomu byly udržovány v prostředí IMDM s 20% FBS. Protilátky byly čištěny od hybridomu supernatantu pomocí proteinu G Pryskyřice z GenScript (Katalog # L00209) po výrobě standardních postupů. Vzorky byly pak dále koncentrovány 10-20krát pomocí Mikrosep odstředivých zařízení od společnosti Pall Life Sciences. Koncentrace purifikovaného IgG byly stanoveny měřením absorbance při OD280.

Fagocytóza test

Oba Lidských monocytů THP1 buněk a Myš Mφ RAW 264.7 buněk (ATCC TIB-71) byla zachována v 5% CO2 inkubátoru při 37 °C66 na přibližnou hustotu 1 × 106/ml. Asi 0,8 × 106 buněk / ml surových 264,5 buněk nebo 1 × 106 THP1 buněk bylo naočkováno na 6jamkovou destičku. Po 24 h inkubace RAW 264.7 buněk byly aktivovány tím, že zachází s 0,1 µg/ml lipopolysacharid (LPS) pro 24 h. Monocytů THP1 buňky byly diferenciace Phorbol 12-myristate 13-acetát (PMA) (40 nM) po dobu 48 h. Aktivované makrofágy byly obarveny s Dio na konečné součinnosti 40 nM ve středně dobu 20 minut s následným opláchnutím třikrát s médiem. Rakovinné buňky byly označeny 1 µM DDAO (5 mM zásobní roztok v DMSO skladovány při -20 °C) v PBS při 37 °C po dobu 15 minut a promyje se roztokem PBS obsahujícím 1% FBS. DDAO-označené cílové buňky (1 x 106) byly přidány do DIO-barevné Mφs a inkubovány v konečný objem 2 ml na 37 °C po dobu 2 h. Po inkubaci, Mφs a cílové buňky byly sklizeny třikrát EDTA-PBS umýt následuje 0.25% trypsinization. Fagocytóza byla posouzena na základě vyhodnocení dual-označené buňky (DIO+/DDAO+), což představuje pohlcených buněk rakoviny prsu tím, zralý Mφs, pomocí průtokové cytometrie. Pro analýzu byl použit software FlowJo.

Clonogenic přežití test

Clonogenic přežití assay byla provedena následující záření s nebo bez léčby (Lapatinib, 10 µM po dobu 72 h; anti-CD47 protilátek 10 µg/ml přes noc). Ošetřené buňky byly kultivovány po dobu 10-14 dnů a kolonie byly fixovány, obarveny coomassie modrou skvrnou. Kolonie obsahující více než 50 buněk byly počítány jako přežívající klony a normalizovány na účinnost pokovování každé falešné linie nádorových buněk.

Gap-filling rate test

Gap-filling kapacita byla měřena s 1 × 106 buněk pěstovaných v každé z 6-desky na 100% soutoku následuje 24 h mobilní hladovění. Poté byla mezera vytvořena oškrábáním misky diagonálně sterilní špičkou pipety. Buňky byly buď ponechány neošetřené nebo ošetřeny 10 µg / ml IgG nebo anti-CD47 protilátkou během trvání experimentu. Plnicí kapacita byla sledována po dobu 72 hodin a reprezentativní snímky byly pořízeny v den 0 (den škrábání) a den 3.

tvorba Tumorsphere

buňky byly prosety sítky 40 µm buněk (Katalog # 352340. Corning) a jednobuněčné suspenze byly naočkovány do Petriho misky s nízkým připojením 60 mm při hustotě 1000 buněk / ml. Buňky byly pěstovány v bazálním médiu mléčného epitelu bez séra (MEBM), doplněné o B27 (Katalog # 17504-044. Life Technology), 20 ng / ml EGF (Katalog # 4022-500. Bio-vision), 20 ng/ml basic-FGF (Katalog # 13256-029. Invitrogen) a 4 µg / ml heparinu ( Katalog # 80603-686 EMD MILLIPORE). Buňky byly kultivovány po dobu 10 dnů a nádory byly počítány pod světelnou mikroskopií.

Transwell invasion assay

alikvoty (0. 4 ml) Matrigelu (Katalog # 356231. Bd Biosciences) byly zředěny v povlakovém pufru: 0,01 M Tris (pH 8,0), 0,7% NaCl na konečnou koncentraci 200-300 µg / ml. Asi 100 µl byly vloženy do horní komory 24-transwell (Katalog # 3422. Costar) a inkubován při 37 °C pro gelování asi 1 h. Pečlivě odstraňte zbývající potahovací pufr z propustné podporu membránových bez narušení vrstvy, a pak přidat buňky (2.5 x 104/ml). Dolní komora byla naplněna 800 µl MEM média obsahujícího 5 µg/ml fibronektinu (Katalog # SC-29011. Santa Cruz). Transwell s různě ošetřenými buňkami byl inkubován po dobu 48 hodin a obarven diff-Quick Stain kit (Katalog # K7128. IMEB A.S.).

Příprava F (ab‘)2 fragmenty

CD47 F (ab‘)2 fragmenty byly vyrobeny Papain pryskyřice štěpení IgG pomocí F (ab‘)2 příprava kit (Katalog # 786272. G-Bioscience) podle doporučení výrobce a oznámeného postupu67. Následující papain trávení, Fab fragmentu byl oddělen od nestrávené IgG a Fc regionu s Proteinem Spin Kolony od Fab Fragmentace Sada Smyku GT-600 odsolování sloupů byly dodávány k zajištění počáteční protilátky vzorek, který má být optimální stav pro Fab fragmentace a čistí anti-mouse CD47 IgG byly shromážděny pro in vivo myš léčby nádoru.

Záření BC buňky s CRISPR-KO CD47 a/nebo HER2

Pro in vivo test inhibice nádoru účinnost záření s nedostatkem CD47 a HER2 status, 5 × 105 4T1/C2 buňky s CRISPR-knockout CD47 (CD47−/−), HER2 (HER2−/−) nebo dvojité (CD47−/−/HER2−/−) byly implantovány do mléčné tukové polštářky BALB/c (n = 6 v každé skupině). Růst nádoru byl hodnocen měřením objemu nádoru každé 2 dny počínaje 7. dnem, dokud objemy nádoru nedosáhly omezení. K posouzení radiosenzitivita nádorů s různým stav CD47 a HER2, místní nádor záření byl dodán s 5 Gy pro každý nádor na den 9 a růst nádoru byla měřena každý druhý den, dokud kontroly nádorů dosáhli maximální omezení.

RT myši BC s anti-CD47 a/nebo HER2 léčby

Pro in vivo testy inhibice nádoru s jedním CD47 protilátek v přítomnosti nebo absence radioterapii, anti-CD47 léčba následoval protokol o Willingham et al20 s některými úpravami. Osm týdnů staré imunitně Kompetentní (BALB/c) samice myší (Charles River Laboratories, Sacramento, USA) byly injikovány 1 × 105 buněk myší prsu 4T1 do 4.mléčné žlázy. Padesát mikrolitrů PBS obsahující 100 µg kontroly IgG nebo anti-CD47 F (ab‘) fragmenty byly injikovány do nádoru (1. den), nebo do nádorových tkání (15. den) a opakovat každý druhý den až do konce experimenty. Objemy nádorů byly sledovány každých 5 dní. Pro léčbu zářením, anti-CD47, nebo záření v kombinaci s anti-CD47, zvířata ložiska 4T1 nádory byly náhodně rozděleny do různých experimentálních skupin a kontrolní skupiny (5-10 myší na skupinu). Nádor místní záření začalo, když objem nádoru dosáhne 200 mm3 s JEDLE (5 Gy/den/nádor na čtyři frakce pomocí micro-beam IR zdroje; celková dávka = 20 Gy) v kombinaci s třikrát nádor injekce anti-CD47 F (ab‘). Radiosenzitivita in vivo ozářených nádorů s přítomností nebo nepřítomností anti-CD47 F (ab‘) byla hodnocena měřením objemu nádoru na konci experimentů. Zvířata byla utracena, když nádory byly ~1400 mm3 nebo když zvířata se zdálo být nepříjemné, i když byl nádor menší než 1400 mm3, aby v souladu s UCD IACUC předpisy pro použití obratlovců zvířat ve výzkumu. Protokol o použití a péči o zvířata v radioterapii in vivo byl schválen výborem pro institucionální použití a péči o zvířata University of California Davis (IACUC 15315).

Pro in vivo testy inhibice nádoru s duální protilátky proti CD47 a HER2 v přítomnosti nebo absence radioterapii, osm týdnů staré imunokompetentních (BALB/c) samice myší (Charles River Laboratories, Sacramento, USA) bylo aplikováno 1 × 105 myš prsu 4T1 buňky do 4. mléčné žlázy. Když objemy nádoru dosáhly přibližně 200 mm3, myši byly náhodně rozděleny do čtyř skupin (6 myší na skupinu). PBS, IgG, anti-CD47 F (ab‘) fragmenty (100 µg) nebo Herceptin (5 mg/kg) byly injikovány do nádorových tkání 4 hodiny před lokální radioterapií (5 Gy denně po dobu 2 dnů). Byly provedeny injekce a velikost nádoru byla sledována každý druhý den až do konce experimentů. Myši byly utraceno, když nádory byly ~1400 mm3 nebo když zvířata se zdálo být nepříjemné, i když byl nádor menší než 1400 mm3, aby v souladu s UCD IACUC předpisy pro použití obratlovců zvířat ve výzkumu. Protokol o použití a péči o zvířata v radioterapii in vivo byl schválen výborem pro institucionální použití a péči o zvířata University of California Davis (IACUC 15315).

Nádorem infiltrována makrofágy a makrofágů fagocytóza

ONZP-vyjádření myši prsu 4T1 buňky byly implantovány do 4 prsní tukové polštářky z BALB/c myší a léčba byla zahájena, když nádory dosaženo o 200 mm3 tím, že nádor injekce 50 µl PBS obsahující 100 µg kontroly IgG, anti-CD47 F (ab‘) fragmenty, Herceptin nebo obou protilátek každý druhý den na třikrát. Lokální RT nádoru byla dodána ve dnech 10 a 11 s 5 Gy / den / nádorem pro dvě frakce, celková dávka = 10 Gy a experimenty byly ukončeny 2 dny po ukončení léčby protilátkami. Nádory byly extrahovány a FFPE řezy byly připraveny pro imunofluorescenční barvení následovat standardní postup: snímky byly deparaffinized a zvlhčena, a antigeny byly získány za 40 minut v citrátovém pufru (pH 6.1) na 95 °C. K odstranění autofluorescence, skluzavky byli socked v de-autofluorescence roztoku (0,5 M CuSO4, 0,05 M NH4COOH v H2O) při RT po dobu 48 h, opláchnout vodou 5 min 3krát, pak blokovány s 1:100 koňského séra. Inkubace primární protilátky byla provedena při teplotě 4 °C přes noc: anti-GFP (1: 100; Dako), anti-CD11b (1: 100; Millipore); Po umytí, skluzavky byly inkubovány s 1:250 zředěný fluorescenční konjugované sekundární protilátky (Rhodamine pro CD11b, Alexa Fluor 488 pro ONZP) na RT pro 1 h a pak vystoupil s Vectashield Antifade roztok obsahující DAPI (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA). Fagocytóza zprostředkovaná makrofágy byla detekována fluorescenční mikroskopií pomocí softwaru Axiovision (Zeiss, Německo) a mikrofotografy byly kvantifikovány ImageJ.

Statistické analýzy

Všechny experimentální údaje získané z in vitro buněčných studií a testů na zvířatech jsou prezentovány jako průměr ± SE, analyzovány pomocí dvoustranný studentův t-test pro dvě skupiny nebo ANOVA pro více skupin. Statistická významnost Kaplan-Meierových křivek přežití byla hodnocena Mann-Whitneyovým testem. Počet nezávislých experimentů a repliky byly uvedeny na obrázku legends. P-hodnoty < 0.05 byly považovány za významné a jsou označeny hvězdičkou takto: *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.0001.

souhrn hlášení

Další informace o návrhu výzkumu jsou k dispozici v souhrnu zpráv o výzkumu přírody, který je spojen s tímto článkem.