Definice
Fluorescenční značení je proces vazby fluorescenční barviva na funkční skupiny biomolekul obsažených v tak, že mohou být zobrazeny pomocí fluorescence imaging (nature.com). Dostupnost nových fluorophores se dramaticky změnil možnosti pro citlivou detekci biomolekul a analýzu jejich interakcí. Vylepšené fluorescenční barviva nyní umožňují dříve nemožné studie buněčných struktur a buněčných procesů. Fluorescentní etikety nabízejí mnoho výhod, jako jsou vysoce citlivé i při nízkých koncentracích, jsou stabilní po dlouhou dobu, a nejsou v rozporu s funkcí cílové molekuly. Cílené zobrazování značených buněk umožňuje jejich sledování in vitro a in vivo. Použití různých fluoroforů ve stejném vzorku může také umožnit současné pozorování několika molekul současně. Nejčastěji se používá fluorophores jsou Fluorescein Isothiokyanátem (FITC), deriváty rhodaminu (TRITC), kumarin a kyanová. Tato syntetická organická barviva se používají k označení biomolekul jako proteinů, peptidů, protilátek, nukleových kyselin, bakterií nebo kvasinek. Přirozeně se vyskytující fluorochromy, jako je zelený fluorescenční Protein (GFP), lze také použít k genetickému označení živých buněk.
- Fluorescenční protein značení
Fluorescenční značení umožňuje vědcům prozkoumat konformační dynamiku a molekulární interakce proteinů nebo sledovat jejich pohyb v zájmu lepšího pochopení jejich biologických funkcí (Modesti M, 2011). Chcete-li získat lepší vhled do vazebných receptorů-ligand, proteinových struktur a enzymové aktivity, mohou být také označeny jednotlivé peptidy. Fluorochrom značené protilátky jsou široce používány v biomedicínském výzkumu k detekci antigenů v imunofluorescenčních testech a jsou také nezbytnými nástroji v imunodiagnostice. Pro zajištění spolehlivých výsledků by konjugace fluoroforů neměla interferovat s charakteristikami protilátky vázající antigen (Nath N et al, 2016). - fluorescenční značení nukleových kyselin
fluorescenční testy hrají hlavní roli v biofyzikálních studiích struktury, funkce a dynamiky nukleových kyselin. Nedávné pokroky v označování metod a zobrazovacích systémů umožnily přímý in vivo pozorování DNA a RNA a jejich interakcí s další buněčné komponenty. Zobrazování nukleových kyselin v živých buňkách otevřelo nové cesty pro lepší pochopení organizace chromatinu a regulace genové exprese. (Dirks RW et al, 2018). - fluorescenční značení polysacharidů
komplexní polysacharidy, jako je heparin, jsou strukturní složky extracelulární matrice. Tyto polysacharidy jsou nezbytné pro buněčnou adhezi ,migraci a růst (Prigent-Richard S. et al, 1998). Některé sloučeniny jsou také známé pro své antikoagulační, antitrombotické, protizánětlivé, antivirové a antiangiogenní vlastnosti. Metody založené na fluorescenci usnadňují identifikaci nových bioaktivních polysacharidů a charakterizaci jejich biologických funkcí (Roger o et al, 2002). - Fluorescenční značení lipidů
Buněčné lipidy hrají klíčovou roli v buňce pro skladování energie, pro tvorbu buněčných membrán a pro intracelulární signální procesy (Maekawa M. a Fairn G, 2014). Lipofilní barvivo Nil červená se široce používá k barvení intracelulárních lipidů za účelem analýzy jejich umístění a organizace (Greenspan P et al, 1985). Navíc pro studium dynamiky lipidů je také možné specifické značení v živých buňkách (Schultz C et al, 2010).
Fluorescenční Značení Techniky
Běžně používané fluorescenční značení metody, použití chemických, enzymatických, peptid/protein tag a genetické označení techniky (Sahoo H, 2012 , Toseland CP, 2013).
- techniky chemického značení: Fluorofory dokují cílové molekuly chemickou modifikací (kovalentní nebo nekovalentní vazba). Metody chemického značení mají několik výhod, protože jsou robustní, snadno proveditelné a velmi účinné se širokou škálou fluoroforů. Jsou vhodnější pro studie in vitro spíše než in Vivo.
- Enzymatické značení techniky: Enzymatické reakce umožňují rychlé, vysoce účinné a selektivní značení in vivo a in vitro a mohou být použity k cílové proteiny nebo celé buňky. Vzhledem k velké velikosti štítků však může dojít k interferencím s funkcí cílových molekul.
- Peptid/protein tag: nově vyvinutý, a to velmi slibně, metoda umožňuje specifické a selektivní značení proteinů prostřednictvím začlenění krátké fluorescenční značky, které nenarušují skládací nebo funkci molekuly. Tato technika je také snadno proveditelná a může být použita ke zkoumání různých míst jednotlivých proteinů v závislosti na specificitě peptidové značky.
- Genetické označení: Genetické značení může být dosaženo pomocí proteinových domén, malé peptidy a jednotlivé aminokyseliny, které jsou označeny fluorescenční barviva a specificky vážou na místa podél chromozomů in vivo. Tento přístup umožňuje detekci chromozomálních abnormalit, jako jsou delece nebo duplikace.
- vícebarevné značení: Společným požadavkem pro zobrazování živých buněk a pro aplikace průtokové cytometrie je schopnost sledovat nebo detekovat více fluorescenčně značených proteinů současně. Pro tento účel lze použít speciálně navržená barviva s velmi velkým posunem Stokes, která umožňují současné sledování různých biochemických procesů.
fluorescenční testy
fluorescenční testy se spoléhají na schopnost fluoroforů znovu emitovat světlo po expozici světelným částicím nebo fotonům. Rozdíl v délce vlny mezi excitačním světlem a emisním světlem, tzv. stokesovým posunem, lze detekovat v mikroskopech a zobrazovacích systémech. Každý fluorofor má specifický Stokesův posun. Různé testy umožňují vědcům lokalizovat biomolekuly, pozorovat je v reálném čase, zkoumat jejich interakce a studovat enzymatické aktivity.
- Fluorescenční mikroskopie
Fluorescenční mikroskopie umožňuje identifikaci buněk a buněčných složek a monitorování buněčné fyziologie s vysokou specificitou. Fluorescenční mikroskopie odděluje emitované světlo od budicího světla pomocí optických filtrů. Použití dvou indikátorů také umožňuje současné pozorování různých biomolekul současně. Vzhledem k tomu, že konvenční zobrazovací systémy umožňují rozlišení 200 až 300 nm, vzhledem k fyzické difrakční limity, nové super-rozlišením fluorescence mikroskopy, jak ZAJISTIT (stimulated emission depletion) překonat tyto hranice a poskytnout vhled do nano světa molekul (Sanderson MJ et al, 2014). - průtoková cytometrie
průtoková cytometrie je široce používána v základním výzkumu a klinické praxi k měření signálu ze specifických fluoroforů. Buňky a částice jsou analyzovány a nakonec řazeny v „reálném čase“, jak se prochází světelný paprsek detektory, které kvantifikovat fluorescenci produkován značené protilátky nebo ligandy. Tyto markery se vážou na specifické molekuly na povrchu buňky nebo uvnitř buňky, což umožňuje jejich detekci a kvantifikaci. Na jednotlivých buňkách lze měřit několik parametrů jako velikost a objem a různé typy buněk lze izolovat a charakterizovat (Nolan JT a Condello D, 2013). Průtoková cytometrie nachází široké uplatnění v oborech jako imunologie, hematologie, transplantační medicína, onkologie a genetika. - Fluorescenční in situ hybridizace (FISH)
Fluorescenční in situ hybridizace (FISH) umožňuje lokalizaci konkrétních sekvencí DNA v chromozomech. Fluorescenční DNA nebo RNA sondy se používají k hybridizaci a identifikaci komplementárních cílových sekvencí DNA. Ryby se tradičně používají k mapování genů na chromozomech, například během projektu lidského genomu. Fluorescenční hybridizace in situ se dnes používá hlavně pro diagnostické účely při detekci chromozomálních abnormalit nebo při analýze rakovinných buněk (O ‚ Connor C, 2008). - Fluorescenční korelační spektroskopie (FCS)
Fluorescenční korelační spektroskopie (FCS) umožňuje analýzu časových změn ve fluorescenční intenzity fluorochromes, které jsou způsobeny chemickými, biologickými nebo fyzikálními vlivy. FCS byl poprvé představen zkoumat interakce mezi léky a DNA a nyní představuje citlivý nástroj pro stanovení koncentrace a úrovně agregace proteinů, stejně jako pro sledování molekulárních interakcí (Tian Y et al, 2011). - Microarrays
Microarrays umožňují studium genové exprese za různých podmínek. Tisíce genů mohou být zkoumány současně na čipech DNA. Jedná se o mikroskopické sklíčka potištěné malými skvrnami obsahujícími známé sekvence DNA, které se mohou selektivně vázat na fluorescenčně značené molekuly mRNA / cDNA. Po hybridizaci se načte DNA čip a data se použijí k vytvoření profilů genové exprese (Hoen PAC et al, 2003).
Fluorescenční Štítku: Live-Cell Imaging
kinetická pozorování buněčných procesů pomocí časosběrné fluorescenční mikroskopie se stala základní techniky v buněčné biologii, jako live-cell imaging může poskytnout velmi cenné poznatky do buněčný růst a dopravních mechanismů. Jednou z hlavních výzev v časosběrné mikroskopii je minimalizace fototoxických účinků vyplývajících z fotobleachingu. Expozice světla postupně ničí fluorescenční molekuly, což vede ke snížení fluorescenčního signálu ak tvorbě volných radikálů, které mohou buňky poškodit. Proto je pro metodu zobrazování živých buněk zásadní najít rovnováhu mezi co největším snížením expozice světla a získáním užitečných signálů pro pozorování buněk. Vědci také potřebují vytvořit fyziologické prostředí, které umožní úzce replikovat dynamiku in vivo. (Ettinger a Wittmann T, 2014).
Promocell fluorescenční značení
dostupnost nových fluoroforů dramaticky změnila možnosti citlivé detekce biomolekul a analýzy jejich interakcí. Vylepšené fluorescenční barviva nyní umožňují dříve nemožné studie buněčných struktur a buněčných procesů. PromoCell poskytuje širokou škálu vysoce kvalitních fluoroforů pro fluorescenční značení různých biomolekul: značení proteinů, značení protilátek, značení nukleových kyselin (značení DNA, značení RNA), jakož i kompletní etiketovací soupravy a fluorescenční konjugáty připravené k použití.
naše barviva PromoFluor jsou nákladově efektivní alternativy k dobře známým vedoucím fluoroforům a pokrývají vlnové délky spektra od modré po daleko červenou. Vykazují vynikající fluorescence intenzita a fotostabilita, silné absorpce světla, vysoký fluorescenční kvantový výtěžek a dobrá rozpustnost ve vodě a mohou být použity pro fluorescenční mikroskopii, fluorescenční in situ hybridizace (FISH) fluorescenční korelační spektroskopie (FCS) a microarrays (bílkoviny, DNA). Některé z nich nabízejí extra velký Stokesův posun, což z nich dělá ideální pro barevné označování nebo průtoková cytometrie aplikací. Barviva PromoFluor jsou k dispozici např. jako NHS estery, maleimides a amino modifikované štítky připraven pro kovalentní spojku nebo jako konjugáty s biotin, phalloidin a deoxynukleotidů (dUTPs). Kromě toho poskytujeme také vysoce kvalitní Protein & sady pro označování protilátek s různými barvivy PromoFluor.