Hranic, v Mikrobiologii

Host-Specifické Interakce Mezi Rhizobium a Rostlin Partnery

bakterie, která forma dusíku-stanovení symbióze s vikvovité rostliny, které patří do různých skupin α – a β-proteobacteria se souhrnně nazývají rhizobia (Chen et al., 2003; MacLean et al., 2007). Mnoho α-proteobakterií se zabývá dlouhodobými interakcemi s vyššími eukaryoty. Tyto interakce sahají od povrchové kolonizace přes fakultativní symbiotické vztahy až po povinný intracelulární patogen nebo endosymbiontový životní styl. Symbiotické genů potřebných pro uzlík formace, hostitelské buňky infekce a fixace dusíku byly získány laterální genový přenos, který je hlavním zdrojem genetické rozmanitosti rhizobia. Proto by rhizobie mohla být úzce spjata s patogeny (jako je Agrobacterium nebo Brucella)než navzájem. Rhizobie mívají velké genomy (až 10.5 Mbp), které jsou v rychle rostoucí rhizobii rozptýleny na více replikonech (MacLean et al ., 2007). Například, Sinorhizobium meliloti, endosymbiont Medicago druhů, má tri-rozešli genomu; 3.65 Mbp chromozomu a dva megaplasmids, pSymA a pSymB (1.35 a 1,68 Mbp), z nichž oba jsou nezbytné a nést většinu symbiotických genů. Mnoho kmenů s. meliloti však obsahuje další pomocné plazmidy střední velikosti, a proto genom s. meliloti může obsahovat až 9 000 genů (Barnett et al ., 2001; Capela a kol., 2001). V kontrastu k rhizobia, obligátní endosymbionts hmyzu obvykle mají silně snížena (160-450 Kb), genom, který zajišťuje jejich množení a kódy pro několik specifických biosyntetických drah včetně těch, uspokojující hostitele je třeba (Moran et al., 2008; cena a kol., 2011). Tyto neuvěřitelně redukované genomy jsou nicméně amplifikovány kompenzující snížený genom s obsahem polyploidní DNA.

partneři rostlin rhizobia patří do čeledi Leguminosae / Fabaceae. Symbióza fixující dusík se vyvinula v několika liniích, ale ne všechny luštěniny tvoří symbiózu. Dosud je známo 12 000 nodulovaných druhů luštěnin a každý má svůj vlastní Rhizobium partner(y). Symbióza je vyvolána hladem dusíku hostitelské rostliny, která si musí vybrat svého partnera Rhizobium z miliard bakterií v rhizosféře. Toho je dosaženo tím, vylučování flavonoidů signální molekuly z kořene, který působí jako chemo-atraktanty, ale především jako induktory z Rhizobium hrbolky geny (Podívejte se, 2013). Tyto geny jsou potřebné pro produkci bakteriálních signálních molekul; faktory Nod (NFs), které spouštějí vývojový program uzlů v hostitelské rostlině (Walker a Downie, 2000). NFs jsou lipochitooligosaccharide molekuly, které nesou hostitele specifické substituce na terminálu zbytků cukru a charakteristické řetězce lipidů, které jsou uznávány LysM-typ hostitel receptory a jsou nutné jak pro uzlík rozvoj a bakteriální infekce. Je zajímavé, že starověké symbióza rostlin půdy s arbuskulární mykorhizní (AM) houby pracuje s podobnými lipochitooligosaccharide signální molekuly, Myc faktory, které jsou vnímány podobné, ale různé LysM-typ receptorů jako NFs (Abdel-Lateif et al., 2012; Oldroyd, 2013). Myc faktory a NFs aktivovat společný signální dráhy, ale po zapojení společné symbiotických genů zachovány v rostlinách, cesty odchýlit; jedna vede k hrbolky, druhý na AM symbiózu.

infekce rostlin a tvorba uzlů jsou složité procesy; Faktory Nod hrají zřetelné role v organogenezi uzlíků a infekci kořenových vlasů. Kromě faktorů Nod jsou pro účinnou infekci rozhodující různé bakteriální povrchové polysacharidy (Fraysse et al ., 2003). Ve většině luštěniny, rhizobia zadejte hostitele přes kořenové vlásky, kde invaginaci plasmatické membrány infekce závit (IT) je vytvořen, který obsahuje množí bakterie a rostou směrem ke kořenové kůry. Méně častý a starodávný způsob infekce nastává prasklinami na povrchu kořenů některých luštěnin.

Určitý a Neurčitý Uzlík Rozvoj

Uzlík rozvoj vyžaduje mitotické reaktivace kortikální buňky, což vede k uzlík primordium formace, které pak rozlišuje na dusík-stanovení kořenové uzliny poskytování microaerobic stavu, v centrální zóně pro fungování kyslík citlivé nitrogenase enzymu v bacteroids. V závislosti na přechodné a perzistentní povaze proliferace hostitelských buněk mohou být uzliny buď určeného nebo neurčitého typu (Terpolilli et al., 2012; Kondorosi a kol., 2013). Determinované uzliny nemají meristém a obsahují homogenní populaci symbiotických buněk. Determinované uzliny se vyvíjejí například na kořenech Phaseolus vulgaris a Lotus japonicus.

naopak aktivní dělení buněk je udržováno v neurčitých uzlech. Uzlík meristém je přítomen v apikální oblasti (oblast I), které je neustálé vytváření nových buněk vyvolává kontinuální růst a protáhlý výrůstek tvaru. Buňky opouštějící meristém se již nerozdělují a vstupují do diferenciační fáze. Infekce se vlákno uvolní bakterie do submeristematic buňky, které diferencují postupně po 12-15 vrstvy buněk infekce zóny (zóna II), což vede k rozvoji dusíku-stanovení symbiotické buňky v uzlu zóny III (Obrázek 1; Franssen et al., 1992). Medicago sativa, m. truncatula, Vicia sativa a Pisum sativum jsou příklady rostlin tvořících neurčité uzliny.

Růst Symbiotické Buňky Zahrnuje Zesílení Hostitelského Genomu do Endoreduplikaci Cyklů

Extrémní rostlinné buňky rozšíření lze pozorovat v obou určitý a neurčitý uzliny. Cytoplazma symbiotické buňky fixující dusík hostí asi 50 000 bacteroidů. Pro uložení tak vysokého počtu endosymbiontů rostou hostitelské buňky. V uzlinách m. truncatula je objem buněk fixujících dusík 80krát větší než objem diploidních meristematických buněk. Růst infikovaných buněk dochází postupně v zóně II a je důsledkem opakované endoreduplikaci (ER) genomu bez mitózy. V zóně II buněčného cyklu stroje je stále aktivní, ale nedostatek mitotické cyclins inhibuje mitózu a transformuje mitotických cyklů k endoreduplikaci cyklů (Cebolla et al., 1999). Toho je dosaženo přepínačem buněčného cyklu CCS52A protein, který destrukcí mitotických cyklinů indukuje opakovaná kola duplikace genomu vedoucí k tvorbě postupně rostoucích polyploidních buněk (Roudier et al ., 2003; Kondorosi a Kondorosi, 2004). V Medicago druhů úrovní ploidie může dosáhnout 64C což představuje 64-krát vyšší obsah DNA ve srovnání s haploidní buňky (C odpovídá obsah DNA haploidní; Vinardell et al., 2003). Down-regulaci CCS52A v M. truncatula neměl žádný vliv na primordium formace, ale bylo škodlivé pro uzlík diferenciace naznačuje, že ER cykly a tvorbu velkých vysoce polyploidních buněk jsou nezbytné pro uzlík fungování (Vinardell et al., 2003). Zajímavé je, že kortikální buňky obsahující AM houby jsou také polyploidní, stejně jako obří kořenové buňky krmící hlístice (Favery et al., 2002; Žánr a kol., 2008). Podobně, hmyz symbiotické buňky, bakteriocyty nesoucí intracelulární endosymbionty jsou také velké a polyploidní (Nakabachi et al., 2010). V krytosemenných rostlin, polyploidie je časté a konkrétní zdědil vzor polyploidie v různých orgánech, tkáních a typech buněk naznačují, že by to mohlo být hlavním zdrojem specializované fyziologii hostitelské buňky (Nagl, 1976; Edgar et al., 2014). Vedle buněčného růstu, mnohočetných genových kopií, může nedostatek kondenzace chromozomů přispět k vyšším transkripčním a metabolickým aktivitám. Nicméně, asociace polyploidie u různých buněčných funkcí naznačuje vliv polyploidie také na architektuře nucleosomes a na epigenomu ovládání k aktivaci nebo represi specifických genomových regionů. Proto polyploidních genomů obsah symbiotické buňky se zdá být předpokladem pro uzlík diferenciace a pro vyjádření nejvíce symbiotických hostitelské geny (Maunoury et al., 2010).

různé osudy bakterií fixujících dusík

bakterie uvolňované z IT jsou přítomny v hostitelské cytoplazmě jako organely podobné struktury, nazývané symbiosomy. Bakterie nemají přímý kontakt s cytoplazmou, protože jsou obklopeny peribakteriální membránou, známou také jako symbiozomová membrána (SM). Bacteroid, SM a prostor mezi nimi tvoří symbiosom (Catalano et al ., 2004). SM během svého vzniku odráží jeho původ plazmatické membrány, pozdější modifikace jeho složení otevírají nové, specializované role na rozhraní host-endosymbiont (Limpens et al ., 2009; Ivanov a kol., 2012; Brear a kol., 2013; Sinharoy et al., 2013). Na bacteroids množit se v rostoucí hostitelské uzlík buňky do určité hustoty buněk, přizpůsobit endosymbiotic životní styl a microaerobic podmínky a zralý na dusík-stanovení bacteroids. Forma a fyziologie bacteroidů se však u různých luštěnin může výrazně lišit. V některých luskovin hostí, dusík-stanovení bacteroids mají stejnou morfologii jako kultivované buňky; tento typ bacteroids může vrátit k volně žijící formy. V jiných asociacích jsou bacteroidy nevratně transformovány na polyploidní, zvětšené, nekultivovatelné endosymbionty. Tyto nevyléčitelně diferencované bacteroids mohou být protáhlé a dokonce i rozvětvené a 5 – až 10-krát delší, než je free-živé buňky, nebo mohou být kulovité, 8-nejméně 20-krát zesílen genomu, v závislosti na hostiteli (Mergaert et al., 2006; Nakabachi a kol., 2010). Terminální diferenciace bacteroids je hostitel řízené, se vyvinul v několik větví rodiny Leguminosae uvedením hostitele výhodu a pravděpodobně vyšší symbiotické výkon (Oono et al., 2010). Terminální diferenciace bakterií je nejlépe objasněna v symbióze s. meliloti – m. truncatula. V M. truncatula uzlíky, nejvíce viditelné akce terminálu bacteroid diferenciace se vyskytují v zóně II. Násobení bacteroids zastaví uprostřed zóny II, kde buňka prodloužení a jednotné zesílení více replicons tím, endoreduplikaci cykly začínají. Po 2-3 vrstvy buněk na hranici zóny II a III (tzv. interzone) náhlý růst bacteroids je viditelné, dosahující prakticky jejich konečné velikosti, nicméně, dusíku-fixace probíhá pouze v zóně III.

Host Peptidy Řídí Bacteroid Diferenciace

Porovnání uzlík transcriptomes luštěnin s reverzibilní a ireverzibilní bacteroid diferenciace odhalena existence několik stovek malých genů, které byly přítomny pouze v genomu těchto hostitelských rostlin, kde bacteroid diferenciace byla terminálu. V m. truncatula produkují uzlové buňky nejméně 600 symbiotických peptidů specifických pro uzliny (sympateps). Geny sympatep jsou aktivovány pouze v polyploidních symbiotických buňkách infikovaných s. meliloti (Kevei et al ., 2002; Mergaert a kol., 2003), nicméně některé sady v dřívějších, jiné v pozdějších fázích vývoje uzlíků. Velká část, více než 500 genů kóduje peptidy bohaté na cystein (NCR) specifické pro uzliny (Mergaert et al., 2003; Alunni et al., 2007; Nallu et al., 2014). NCR peptidy jsou zaměřeny na bacteroids a při jejich dodání do endosymbionts byl zablokován, bacteroid diferenciace byla zrušena prokazující, že peptidy jsou zodpovědné za terminální diferenciace. S. meliloti bacteroids (Van de Velde et al., 2010). Odrůda s vysokou sekvencí a charakteristické vzorce exprese genů NCR naznačují rozmanitost jejich funkcí,způsobů působení a bakteriálních cílů v různých stádiích zrání bakterií (Obrázek 2). Proč však hostitelská buňka produkuje arzenál NCRs? Jaká může být výhoda tak rozmanitého peptidového repertoáru? Je nutné pro interakci hostitele s různými bakteriemi? Symbiotické partnery, M. truncatula jsou S. meliloti a. S. medicae, nicméně v půdě existuje nespočet kmen variant obou druhů. M. truncatula je také zastoupena v mnoha různých ekotypů a přístupy se liší v číslo, sekvence, a výraz profilu NCR geny a v jejich symbiotické interakce s různými. S. meliloti a. S. medicae kmenů (Nallu et al., 2014; Roux a kol., 2014). Zatímco uzlík obsahuje jediný typ bakterie, různé uzliny na stejném kořenovém systému mohou mít odlišné bakteriální populace. Je možné, že rostlina rozpoznávající různé endosymbionty manipuluje s repertoárem peptidů specifickým pro kmen. Tyto rozdíly mohou přidat další úroveň kontroly pro specifičnost host-symbiont a tím pro účinnost nodulace.

přestože sympatepy představují jedinečné peptidové třídy, jejich struktury se podobají antimikrobiálním peptidům (AMPs). Zesilovače se širokým spektrem mikrobiální aktivity zabíjející buňky jsou nejčastěji kationty vyvolávající buněčnou smrt tvorbou pórů, narušením membrány a následnou lýzou mikrobiálních buněk. Skutečnost, že schopnost buněčného dělení je definitivně ztracena během diferenciace endosymbiontu, naznačuje, že alespoň některé sympatepy mají antimikrobiální aktivity. Léčba bakterií syntetickými kationtovými NCRs skutečně vyvolala rychlou a účinnou eliminaci různých gramnegativních a grampozitivních bakterií, včetně důležitých lidských a rostlinných patogenů (Van de Velde et al ., 2010; Tiricz et al., 2013). Tento ex-planta smrtící účinek koreluje s permeabilization mikrobiální membrány, nicméně, symPEPs v jejich přirozeném prostředí – v uzlu buňky – nemají permeabilize bakteriální membrány a ne zabít endosymbionts. S největší pravděpodobností jsou koncentrace peptidů v uzlinách významně nižší než koncentrace aplikované v in vitro testech. Navíc kationické peptidy jsou produkovány spolu s aniontové a neutrální peptidy ve stejné buňce, a možné kombinace několika desítek či stovek peptidů s různými náboje a hydrofobnosti může neutralizovat přímý baktericidní efekt kationtové peptidy.

zapojení zesilovačů nebo peptidů podobných AMP není jedinečné pro symbiózu Rhizobium-luštěniny. V weevil Sitophilus, symbiotické buňky produkují antimikrobiální peptid coleoptericin-(coca-ColA), která vyvolává vývoj obří vláknité endosymbionts tím, že inhibuje dělení buněk a chrání sousední hmyzí tkáně, bakteriální invaze (Login et al., 2011). V tomto systému jeden peptid je dostatečná pro rozlišení obligátní vertikálně přenášeny endosymbiont na rozdíl od uzlíky, které pracují se stovkami symPEPs a může hostit nesčetné kmen varianty jako jejich endosymbionts. Na mšice-Buchnera symbióza, hostitelské buňky také produkují bacteriocyte-specifické peptidy včetně cystein bohaté peptidy (závazná podniková pravidla), které se podobají Medicago NCR peptidy, avšak funkce těchto symbiotických peptidy nebyly hlášeny, ale přesto (Shigenobu a Stern, 2013).

NCR247: příklad Vícecílového efektoru hostitele

Transkriptomová analýza M. truncatula uzliny v různých fázích jejich vývoje, laser microdissection z uzlík regionů, in situ hybridizace, immunolocalization vybraných peptidů a symPEP promotor-reportér genových fúzí v transgenních uzlíky umožňují mapování činnosti jednotlivých peptidů v symbiotické buňky od počátku infekce až do konce fixace dusíku státu. NCR247 je exprimován ve starších buněčných vrstvách zóny II a v interzóně, kde se zastaví dělení bakteriálních buněk a dochází k pozoruhodnému prodloužení endosymbiontů (Farkas et al ., 2014). Tento malý kationtový peptid účinně zabíjel různé mikroby in vitro a analýza in silico ukázala jeho extrémní kapacitu vazby na proteiny. NCR247 značený FITC vstoupil do bakteriálního cytosolu, kde byly možné jeho interakce s četnými bakteriálními proteiny. Závazné partnery, byly identifikovány léčbu S. meliloti bakterie nebo bacteroids s StrepII/FLAG-tagged peptidy následuje afinitní chromatografie a identifikace interakci partnerů s LC-MS/MS a Západní analýzy (Farkas et al., 2014).

jedním z interaktorů byl protein ftsz buněčného dělení, který hraje klíčovou primární roli v buněčném dělení. Je známo, že řada antibiotických peptidů vykazuje baktericidní nebo bakteriostatický účinek interakcí s FtsZ, inhibuje jeho polymeraci, čímž brání správné tvorbě Z-kruhu a septa (Handler et al., 2008). NCR247 byl společně čištěn s FtsZ z bakteriální cytoplazmy a bylo prokázáno, že narušuje tvorbu septa. NCR035 vykazuje in vitro také baktericidní účinek a vyroben ve stejném symbiotické buňky jako NCR247 hromadí na dělení přepážky, která označuje současný nebo po sobě jdoucí účinek těchto peptidů a vývoj více hostitelských strategií k potlačení endosymbiont šíření. Další studie ukázala, že exprese důležité dělení buněk, genů, včetně genů potřebných pro Z-ring funkce, byly silně oslabené buňky ošetřeny NCR247 (Penterman et al., 2014). Předúprava bakterií se subletálními koncentracemi NCR247 zrušila lokalizaci FITC-NCR035 do septa a vyvolala prodloužení buněk (Farkas et al ., 2014).

ribozomální proteiny byly nejhojnějšími interakčními partnery NCR247. Bylo pozorováno, že NCR247 silně inhibuje syntézu bakteriálních proteinů v závislosti na dávce jak in vivo, tak in vitro (Farkas et al ., 2014). Tyto výsledky naznačují, že jeden způsob peptidového účinku NCR247 je vázán na ribozomy jak v bakteriálních buňkách, tak v bakteriálních buňkách. Zajímavé je, že v bakteriích byl pozorován změněný vzorec a snížená složitost interagujících proteinů. Tedy obecné vyjádření úrovně ribozomální proteiny byla v průměru 20-krát nižší v bacteroids než ve free-živé buňky s různou relativní hojnost přepisy jednotlivých ribozomální proteiny. Ribozomu diverzifikace v bacteroids může mít významnou roli tím, že přispívá k pokročilé překladu specifických proteinů, čímž podporuje specializované, energeticky náročné fyziologii velmi hojný fixace dusíku funkce.

groel chaperon byl také přímým interagujícím partnerem ncr247 (Farkas et al., 2014). Z 5 Groelových proteinů postačuje GroEL1 nebo GroEL2 k přežití, zatímco GroEL1 exprimovaný na vysoké úrovni v uzlu je nezbytný pro symbiózu (Bittner et al., 2007). Je zapotřebí pro úplnou aktivaci nodulačních genů a sestavení nitrogenázového komplexu. GroEL má extrémní funkční všestrannost interakcí se stovkami proteinů. Na NCR247-GroEL1 interakce může mít důsledky přímo na GroEL, ale nepřímo také na GroEL substráty a související biologické procesy. Absence GroEL1 výrazně ovlivněny bakteriální infekce a údržba a diferenciace bacteroids prokazující obecnou potřebu GroEL1 ve všech fázích dusíku stanovení uzlík rozvoj.

zapojení peptidů GroEL a hostitel v interakcích mikrob-hostitel není jedinečné pro symbiózu Rhizobium-luštěniny. V symbiotických buňkách weevil interaguje coleoptericin-a (ColA) také s Groelem (Login et al., 2011). GroEL také hraje důležitou roli při udržování endosymbiontů (Moran, 1996; Kupper et al., 2014). Jako většina symbiotické systémy jsou dosud neprozkoumané a high-propustnost genomické a proteomic tools jsou jen v poslední době k dispozici, můžeme pouze předvídat, že peptidy hostitele zprostředkované endosymbiont diferenciace, podobně genomu amplifikace hostitelské buňky a nevyléčitelně diferencované endosymbionts jsou obecné strategie symbiózy.

Závěr

Symbiotické a patogenní bakterie použít podobné přístupy k interakci se svými hostiteli a přežít v hostitelských buňkách, i když výsledky těchto interakcí jsou nápadně odlišné. Rostliny a zvířata mohou vytvářet vrozené imunitní odpovědi na mikroorganismy při vnímání MAMP (molekulární vzory spojené s mikroorganismy). Toto vnímání má za následek aktivaci signálních kaskád a produkci antimikrobiálních efektorů. Hostitelské peptidy podobné AMP, jako je M. truncatula NCR peptidy nebo antimikrobiální peptid weevil ColA hrají klíčovou a mnohostrannou roli při kontrole množení a diferenciace endosymbiontů, čímž omezuje přítomnost bakterií na symbiotické buňky. Hostitelské organismy tedy využívají tyto efektorové peptidy ke zkrotení a dokonce k pronájmu vybraných mikrobiálních útočníků pro službu.

Prohlášení o střetu zájmů

autoři prohlašují, že výzkum byl proveden bez jakýchkoli obchodních nebo finančních vztahů, které by mohly být vykládány jako potenciální střet zájmů.

Poděkování

Práce v našich laboratořích je podporován pomocí“SYM-BIOTICS“ Advanced Grant Evropské Výzkumné Rady na Éva Kondorosi (grant číslo 269067) a TÁMOP-4.2.2.A-11/1 / KONV-2012-0035 podporováno Evropskou unií a spolufinancováno Evropským sociálním fondem.