Diskuse
image cytometrie metoda navrhovaná v této práci prokazuje schopnost rychle a efektivně analyzovat autofagie v živých buňkách pro screening potenciálních léčiv, které mohou indukovat nebo inhibovat autophagic činnosti, jako je podpora clearance patologickou konformací proteinů spojených s neurodegeneraci, nebo inhibici rezistence spojené s rakovinou. Omezení v aktuální metody mohou být překonány image cytometrie a jedinečné činidla vyvinout nové metody detekce autofagie. Vidění Celometru bylo dříve používáno pro fluorescenční testy založené na buňkách (Chan et al ., 2011, 2012b; Robey a kol., 2011) a bylo prokázáno, že Cyto-ID autofagické barvivo specificky barví autofagosomy v živých buňkách. V této práci je prokázáno, že barvivo Cyto-ID kolokalizuje s RFP-LC3 v hladových buňkách HeLa, které dále potvrzují specificitu barviva. Vyvinutá metoda detekce autofagie založená na obrazu je srovnávána se standardní průtokovou cytometrií porovnáním výsledků aktivity autofagie v buňkách Jurkat hladovějících živinami. Výsledky ukázaly zvýšení fluorescenční intenzity v buňkách hladovějících živinami a snížení obnovených buněk Jurkat. Naměřené hodnoty AAF obrazové cytometrie jsou však podstatně vyšší než průtoková cytometrie, což může být způsobeno rozdíly mezi instrumentací a metodami. Na Cellometer Vidění obrazový cytometr používá poplatek spojený zařízení pro fluorescenční měření, zatímco FACS Calibur průtokovým cytometrem používá photo-multiplier tube (PMT). Kromě toho se metoda analýzy fluorescenčních intenzit také lišila mezi oběma systémy. Průtokový cytometr měří celkové fluorescenční signály z každé buňky, zatímco obrazový systém získává obrazy a analyzuje fluorescenčně obarvené autofagosomy v buňkách, což může poskytnout přesnější měření aktivity autofagie. Software Cellometer může analyzovat fluorescenci buněk součtem celkových fluorescenčních pixelů v každé buňce nebo měřením pouze pixelů s vysokou fluorescenční intenzitou z autofagozomů v každé buňce. Další rozdíl může být způsoben smykovým napětím průtokové cytometrie ovlivňujícím životaschopnost cílových buněk (Robey et al ., 2011).
Autofagický tok je také důležitým testem pro vývoj nové detekční metody. CQ se používá k inhibici lysozomální degradace autofagozomů, kde by autofagická aktivita byla nejvyšší pro buňky Jurkat hladovějící živinami v přítomnosti CQ v důsledku synergické interakce mezi léčbami. Další nejvyšší by byly buňky Jurkat v hladovění bez CQ. Pouze mírné zvýšení autofagické aktivity by bylo vystaveno buňkami Jurkat s CQ pouze ve srovnání s kontrolou v důsledku akumulace bazálních autofagolysozomů. Výsledky autofagického toku získané z obou přístrojů vykazovaly podobné trendy, ale hodnoty AAF naměřené v obrazové cytometrii jsou významně vyšší. Tyto výsledky prokázaly, že obraz cytometric metody detekce může být snadno provedena zkoumat autofagie činnost, a to navzdory potenciálně nástroje-specifické kvantitativní rozdíly v AAF hodnoty.
s cílem prokázat, že image cytometrie může být potenciální objev drogy screening technologie, schopnost analyzovat vzorky ve více podmínkách musí být testovány. Obrazová cytometrie se používá k měření autofagické aktivity buněk Jurkat léčených rapamycinem v různých koncentracích, k prokázání schopnosti obrazové cytometrie měřit účinky odpovědi na dávku v průběhu studie. Výsledkem je, že obrazová cytometrie je schopna detekovat rozdíly v autofagické aktivitě v různých experimentálních podmínkách. Na Obr. 8.6, autofagická aktivita (měřená hodnotami AAF) je nejvyšší po 18 hodinách inkubace. Mírné snížení hodnot AAF je ukázáno mezi 8 a 4 h inkubace, což může být způsobeno tím, že se buňky po počáteční léčbě léky úplně zotaví. Kromě toho lze pomocí metody obrazové cytometrie měřit také adherentní buňky, jako je buněčná linie lidského karcinomu prostaty (PC-3). Zobrazovací rozlišení vidění Celometru může analyzovat fluorescenčně značené autofagosomy (puncta), pozorované jak na fluorescenčních obrazech, tak na histogramech intenzity fluorescence.
je také důležité prokázat schopnost charakterizovat různé farmaceutické sloučeniny porovnáním jejich autophagic dávka–efekt reakce na lék objev kampaně. Účinky tamoxifenu a rapamycinu na dávku jsou přímo porovnávány pomocí obrazové cytometrie. Výsledky při 18h inkubaci ukázaly, že rapamycin indukoval vyšší úroveň autofagické aktivity než tamoxifen. Je důležité si uvědomit, že tamoxifen při 100 µM je vysoce cytotoxický, což vede k smrti a rozpadu Jurkatových buněk po inkubaci 18 hodin. Verifikace cytotoxického účinku Tamoxifenu při vysoké koncentraci založená na obrazu může být velmi užitečná při eliminaci nejistot pouze z výsledků rozptylového grafu a histogramu.
obrazová cytometrie prokázala srovnatelné výsledky se standardní průtokovou cytometrií pro fluorescenční buněčnou analýzu (Chan et al ., 2011; Robey a kol., 2011). Obrazová cytometrická metoda může nabídnout několik výhod oproti průtokové cytometrii. Například počet buněk potřebných pro každý vzorek (10-20 µL) je významně menší než běžný průtokový cytometr (300-500 µL). Počáteční nastavení na průtokovém cytometru vyžaduje, aby některé vzorky cílových buněk byly použity pro nastavení napětí PMT a kompenzace. Na druhé straně mnoho obrazových cytometrů pipetuje buňky do počítací Komory, kterou lze opakovaně skenovat. Vzorky cílových buněk se proto při počáteční optimalizaci nastavení a zaostření doby expozice neplýtvají. Ještě důležitější je, že výhoda zachycení BR a fluorescenčních obrazů umožňuje vědcům vizuálně ověřit získaná fluorescenční data. To může pomoci při zjišťování cytotoxicity jako komplikující vedlejší účinek léku, léčba testu, který vyvolává autofagie.
Autofluorescence může dojít při použití Cyto-ID Zelené autofagie barvivo vzhledem k plastové počítání komora, ale software může automaticky odstranit pozadí signálu získat skutečný cíl fluorescence bez změny AAF výpočet. Kromě toho, foto-fluorescenční sondy v buňce-podle testů je minimalizováno, protože Cellometer Vidění používá nižší výkon Led diody v porovnání s vysokým výkonem laserů používaných v jiných nástrojích. Budoucí zlepšení Cellometer obrazový cytometr by se vyvinout vyšší propustnost automatizovaný systém, který může analyzovat více buněk, pro lepší statistické analýzy, stejně jako schopnost analyzovat několik vzorků současně, což usnadňuje vyšší propustnost buněk na bázi drog screening inhibitory a aktivátory autofagie, apoptóza, nekróza, a dalších fyziologických jevů, zájmu.