interactomes z POU5F1 a SOX2 stimulátory v lidských embryonálních kmenových buněk

Identifikace POU5F1 a SOX2 enhancer interactomes

domnělý POU5F1 a SOX2 enhancer regiony jsou evolučně konzervované napříč obratlovci (44 druhů), s aktivní enhancer podpisy definované epigenetické značky jako p300 histon acetyltransferázu a H3K27ac, ale ne H3K27me3 v hESCs7 ( Doplňkový Obr. 1A). Použili jsme techniku 4C k identifikaci interakčních partnerů domnělých zesilovačů“ návnady “ POU5F1 a SOX2 v pluripotentní buněčné linii H9. Stručně řečeno, buňky byly fixovány na zesítěné chromozomy v blízkosti. Chromozomy byly poté fragmentovány sonikací. Interagující fragmenty chromatinu byly ligovány a kousky DNA byly vyčištěny. Genomické oblasti interagující s „návnadou“byly poté zesíleny vnořeným PCR (Doplňkový obr. 1B, doplňková Tabulka 1). Navrhli jsme inverzní PCR primery pro cílení domnělých zesilovačů genů POU5F1 a SOX2. Vytvořená knihovna 4C mohla být vizualizována elektroforézou DNA, zatímco kontrola bez ligace nevykazovala téměř žádné produkty PCR (Doplňkový obr. 1B), což naznačuje, že knihovna 4C byla amplifikována z ligačních produktů.

provedli jsme sekvenování DNA nové generace pomocí sekvenceru Illumina HiSeq a klasifikovali identifikované interakce 4C jako proximální nebo distální interakce (viz metody). Distální interakce patří mezi chromozomální interakce a intra-chromozomální interakce více genomické vzdálenosti větší než 20 kb, vzhledem k tomu, že proximální interakce pokrytí uvnitř-chromozomální regiony s genetickou vzdáleností mezi 300 bp a 20 kb. V souladu s výsledky studií založených na 3C představuje naše distální interakce čtení pouze malou část celkových interakcí, zhruba 10% ~ 20% pro knihovny 4C (doplňková Tabulka 2). Použili jsme dvě různé šarže buněk H9 k vytvoření knihoven 4C Pro POU5F1 a SOX2 nezávisle pro sekvenování nové generace. Dvě replikace distálních interakcí POU5F1 a SOX2 se překrývají o 35% a 25%. To je v souladu s mírným přesahem pozorovány v biologické replikáty CTCF–zprostředkované chromatinu interactomes v myších ES cells27 a může odrážet rozmanitost a dynamiku enhancer interakce, podvaz účinnost, složitost PCR amplifikace, stejně jako sekvenování hloubky. Odfiltrovat interakce, které pravděpodobně výsledkem stochastické účinky, použili jsme false discovery rate (FDR)-na základě statistického modelu pro identifikaci obohacený interakci domén po celém genomu. Dále jsme sloučili obohacené interagující domény, které se překrývají mezi biologickými replikáty jako časté interagující domény s vysokou důvěrou. Celkem 23 a 9 vysoké sebevědomí časté interakci domén byly identifikovány pro POU5F1 a SOX2 interactomes, respektive ( Obrázek 1 , Doplňková Tabulka 3, 4 ) a většina z nich jsou mimo-chromozomální interakcí, které zahrnují gen-bohaté regiony, podobné e4C results20.

interactomes z POU5F1 a SOX2 zvyšující se překrývají s počátkem replikace DNA domény, ale ne heterochromatic regionů

dále Jsme zkoumali, zda POU5F1 a SOX2 enhancer interagujících domén (velikosti od 1 Mb až 4 Mb, Doplňující Tabulka 3, 4 ) mají jedinečné epigenetické rysy. Jak Ryba et al. showed28, načasování replikace DNA koreluje s prostorovou blízkost chromatinu měřeno Hi-C analýzy, což naznačuje, že časné a pozdní replikace DNA se vyskytují v prostorově odlišných jednotek v jádře. Všimli jsme si, že POU5F1 a SOX2 genové lokusy jsou v počátku DNA replikace domény v těchto a přemýšlel, zda jejich interakci domény mají podobné načasování replikace DNA. Jak je znázorněno na obrázku 2A, interagující domény POU5F1 a SOX2 enhancer se převážně překrývají s doménami rané replikace DNA v hESC. Rozdělení testovány replikace hodnoty časování v rámci genomové regiony obklopující zjištěných POU5F1 a SOX2 enhancer-interakci stránky (50 kb rozsah) ukazuje posun směrem k pozitivní hodnoty ve srovnání genomu-široký pole hodnot (P < 2.2 × 10-16 pro oba, nepárovým Wilcoxon rank-sum testem; obrázek 2B). Toto pozorování odhalilo zajímavý epigenetický rys, že struktury vyššího řádu obklopující zesilovače POU5F1 a SOX2 mají synchronizované načasování replikace DNA. Jako počátku DNA replikace domény byly připojeny k aktivní transkripce genů v hESCs28, je pravděpodobné, že interakce POU5F1 a SOX2 zvyšující se zjištěnými distální regiony mají funkční význam. Toto pozorování je v souladu s tím, co jsme viděli v POU5F1 enhancer interactome v myších ES buněk (data nejsou zobrazena). Také ukázal na Obrázku 2A , POU5F1 a SOX2 interakci domén nepřekrývají s heterochromatic regiony označeny silné H3K9me3 signály v hESCs29, což naznačuje, že interactomes jsou v aktivní části genomu z hlediska genové regulace. Kromě toho jsme zkoumali potenciální vztah k jaderné lamina-související domény (Chlapci) lidské chromosomes30, ale nepozorovali žádné připojení, možná kvůli tomu, že Kluci byli odhodláni v lidských fibroblastech.

enhancer interactomes jsou vedle transkripce začátek stránky a mají aktivní epigenetické vlastnosti

prozkoumat korelace POU5F1 a SOX2 enhancer interactomes s poznámkami gen místech, jsme analyzovali rozložení genomové vzdálenost enhancer interakci lokalit k nejbližší genové transkripce začátek stránky (TSS) ( Obrázek 3A ). Grafy hustoty jádra obou webů interagujících s zesilovačem POU5F1 a SOX2 jasně ukazují ostrý vrchol soustředěný na TSS. Při srovnání distribuce vrcholu náhodně simulované míst v genomu, vrcholy pozorované v enhancer interactomes jsou výrazně vyšší v úzkém okně, kolem TSS (P = 0.0018, P = 0, 0047, respektive, Kolmogorov-Smirnov test). Obohacení interakci lokalit v okolí TSS naznačuje, že POU5F1 a SOX2 zesilovače dávají přednost interakci s genomových oblastí, které obsahují geny. Dále jsme zkoumali distribuci POU5F1 a sox2 enhancer–interagujících míst v různých genomových oblastech31. 3B, sekvence genových promotorů jsou jednou z obohacených oblastí jak pro INTERAKTOMY zesilující POU5F1, tak pro sox2. Kromě toho je frakce distálních mezigenních oblastí důsledně redukována pro dva interaktomy. Proto naše pozorování naznačuje, že struktura chromozomů vyššího řádu obklopující aktivní zesilovače může být přímo zapojena do regulace genů. Také poznamenal, když náhodné stránky, na počátku DNA replikace oblastech (viz Metody), podrobnosti jsou vybrány tak, aby porovnat vzdálenost distribuci TSS, POU5F1 a SOX2 interactomes jsou stále více obohacený kolem TSS, i když statisticky nevýznamný (P = 0.390,1 P = 0.2098, respektive, Kolmogorov-Smirnov test, Doplňující Obr. 2 ).

modifikace Histonů je známo, že se podílí transkripční regulace pomocí decondensing kompaktní chromatinu struktur pro transkripční faktor závazné. 3C-na Základě celogenomových interactome studie identifikovali aktivní a neaktivní chromatin jednotek v jádře, s aktivní prostory obohacené o histonů značky, které aktivaci genové transkripce, jako H3K9ac32. Proto jsme se zeptali, zda aktivní zesilovače POU5F1 a SOX2 selektivně interagují s distálními oblastmi vykazujícími aktivní transkripci genů. ChIP-Seq tag profily H3K27me3, H3K4me1, H3K4me2, H3K27ac, H3K9ac, H4K20me1 a H3K36me3 v H1 ES buněk line33 byly použity pro analýzu histonů vzory spojené s interactomes. Chip-Seq tagy kolem enhancer interagujících míst byly počítány a normalized34 a vizualizovány jako boxplot. Jak bylo uvedeno, interakce POU5F1 a SOX2 mají profily h3k4me1, H3K4me2 a H4K20me1 s vyšší intenzitou, což jsou značky pro genovou aktivní regulaci (obrázek 4A). Ve srovnání na náhodných místech na začátku replikace DNA oblastí, zkoumaných histonů značky jsou obecně více obohacený POU5F1 interactome než v SOX2 interactome, s H3K4me1 a H3K9ac jsou většinou výrazně obohatil ty v POU5F1 interactome (P < 2.2 × 10-16 pro obě značky, nepárový Wilcoxon rank-sum test). Zajímavé je, že Polycomb-zprostředkované umlčování genů mark H3K36me335 není obohacený buď interactome (P = 0.485, P = 0.922, respektive). Zkoumali jsme také vztah INTERAKTOMŮ zesilovačů POU5F1 a SOX2 s 5-hydroxymethylcytosinovými (5-hmC) místy v genomu. Jak ukázala předchozí studie, genomická 5-hmC místa jsou obohacena o aktivní zesilovače v hESCs36. Protože zesilovače POU5F1 a SOX2 proti proudu sousedí s 5-hmC weby (do 5 kb), zeptali jsme se, zda jsou interactomy enhanceru také obohaceny o 5-hmC weby. Na Obrázku 4B , 5-hmC stránky jsou obohaceny v blízkosti POU5F1 a SOX2 interactomes ve srovnání na náhodných místech na začátku replikace DNA oblastech (P < 2.2 × 10-16, P = 0.047, respektive, Kolmogorov-Smirnov test). To znamená, že dva enhancer interactomes v těchto mají epigenetické vlastnosti aktivní zesilovače, které mohou usnadnit aktivní regulace genové transkripce.

Transkripční stav POU5F1 a SOX2 enhancer interakci genů

pochopit transkripční stav genů spojených s POU5F1 a SOX2 stimulátory, jsme analyzovali RNA-Seq transcriptome dat v těchto a plodu plic fibroblasts37, se zaměřením na geny, které mají TSS do 10 kb enhancer–interakce stránek. V těchto, vyjádření POU5F1 a SOX2 enhancer–interakce genů je výrazně vyšší než u všech genů v těchto (P = 7.5 × 10-6 a P = 1.2 × 10-6, respektive tím, nepárový Wilcoxonův rank-sum test; Obrázek 5A ), což naznačuje, že interactomes jsou obohaceny aktivně transkribované geny. Aktivní stimulátory POU5F1 a SOX2 by se tedy mohly podílet na zprostředkování transkripce přidružených distálních genů. RNA-Seq transcriptome analýza také ukázala, že geny, původně spojené s aktivní POU5F1 a SOX2 zesilovače v těchto jsou down-regulovány v diferencované plicní fibroblasty (P = 1.2 × 10-5 a P = 0.013, respektive tím, spárované Wilcoxonův rank-sum test; Obrázek 5B ). Tyto výsledky naznačují, že zesilovače těchto dvou genů souvisejících se stemness interagují se skupinou genů, která je vysoce exprimována v hESC, ale potlačena ve fibroblastech.

Distální geny spojené s POU5F1 zesilovač jsou zapojeny do regulační obvody pluripotency

prozkoumat, zda POU5F1 a SOX2 enhancer–interakce genů, přispívají k self-obnovení a pluripotency z linií, jsme analyzovali data z genomu-široký RNA interference obrazovky pomocí POU5F1 pořadatel reporter assay v hESCs38. Interference transgenní exprese POU5F1-GFP je kvantifikována hodnotami Fav odrážejícími intenzitu fluorescence GFP, což představuje sklon ke stemness (obrázek 6A). Ve srovnání se všemi geny, stíněný, POU5F1 enhancer–interakce genů (geny nejblíže k interakci míst, s genomickou vzdálenost od TSS k interakci míst méně než 10 kb) ukazují trend klesající Fav hodnoty, i když není statisticky významný (P = 0.08, nepárový Wilcoxonův rank-sum test). U genů zaměřených na SOX2 jsou však hodnoty Fav podobné všem screenovaným genům (P = 0.98, nepárový Wilcoxon rank-sum test). Proto, na základě těchto údajů, geny v POU5F1 interactome se zdají být více důležité pro kmenových buněk pluripotency než geny v SOX2 interactome.

Gene ontologie analysis39 39 POU5F1–interakce genů a 20 SOX2–interakce genů ukázal, že významná část z nich se účastní transkripční regulace (30.8% 35.0% pro POU5F1 a SOX2 interactomes, resp.; Doplňující Tabulka 5, 6 ) a distribuovány 8 a 4 různé interakci domén v POU5F1 a SOX2 interactomes, respektive, s ne více než 3 geny v jedné interakci domény. Diferenciální exprese analýza těchto transkripční regulátory v těchto a fetální plicní fibroblasty odhalila 9 v POU5F1 interactome (11 z 12 identifikován transkripční regulátory mají RNA-Seq dat) mají vyšší exprese v těchto ( Obrázek 6B ), což naznačuje, že aktivní roli těchto genů v pluripotency regulační síť linií. U těchto transkripčních regulátorů v interaktomu SOX2 vykazovaly 3 z 5 zvýšenou expresi v hESC. Proto POU5F1 enhancer interactome může hrát větší roli v kmenových buněk pluripotency než SOX2 enhancer interactome.

Několik transkripční faktor vazebná místa jsou obohaceny v POU5F1 a SOX2 enhancer interactomes

Transkripční faktor vazba je jednou z vlastností, které stimulátory mají, a to může usnadnit dlouho–rozsah chromatinu–chromatin interakce zesilovač s distální geny. POU5F1 a sox2 domnělé zesilovače jsou známá horká místa pro asociaci více proteinů vázajících DNA v hESC. Pochopit, zda je určité transkripční faktory jsou obohaceny v POU5F1 a SOX2 enhancer–interakci regionů, jsme systematicky analyzovali ChIP-Seq profily 32 DNA vázající proteiny v linií (viz Metody). Normalizované počty značek ChIP-Seq kolem středu interakčních míst 4C byly vypočteny a vizualizovány pomocí boxplot (obrázek 7A). Jako kontrola byly také vypočteny počty kolem středu náhodných míst v oblastech rané replikace DNA. Statistická analýza identifikovala ATF3, CTCF, GABPA, JUND, NANOG, RAD21 a YY1 stránky byly nejvíce obohacené proteiny v obou enhancer interactomes ve srovnání s kontrolou (P < 0.01, nepárové Wilcox rank-sum test). Transkripční faktor OCT4 související s pluripotencí však není obohacen ani INTERAKTOMEM POU5F1, ani SOX2. Proto, ATF3, CTCF, GABPA, JUND, NANOG, RAD21 a YY1 jsou charakteristické bílkoviny v POU5F1 a SOX2 enhancer interactomes v linií a jejich přítomnost může být funkčně důležité.

RAD21 je potenciálně v komplexu s dalšími transkripčními faktory zprostředkovat enhancer interactomes

Jak je uvedeno na Obrázku 7A , RAD21 je jedním z obohacený proteiny identifikovány v POU5F1 a SOX2 enhancer interactomes v linií. RAD21 je součástí soudržného komplexu známého jako síťovadlo řetězce DNA. Bylo prokázáno, že kohesin zprostředkovává smyčku distálního zesilovače Pou5f1 s promotorem genu Pou5f1 v myších es buňkách 40. V souladu s předchozí zprávy, že Rad21 spolupracuje s Ctcf a dalších transkripčních faktorů v udržování myší ES buňky identity40, RAD21 míst v obou POU5F1 a SOX2 interactomes v těchto jsou co-obsazené transkripční faktory. Agregace pozemky jasně ilustrují vrcholu signály ATF3, CTCF, GABPA, JUND, NANOG a YY1 závazné profily v centru RAD21 míst v POU5F1 a SOX2 interactomes ( Obrázek 7B ). Je známo, že Knockdown Gabpa v myších es buňkách snižuje expresi Oct3 / 4, zatímco nadměrná exprese Gabpa udržuje expresi Oct3 / 4 i bez LIF v kultuře myších es buněk. 41. V genomu–široký siRNA obrazovky v hESCs38, vyřazující většinu obohacený proteiny, jako je RAD21, CTCF, GABPA, JUND, NANOG a YY1, výrazně snižuje expresi transgenní POU5F1-pořadatel spojen s GFP reportér, s Fav hodnoty -1.50421, -1.05828, -1.44161, -1.07731, -1.82749, -2.57204, respektive (v rámci top 25% všech genů promítán). Dále pochopit chromatinu–chromatin interakce, jsme použili DNA fluorescenční in-situ hybridizace (FISH) k vizualizaci co-lokalizace dvou genomových lokusů v jediné buněčné úrovni. Lokus genu RARG na chromozomu 12 byl identifikován v INTERAKTOMU POU5F1 v hESCs. Nedávno se ukázalo, že RARG hraje velmi důležitou roli v pluripotenci a může zvýšit indukci buněk iPS o dvě magnitudy42. Jako kontrola byl použit další lokus na chromozomu 12, který není součástí INTERAKTOMU POU5F1. Frekvence ko-lokalizace mezi lokusem RARG (chr12: 51751589-51956291) a POU5F1 locus (chr6: 31169844-31340561) bylo zjištěno, 1.67 krát vyšší než frekvence mezi control locus (chr12: 80380971-80564119) a POU5F1 locus (9.35% versus 5.61%, P < 0.05, Doplňující Obr. 3A). Vyšší frekvenci kontaktu mezi RARG a POU5F1 loci je v souladu s naším sekvenčních dat a naznačuje, že více stabilní interakce vznikají mezi dvěma loci. Vyšetření rarg a kontrolních lokusů (Doplňkový obr. 3B) odhalilo, že existuje více RAD21 a dalších vazebných míst transkripčního faktoru v lokusu RARG s častou koolokalizací. Náhoda chromozomu frekvence interakce s RAD21-obsahující vazebná místa pro více transkripčních faktorů naznačuje, že RAD21 může spolupracovat s dalšími transkripční faktory organizovat dálkové chromatinu-chromatin interakce. Tak, RAD21, spolu s několika transkripčních faktorů, je pravděpodobné, že přispívají k vyšší-aby chromozomální strukturu okolní POU5F1 a SOX2 zesilovače v těchto jako součást pluripotency sítě. K potvrzení této hypotézy odvozené ze studie 4C-Seq jsou však zapotřebí další molekulární studie.