Encephalitozoon cuniculi Kmen III Je Příčinou Encephalitozoonosis v Obou Lidé a Psi

Abstrakt

Microsporidia jsou obligátní intracelulární eukaryotické organismy, které se nacházejí v široké škále obratlovců a bezobratlých hostitelů. Encefalitozoon cuniculi se běžně vyskytuje u domácích králíků a hlodavců a vyskytuje se také u psů, jiných psů a primátů, včetně lidí. Sekvenování DNA pro ribozomální RNA geny byly použity k identifikaci těchto parazitů na úrovni druhu a definovat E. cuniculi kmenů I, II, a III. Osm nového psa izoláty byly charakterizovány jako E. cuniculi kmen III za použití molekulárních metod. Tento kmen byl také identifikován u izolátů od imunokompromitovaných lidí, což naznačuje zoonotický potenciál tohoto druhu parazita. Je také hlášeno prodloužené vylučování mikrosporidiálních spór od asymptomatických psů.

Encefalitozoon cuniculi je obligátní intracelulární prvok kmene Microspora a je běžným parazitem domácích králíků a hlodavců. Příležitostně byly tyto parazity hlášeny u jiných hostitelů, včetně psů, lišek modrých (Alopex lagopus) a malého počtu dalších divokých masožravců . Rostoucí počet hlášení také popisuje klinické onemocnění u lidí způsobené E. cuniculi, ale zdroj (y) lidské infekce není znám .

historicky byla identita parazitů založena na morfologických a někdy ultrastrukturálních charakteristikách. Nedávno, morfologicky podobné členy rodu Encefalitozoon byly speciovány použitím imunologických znaků a molekulární charakterizace genů ribozomální RNA . Izoláty E. cuniculi byly dále rozděleny jako kmenů I, II, nebo III na základě počtu opakování 4-základní sekvence (5′-GTTT-3′) na vnitřním přepsal spacer (ITS) region ribozomální RNA gen . Dva izoláty psa e. cuniculi byly označeny kmenem III na základě přítomnosti 4 sekvenčních opakování . Následně, ⩾4 lidské izoláty byly identifikovány jako kmen III (izoláty, „Donovan“ GenBank X98466, CDC:V282, a IPZ:MX-H5) a jako kmen jsem ve dvou zprávách z Evropy . Tato studie rozšiřuje, že práce, identifikace 8 další pes izolátů E. cuniculi od 4 ohnisek jako kmen III. I když žádné epidemiologické údaje přímo potvrdil, pes-k-lidský přenos, molekulární údaje naznačují, psi mohou sloužit jako potenciální rezervoáry parazitů. Kromě toho bylo zdokumentováno dlouhodobé vylučování spór asymptomatickými psy, což dále zvyšuje pravděpodobnost zoonotického přenosu parazita.

Materiály a Metody

Parazit izolátů

těla 7 mláďat od 3 nepříbuzných vrhů a 1 pes, byly předloženy více než 18 měsíců do Texasu Veterinárních Diagnostických Laboratoří pro postmortální vyšetření. Zvířata pocházela ze čtyř nesouvisejících zdrojů z různých oblastí Texasu. Diagnóza encefalitozoonózy byla provedena v každém případě na základě histologických nálezů. Osm parazit izolátů byly stanoveny z čerstvých tkání zvířat: 5 izolátů byly odvozeny z mozku nebo ledvin tkáně 5 – až 7-týden-staré Boston teriér štěně sourozenců (2 samci, 3 samice), která zemřela neurologických onemocnění (izoláty 1-5, 1 vrh). Izolát 6 byl odvozen z mozku 10týdenního maltézského teriéra, který byl 1 ze 4 vrhů (vrh 2), který zemřel na neurologické onemocnění. Izolát 7 byl odvozen z mozku 10týdenní samice miniaturního štěňátka pudla (vrh 3), které zemřelo na neurologické onemocnění. Izolát 8 byl odvozen z ledviny 18měsíční samice miniaturního jezevčíka, který zemřel na selhání ledvin (tabulka 1).

V posmrtně, tkání byly odebírány asepticky a homogenizované (Ten Broeck tkáňového homogenizátoru; Corning, Corning, NY) pomocí PBS, pH 7.2 plus 2× antibiotikum-antimykotický roztok (Gibco, Gaithersburg, MD). Mikrosporidiální spory byly čištěny z homogenátu hostitelské tkáně pomocí dříve popsané metody gradientu hustoty Perkollu modifikované změnou rychlosti odstředění na 600 g . Na microsporidia byly pěstovány v RK-13 buněk (ATCC CCL-37) pomocí RPMI 1640 médium doplněné 5% fetální bovinní sérum a 2× antibiotika-antimykotický roztok (Gibco), jak bylo dříve popsáno . Kultura parazitů a analýza DNA byly prováděny po dobu několika měsíců na základě přijetí různých vzorků případů, takže možnost náhodné křížové kontaminace byla zanedbatelná.

izolaci DNA

Pro izoláty 1 až 6 a 8, parazity byly pěstovány v krátkodobé kultuře generovat dostatečné výtrusy pro molekulární charakterizace. Pro izolát 7 byli paraziti přímo vyčištěni z čerstvé mozkové tkáně štěněte pro izolaci DNA. U většiny izolátů byla DNA extrahována z vyčištěných spór pomocí Instagenové matrice (BioRad, Hercules, CA) podle protokolu výrobce pro bakteriální kultury . Pro některé z molekulární práce s izoláty 6 a 8, spory byly zpracovány, jak již bylo dříve popsáno , a DNA byla extrahována z výtrusy standardní phenolchloroform metoda extrakce pomocí rozdělovací gel microfuge trubice systému (světlo phase Lock Gel systém; 5 Prime→3 Prime Výrobce, Westchester, PA) pro optimalizaci DNA. DNA byla etanolu vysráží, pelety byly resuspendovány v TE (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7.6) a koncentrace DNA byla odhadnuta pomocí A260 : A280 poměry UV spektrofotometrie (Ultraspec Plus; Pharmacia, Piscataway, NJ). DNA extrahované z tkáně kultury—odvozené spory Encephalitozoon hellem byl použit jako pozitivní kontrola, a činidla-pouze negativní kontrola byla zařazena ve všech extrakce a sekvenční reakce.

DNA částečné sekvenování a analýzy z malé podjednotky ribozomální DNA (SSU rRNA) gen

část 5′ konec SSU rRNA genu od každého z 8 izolátů byl amplifikován pomocí primeru pár PMP1 a PMP2, jak bylo popsáno dříve . Polymerázové řetězové reakce (PCR) reakce pro každý izolát byl proveden podle pokynů výrobce (GeneAmp PCR core činidla, N808-0009; Perkin-Elmer Cetus/Roche Molecular Systems, Branchburg, NJ). Zesílení bylo provedeno v tepelném cykleru (PTC-200 Peltier; MJ Research, Watertown, MA). Po počáteční denaturaci po dobu 5 minut při 95°C byla ke každé 25 µL reakci přidána Taq polymeráza (0,5 U). Vzorky pak podstoupil 35 cyklů denaturace (94°C, 30 s), žíhání (60°C, 30 s), a extenze (72°C, 1 min) a následně 10 min při 72°C konečné prodloužení. Neregistrované nukleotidy byly odstraněny pomocí chromatografických kolon (Micro Bio-Spin 30; BioRad). Vzorky byly drženy při 4°C, dokud nebyly zpracovány pro automatizované sekvenování.

DNA analýza JEHO regionu

část SVÉ oblasti ribozomální RNA gen každý izolát byl amplifikován pomocí PCR s int530f a int580r primer pair , pomocí amplifikačních metod popsaných výše. Výsledný produkt PCR byl sekvenován v automatizovaném sekvenceru DNA (model 377; Perkin-Elmer Applied Biosystems / Roche Molecular Systems, Branchburg).

DNA automatizované sekvenování

PCR amplifikované DNA pro každý izolát byl zesílen pro automatizované sekvence s komerční kit (ABI Prism Big Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit; Promega, Madison, WI) podle pokynů výrobce. Všechny reakce byly prováděny v termocykleru (MJ Research Minicycler). Vzorky pak podstoupil 35 cyklů denaturace (94°C, 30 s), žíhání (60°C, 30 s), a extenze (72°C, 1 min) a následně 10 min při 72°C konečné prodloužení. Přípona produkty byly čištěny pomocí chromatografické kolony (Micro Bio-Spin; BioRad), sušené ve vakuové centrifuze (Savant Nástrojů, Holbrook, NY), a skladovány při teplotě -20°C až sekvenovány v automatizované sekvencer (Perkin-Elmer 377 ABI Applied Biosystems).

Použitím alignmentového softwaru (Sequencher; genové kódy, Ann Arbor, MI) byly získány konsensuální sekvence ∼265 bází pro část genu SSU rRNA pro každý izolát parazita. Tyto sekvence byly hodnoceny pro homologii proti dříve hlášeným sekvencím Encefalitozoon v databázi NCBI GenBank pomocí jednoduchého vyhledávání BLASTN.

Double-stranded DNA heteroduplexní mobility test

izolovat DNA z 6 byl amplifikován pomocí PCR s primerem pár int530f a int580r jak bylo popsáno dříve . PCR-amplifikované produkty byly testovány pro generování heteroduplexů a homoduplexů pomocí dříve charakterizovaných izolátů e. cuniculi z různých hostitelů.

výsledky

v tkáňové kultuře bylo zjištěno celkem 8 izolátů parazitů ze 4 samostatných klinických ohnisek. Obě světla mikroskopické vlastnosti a in vitro růstové charakteristiky parazitů navrhl byli E. cuniculi, microsporidian dříve hlášeny u psů, jakož i dalších hostí. Částečné sekvenování 5′ konci každého izolátu je SSU rRNA genu (GenBank AF144246–AF144253) potvrdil parazitů identity jako E. cuniculi, protože všechny vzorky vykazovaly 100% homologie s dříve publikované sekvence (GenBank L39107dEZORGOA, L17072¦EZORGSMALL; X98470¦ECDSSRR2).

Heteroduplexní analýzu a sekvenování ITS oblasti ribozomální RNA gen dále charakterizovány všechny psí izolátů jako kmen III, což potvrzuje předchozí zprávy, že jemné rozdíly mezi E. cuniculi izolátů z různých hlodavců, králíků a lidských hostitelů. Obrázek 1 znázorňuje DNA použitím homoduplexní tvorbu mezi psí izolovat 6 a dříve charakterizuje kmen III izolovat stejně jako heteroduplexu mezi izolovat 6 a dalších. E. cuniculi kmenů.

Diskuse

biologický význam z více kmenů E. cuniculi musí být ještě objasněna; je však schopnost rozlišovat mezi parazit kmenů může poskytnout nástroj pro sledování zdrojů infekce v epidemiologických studiích. Naše molekulární údaje identifikující 8 microsporidian izoláty ze psů jako E. cuniculi kmen III se shodují s předchozí studie, která klasifikovány 2 pes izolátů jako kmen III . Izoláty králíků, myší a lišek byly hlášeny jako kmeny I nebo II . Tyto údaje naznačují, že kmen III může být převážně spojen se psy. Lidské izoláty byly identifikovány jako kmen III na západní polokouli a jako kmen I v Evropě . Ačkoli zdroj(y) expozice člověka e. cuniculi není znám, existuje stále více důkazů, že zvířata mohou sloužit jako rezervoáry infekce a existuje možnost zoonotického přenosu organismu mezi zvířaty a lidmi. To je zajímavá možnost, že geografické a kulturní rozdíly ve vlastnictví domácího mazlíčka může hrát roli v lidské expozice, protože psi jsou běžné domácí zvířata ve Spojených Státech, zatímco králíci jsou často drženi jako mazlíčci nebo jako potraviny ve Švýcarsku a dalších Evropských zemích.

Vyšetření stolice a moče z klinicky normální Boston teriér rodiče a 1 štěně z vrhu 1 vykazovaly nízké hladiny spore ubývání pro ⩾4 měsíce po úmrtí sourozenců (izoláty, 1-5; nepublikované údaje). Tato pozorování dále naznačuje možný mechanismus pro přímý nebo nepřímý přenos parazitů ze psů na člověka prostřednictvím kontaminace lokalizované prostředí s psí inkontinence a fekální výměšky. I když žádné epidemiologické studie hodnotila vztah mezi pet vlastnictví/expozice a lidské microsporidial infekce, v jednom případě, v němž byly děti vystaveny štěňata s zjevné encephalitozoonosis, 1 ze 3 dětí sérokonvertovalo . Další E. cuniculi izolátů z různých hostitelů musí být analyzovány dále zhodnotit riziko zachování potenciálně infikovaných domácích zvířat v domácnosti, osobám s oslabeným imunitním systémem vysoké riziko microsporidial infekcí.

Poděkování

děkujeme Texas Veterinární Lékařské Diagnostické Laboratoře patologů Jay Hoffman, Joanne Mansell, a Bruce Abbitt pro poskytování psí tkání pro tuto studii.