Hranic, v Farmakologie

Úvod

Membránové proteiny účasti v základní fyziologické události v každý biologický systém od bakterií až po člověka. >50% prodávaných léků cíl membránové proteiny, vzhledem k tomu, že farmakologické zaměření mnoha dalších membránových proteinů je považován za potenciálně prospěšné v mnoha biomedicínských aplikacích (Overington et al., 2006; Yıldırım et al., 2007; Arinaminpathy et al., 2009). Molekulární mechanismy, které jsou základem jejich funkce a regulace, však zůstávají z velké části neznámé kvůli nedostatku strukturálních informací. Zatímco membránové proteiny představují ~26% lidského proteomu, jejich struktury představují pouze ∼2% struktur v proteinové datové bance (Fagerberg et al ., 2010; Pandey et al., 2016). Několik překážek brání strukturálnímu zkoumání membránových proteinů a vyžaduje vývoj nejmodernějších technologií pro objasnění jejich molekulárních architektur (Pandey et al ., 2016; Masson a kol., 2017; Hagn et al., 2018; Ravula a Ramamoorthy, 2019; Redhair a kol., 2019). Hlavní překážky jsou, že jejich zvýšená exprese a purifikace a strukturální studie většina technik (např. rentgenové krystalografie) zůstávají omezené v mnoha případech. Tyto překážky následně brání racionálnímu vývoji kandidátů na léky zaměřených na membránové proteiny související s onemocněním (Vinothkumar a Henderson, 2010; Lounnas et al ., 2013; Marciano a kol., 2014).

sekundární transportéry jsou membránově vázané proteiny, které selektivně katalyzují pohyb špatně propustných rozpuštěných látek (např., ionty, neurotransmitery, léky) přes buněčnou membránu, podporující různé buněčné funkce ve zdraví a nemoci. Sekundární transportéry splňují střídající přístup paradigma, podle kterého je protein, ligand-vazebné kapsy stává alternativně přístupné na opačných stranách membrány přijetím dovnitř čelí (POKUD je) a vnější-čelí (Z) státy v posloupnosti (Jardetzky, 1966; Forrest et al., 2011). Nedávné objevy v oblasti strukturální biologie membránových proteinů za předpokladu, bohatství struktur membrány vázané transportéry v různých konformační státy (Drew a Boudker, 2016; Bai et al., 2017), poskytující vhled do jejich transportních a rozpuštěných rozpoznávacích mechanismů. Poskytují však statické snímky neodmyslitelně vícestupňového procesu (Seeger, 2018). Roste tedy potřeba vývoje nových přístupů ke zkoumání dynamiky membránových proteinů (Konermann et al ., 2011; Smith a kol., 2012; Sim et al., 2017; Mandala a kol., 2018; Burke, 2019). Patří sem kombinace simulací molekulární dynamiky (MD) (Roux et al., 2011; Zdravkovič a kol., 2012; Zhekova a kol., 2016; Zhekova a kol., 2017; Harpole a Delemotte, 2018) s pokročilými experimentálními technikami, včetně spektroskopických technik a single-particle kryogenní elektronové mikroskopie (Smith et al., 2012; Pandey a kol., 2016; Castell a kol., 2018; Hagn et al., 2018; Ravula a Ramamoorthy, 2019; Sun a Gennis, 2019).

hmotnostní spektrometrie s výměnou vodíku a deuteria (HDX-MS) získala v posledních letech pozornost pro studium dynamiky membránových proteinů, i když se po desetiletí používá k charakterizaci rozpustných proteinů (Konermann et al ., 2011; Vadas a kol., 2017). HDX-MS monitoruje časově závislou výměnu rozpouštědla D2O s páteřními amidovými vodíky proteinů za přirozených podmínek. Směnný kurz deuteria závisí na dostupnosti rozpouštědel, sekundární struktuře a strukturální tuhosti (Konermann et al ., 2011). Spolu s proteolytickým štěpením a separací peptidů umožňuje HDX-MS kvantifikaci směnných kurzů v krátkých proteinových segmentech až do rozlišení jednoho zbytku. Dvě hlavní výhody HDX-MS je, že malé množství bílkovin (< 0,1 mg) jsou potřebné pro analýzu a chemické bílkovin označení není nutné, aby se zabránilo nežádoucí strukturální odchylky. Zde shrnujeme nedávné pokroky a aplikace v používání HDX-MS pro studium strukturální dynamiky transportérů.

Vodík-Deuterium Exchange Hmotnostní Spektrometrie Principy

HDX-MS principy jsou stručně a kvalitativně popsané níže, aby diskusi o jeho využití pro studium transportéry. Pro hloubkové vysvětlení je k dispozici několik vynikajících recenzních článků (Konermann et al., 2011; Rand a kol., 2014; Engen a Wales, 2015; Masson a kol., 2017; Oganesyan a kol., 2018; Masson a kol., 2019; Redhair a kol., 2019).

V HDX experimenty, deuteriové výměny s labilní protein vodíky v době, způsobem závislým následující bílkovin rozpuštění v D2O pufru (Masson et al., 2017) (Obrázek 1). HDX-MS sleduje především výměnu páteř amidové vodíky od i) při neutrálním pH jsou vyměněny za sazby, které mohou být detekovány pomocí HDX-MS (sekundy až dny) a ii), jejich výměnu lze účinně rozloží (Marcsisin a Engen, 2010; Gallagher a Hudgens, 2016). Rychlost HDX závisí na několika parametrech. Amidové vodíky mohou vykazovat „uzavřeném stavu,“ vyplývající z účasti ve stabilních vodíkových vazeb v sekundárních struktur nebo z rozpouštědla nepřístupnost, což neumožňuje jejich výměnu s rozpouštědlem deuteria, nebo „otevřený stát“, kde proton abstrakce, rychlost-limitujícím krokem HDX, může dojít (Oganesyan et al., 2018). Kromě toho má reakce vnitřní chemickou rychlostní konstantu, která závisí na pH ,teplotě a zbytkovém prostředí (Oganesyan et al., 2018).

přechod mezi uzavřeným a otevřeným stavem nastává lokálními událostmi rozvíjení. V nativních podmínkách, ve kterých jsou proteiny dobře složeny, závisí rychlost HDX hlavně na rychlosti přechodu zpět do uzavřeného stavu (Weis et al ., 2006). Pokud unfolded protein regionu se vrací do zavřeném stavu tempem mnohem pomalejší než chemické kurzu, EX1 kinetika jsou pozorovány, což v korelaci deuteria příjmu v sousedních zbytků. Výsledkem jsou dvě populace: jedna s nízkým m / z a druhá s vysokým m / z, odrážející peptidy z proteinových molekul, které nebyly a které prošly výměnou. S časem se vysoká populace m / z stává výraznější na úkor nízké populace m / z. Kinetika EX1 je považována za vzácnou ve složených proteinech za nativních podmínek,ale může být indukována například přidáním denaturantů (Weis et al ., 2006; Oganesyan et al., 2018). Pokud se protein vrátí do uzavřeného stavu rychlostí mnohem rychleji než chemický směnný kurz, pozoruje se kinetika EX2. Tady, výměny závisí na přechodu jednotlivých reziduí mezi otevřené a uzavřené státu, vyskytující se v nekorelované módy. S časem je tedy pozorována jediná populace s postupně se zvyšujícími hodnotami m / z (Weis et al ., 2006).

Následující deuteration, reakce je ukončena v předem stanovených časových bodů změnou pH z neutrální (7) na pHmin (2.5–3), což v ~10,000-násobné snížení HDX (Konermann et al., 2011; Masson a kol., 2017; Oganesyan a kol., 2018); a snížením teploty z 25 na 0°C, což vede k ~14-násobné snížení HDX (Englander, 2006; Oganesyan et al., 2018). Dále se protein štěpí pomocí proteázy a peptidy se oddělí analytickou reverzní fázovou chromatografií. V současné době hlavní technické překážky experimentů HDX-MS spočívá v získání vysokého pokrytí sekvencí, které je omezeno rezistencí na trávicí enzymy a proteolytickými podmínkami. Nakonec se eluované peptidy identifikují pomocí MS a stupeň HDX se vypočítá na základě získaných hodnot m / z. Experimentální detaily a úskalí trávení bílkovin, separace peptidů a identifikace MS jsou nad rámec tohoto přehledu (Konermann et al ., 2011; Masson a kol., 2017; Masson a kol., 2019).

studie hmotnostní spektrometrie výměny vodíku a deuteria membránových proteinů

navzdory sdílení paradigmatu střídavého přístupu se konformační změny vyvolané ligandem liší mezi transportéry kvůli rozdílům v interakcích ligand-protein. Například, symporters (ko-transport dvou nebo více ligandů), může přechod mezi POKUD a státy, aniž vázány ligandy, vzhledem k tomu, že ligand vazba je povinná pro přepínání mezi POKUD a státy v antiporters (výměna ligandů na opačných stranách membrány) (Forrest et al., 2011; Drew a Boudker, 2016; Bai a kol., 2017).

obecně je detekce lokálních ligandem indukovaných dynamických změn proteinů obtížná. Například krystalové struktury membránových proteinů v obou ligand-zdarma a ligand-vázané formy jsou často k dispozici, brání detekci ligandem indukované konformační změny i pro proteiny se známou strukturou. Navíc strukturální snímky stavů vázaných na apo a ligand s vysokým rozlišením nemusí vyřešit významné konformační rozdíly. Nicméně, malé ligandem indukované konformační změny mohou být detekovány pomocí HDX-MS se na konkrétní protein, subdomény za nativních podmínek měřením diferenciální deuteria příjmu (ΔHDX) v přítomnosti a nepřítomnosti ligandy. Tato schopnost HDX-MS poskytuje jedinečné příležitosti pro řešení nejnáročnějších problémů v objasnění mechanismů ligand-protein a protein-protein interakce (Rand et al., 2014; Masson a kol., 2019; Redhair a kol., 2019), jak je zde přezkoumáno pro řadu nedávno studovaných transportních proteinů.

Konformační Přechody Hlubších Střídající Přístup: Na+/H+ Antiporter

Nha proteiny regulují buněčné pH, a objem celé království života (Padáň a Landau, 2016). Hlavní strukturální model použit ke studiu Nha orthologs je Escherichia coli NhaA, pro které krystalografické struktury neaktivním stavu v kyselém pH je k dispozici (Hunte et al., 2005). Ke studiu strukturální dynamiky NhaA pod fyziologickým pH byl nedávno použit HDX-MS (Eisinger et al., 2017). Zásadní poznatky získané v této studii, HDX-MS poskytuje globální dynamická data, na rozdíl od metod založených na site-specifické označení, které pouze detekují pohyby předem definovaných bílkovin regionů.

V této studii, výjimečně vysokou sekvenční pokrytí 88,5% byla získána pro NhaA v saponátu, poskytuje vhled do mechanismu hlubších střídající přístup na ligand vazba. Porovnáním HDX vzory mezi apo – a substrát-vázané Nha, opakující se vzor HDX změna byla pozorována v několika spirál, kde se zvýšila deuteria příjmu v jeden terminus byl doprovázen snížil deuteria příjmu na druhém konci. Příjem ve středu helixů byl do značné míry nezměněn.

na Základě pozorovaného HDX změnit, i když to není přímo poskytovat prostorové informace, to bylo navrhl, že překlad transmembránové šroubovice vzhledem k membráně dochází, jak se odráží ve vzájemném HDX změny pozorované pro dva termini v rámci specifické transmembránové šroubovice. Tento model je v souladu s „výtahu-jako“ mechanismus střídavého přístup, což znamená, vertikální překlad transmembránové šroubovice během přepravy cyklu (Ryan a Vandenberg, 2016). Stručně řečeno, HDX-MS poskytl nový pohled na strukturální přechody zapojené do střídavého přístupu, nedosažitelné dříve vyřešenými strukturami neaktivní NhaA.

Účinky Protein-Lipidové Interakce s Transportéry‘ Konformaci Krajiny

Většina sekundární transportéry patří do hlavní prostředník nadčeleď (MFS), sdílení zachovaná architektura i přes jejich různé funkce (Radestock a Forrest, 2011). Ačkoli krystalové struktury členů MFS jsou k dispozici, poskytly jen málo informací o interakcích protein-lipid a jejich vlivu na rovnováhu mezi stavy OF A IF. Martens et al. v kombinaci MD simulace s HDX-MS studovat účinky lipidů prostředí na tři dobře charakterizovány transportéry: laktóza permeáza, xylózy transportér, a glycerol-3-fosfát-antiporter (Martens et al., 2018).

nejprve byla v extracelulárním vestibulu všech transportérů zavedena mutace, o které je známo, že posunuje rovnováhu směrem ke stavu OF (Kumar et al., 2014). Porovnání WT a mutovaných transportérů pomocí HDX-MS ukázalo, že metoda detekuje konformační změnu, přičemž oblasti na extracelulárním vestibulu zabírají více deuteria v mutantech vs. WT, zatímco opak se vyskytuje u reziduí v intracelulárním vestibulu. Dále byly transportéry rekonstituovány na nanodisky složené z fosfatidylglycerolu, tetraoleylového kardiolipinu a buď fosfatidylcholinu nebo fosfatidylethanolaminu. Je zajímavé, že přítomnost fosfatidylethanolaminu posunula rovnováhu směrem ke stavu IF. Následně, MD simulace transportéry v lipidové dvojvrstvy totožný s nanodisks složení předpokládané přímé interakce mezi nabitou fosfatidylethanolaminu headgroup a zachovaných cytoplazmatickou síť nabitých zbytků, stabilizace státu (Doki et al., 2013). Mutace nabitých zbytků zrušila účinek fosfatidylethanolaminu, což silně naznačuje, že specifické interakce fosfatidylethanolaminu a proteinu řídí vnitřní rovnováhu transportérů. Tato studie je ukázkovým příkladem kombinace experimentálních a výpočetních metod za účelem identifikace jemných, ale funkčně významných interakcí protein-lipid.

Helix Odvíjení Během Přepravy: Studie LeuT

LeuT je prokaryotické homolog neurotransmiter/Na+ symporters (NSS) rodiny, která zahrnuje významné lékové cíle, jako je serotonin, dopamin a noradrenalinu transportéry (Kristensen et al., 2011). LeuT byl rozsáhle studován, a jeho krystalografické struktury podél dopravních cyklu jsou k dispozici (Focke et al., 2013). Tyto struktury naznačují, že během střídavého přístupu jsou vyžadovány rozsáhlé strukturální přestavby (Krishnamurthy and Gouaux, 2012). Konformační Krajina umožňující přechod mezi státy IF a států však zůstává nepolapitelná a kontroverzní.

pro studium přechodu mezi různými stavy byl detergentem solubilizovaný LeuT zkoumán za podmínek, které upřednostňují stavy IF nebo (Merkle et al ., 2018). Překvapivě mnoho peptidů, hlavně na intracelulární straně transportéru, vykazovalo kinetiku EX1. To je poněkud neobvyklé ve složených proteinech za přirozených podmínek a považuje se za odraz dlouhodobého rozložení sekundárních strukturních prvků. Na základě prostorové distribuce peptidy vykazující EX1 kinetika, spolu s dostupnými krystalografické struktury bylo navrženo, že konkrétní šroubovice podstoupit částečnou odvíjení během střídající přístup a že tyto konformační změny také přispívají k uvolnění substrátu. Tato studie zdůrazňuje funkční význam pomalu (několik sekund časové měřítko) konformační změny, které mohou být dobře vyřešen pomocí HDX-MS, na rozdíl od jiných experimentální nebo výpočetní (např., MD) metody.

Vodík-Deuterium Exchange Hmotnostní Spektrometrie Membránových Proteinů v Lipidové Nanodisks

interakcí membránových proteinů s okolními lipidy může výrazně modulují jejich funkci (Vadas et al., 2017). Aktivita eukaryotických členů NSS skutečně významně závisí na specifických interakcích lipid-protein, které modulují dynamiku bílkovin a následně interakce substrátu (Divito a Amara, 2009). Proto Adhikary et al. studoval LeuT rekonstituovaný do fosfolipidových dvouvrstvých nanodisků (Adhikary et al ., 2017). Pomocí tohoto přístupu byl LeuT zkoumán za podmínek, které upřednostňují if a konformací. Srovnání HDX vzory mezi těmito státy odhalil určité změny v regionech, dříve zapletený v dopravním cyklu, což odráží funkčně významné strukturální změny. Je zajímavé, že data HDX-MS, v souladu s předchozími biofyzikálními a výpočetními studiemi, podporovala menší úhel náklonu pro první transmembránovou šroubovice v konformaci IF ve srovnání s tím pozorovaným v krystalových strukturách. Tento rozdíl byl přičítán lipidovému prostředí, protože krystalová struktura byla získána v detergentu s minimálním množstvím lipidu. Abychom to shrnuli, HDX-MS poskytuje flexibilní platformu pro studium membránových proteinů v různých hydrofobní prostředí a za podmínek, které upřednostňují konkrétní konformační států, bez nutnosti site-specifické označení.

Iontové Interakce S Více Místech: Na+/Ca2+ Výměník

NCX se podílí na buněčné Ca2+ homeostázy vytlačováním Ca2+ z buňky proti jeho elektrochemický gradient (Blaustein a Lederer, 1999). NCX výměny 3Na+: 1Ca2+, kde Na + a Ca2+ jsou přepravovány v samostatných krocích (Khananshvili, 1990). Překvapivě, krystalová struktura NCX od Methanocaldococcus jannaschii (NCX_Mj) odhalila čtyři ion vazebná místa, současně obsazeny tři ionty Na+, v místech, zvaný Svatý, Smid, Sext, a jeden Ca2+ iontů v místě zvané SCa (Liao et al., 2012). Od tohoto závazného režimu byl v rozporu s předchozí studií, MD simulace a iontový tok analýzy mutantů byly provedeny, což naznačuje, že Na+ ionty zabírají Svatý, SCa, a Sext, vzhledem k tomu, že Ca2+ zaujímá SCa (Marinelli et al., 2014; Giladi et al., 2016b; Giladi et al., 2017; van Dijk a kol., 2018). Ionty Na+ a Ca2+ jsou tedy vzájemně vylučujícím způsobem vázány podél transportního cyklu.

experimentálně stanovit úkol ion vazebná místa, jsme ve srovnání apo-stát s iontovou vazbou státy NCX_Mj pomocí HDX-MS (Giladi et al., 2016a; Giladi et al., 2017). Navzdory nízkému pokrytí sekvencí naše analýza zahrnovala 10 z 12 zbytků koordinujících ionty. Zjistili jsme na + – dependentní pokles absorpce deuteria u Sint, SCa a Sext, ale ne Smid, zatímco v přítomnosti Ca2+ byl pokles absorpce deuteria pozorován hlavně u SCa. To je v souladu s předpovědí učiněných MD simulace a mutační analýzy předpokládají okupace Smid tím, že molekuly vody, ale ne Na+ nebo Ca2+ v základním stavu (Marinelli et al., 2014; Giladi et al., 2016a; Giladi et al., 2017; van Dijk a kol., 2018). Zejména následné krystalografické studie potvrdily přiřazení našich vazebných míst (Liao et al ., 2016). HDX-MS tedy potvrdil režim vazby iontů navržený výpočetními a funkčními studiemi.

Iontová Selektivita Li+-Přepravu NCX Mutant

mitochondriálního Na+/Ca2+ výměníku (NCLX) vykazuje výjimečné iontové selektivity, výměnu Ca2+ buď Na+ nebo Li+, vzhledem k tomu, že NCXs nemají dopravu Li+ (Palty et al., 2010). Ačkoliv fyziologický význam této iontové selektivity však zaráží, je pozoruhodné, že 9 (z 12) iontově-koordinační reziduí v NCLX se liší od těch v NCXs a dalších členů Ca2+/kation antiporter nadčeleď. Pochopit, jak tyto rozdíly ovlivňují iontové vazby uznání a dopravy, jsme provedli struktury založené na výměně iontů-koordinační reziduí v NCX_Mj napodobit NCLX vazebná místa (Refaeli et al., 2016). Je pozoruhodné, že nově navržený konstrukt (nazývaný NCLX_Mj) zprostředkovává Na+ / Ca2+ a Li+ / Ca2+ se srovnatelnými hodnotami Km (Refaeli et al., 2016).

dále jsme se snažili zjistit, zda iontová vazebná místa v NCLX_Mj připomínají místa NCX_Mj (Giladi et al ., 2019). HDX-MS analýzy ion-indukované konformační změny ukázal, že SCa váže Na+, Li+, nebo Ca2+, vzhledem k tomu, že jeden nebo více dalších Na+/Li+ stránky NCLX_Mj jsou neslučitelné s původním Na+ weby (Sext a Sint) přiřazeny k NCX_Mj. Tyto výsledky naznačují, že NCLX_Mj může transportovat ionty pomocí elektroneutrální stechiometrie 2Na+: 1Ca2+ nebo 2Li+: 1Ca2+. V souladu s daty HDX-MS, upnutí napětí urychluje směnné kurzy na+ / Ca2+ v Proteolipozomech rekonstituovaných NCX_Mj (díky stechiometrii 3Na+:1Ca2+), zatímco nemá žádný znatelný vliv na směnné kurzy na+/Ca2+ nebo Li+/Ca2+ v NCLX_Mj (Giladi et al., 2019).

Naše studie prokázaly užitečnost HDX-MS při identifikaci a ověření vazebných míst v iontové transportéry, kde relativně malé rozdíly v ion-indukovaný ΔHDX signály poskytují důležité informace o iontové selektivity a konformační změny, ke které dochází při iontové vazby na odlišných místech. Tak, v kombinaci s MD simulace a X-ray krystalografie, HDX-MS je zvláště přitažlivé pro objasnění strukturní determinanty iontové selektivity a ion-indukované konformační změny v transportu iontů systémy zahrnující více iontů vazebných míst.

Závěry

v posledních desetiletích, strukturální biologie má nesmírně přispěl k našemu pochopení funkce membránových proteinů, především tím, že poskytuje statické snímky diskrétní státy ve vysokém rozlišení. Plně rozluštit, struktura-funkce, vztahy hlubších složitý proces solute dopravy, rostoucí počet experimentálních a výpočetních metod, které byly vyvinuty tak, aby překlenout propast mezi tyto statické snímky a určit základní konformační krajiny. HDX-MS je stále více používán ke studiu neporušené membrány proteiny pod různými blízkosti-nativní podmínky, poskytování nových příležitostí ke studiu membrána-protein interakcí, substrát uznání, a doprava související s konformační přechody. Budoucí vývoj v automatizaci a analýze dat může umožnit použití HDX-MS ve vysoké propustnosti, plně využívat jeho potenciální využití v základním výzkumu a biomedicínských aplikacích, jako je návrh léčiv.

autorské příspěvky

MG a DK přezkoumaly literaturu a napsaly rukopis.

financování

tato práce byla podpořena Israel Science Foundation (Grant #1351/18) (DK) a Israel Cancer Research Foundation (Grant #19202) (MG). Finanční podpora od ceny Shmuel Šalita DK je vděčně uznána.

střet zájmů

autoři prohlašují, že výzkum byl proveden bez jakýchkoli obchodních nebo finančních vztahů, které by mohly být vykládány jako potenciální střet zájmů.