9 Úloha Bílkovin v Spliceosomal Katalytické Jádro
Porovnání velikosti snRNAs s mnohem větší group II intronů zvyšuje možnost, že některé skupiny II intron domén může byly nahrazeny proteiny v spliceosomes během evoluce, což vede k moderní ribonucleoprotein (RNP) eukaryotické splétání stroje. Ačkoli dosud neexistuje žádná korespondence jedna k jedné, je snadno možné identifikovat spliceozomální proteiny, které vykonávají funkci zprostředkovanou prvky RNA v intronech skupiny II. Například řada proteinů spojených s U2 funguje při iniciaci a stabilizaci interakce místa U2 snRNA–větve (obr. 6.3).5,85 V group II intronů, U2 ekvivalent (část domény VI) je kovalentně vázána na pobočku stránky prostřednictvím hyperstable vlásenka smyčka v uspořádání, které zajišťuje tvorbu a stabilitu jejich interakce (Obr. 6.2). Z tohoto evolučního hlediska není divu, že velká část spliceozomálních proteinů se přímo spojuje se snRNA, což jí často pomáhá v její funkci.5,85 Nicméně, mnoho spliceosomal proteiny jsou zapojeny do provádění regulačních funkcí, které nejsou vyžadovány v souvislosti s self-splicing intron a je pravděpodobné, že bude více nedávné dodatky k spliceosomal bílkoviny komplementu.
jak bylo uvedeno výše, předpokládá se, že poslední společný předek eukaryot měl vysoce vyvinutý, plně funkční spliceosom, který se podobal těm, které se nacházejí v moderních eukaryotech.1,2 ačkoli tento spliceosom pravděpodobně obsahoval výrazně méně složek ve srovnání s nejmenšími moderními spliceosomy, data naznačují, že většina klíčových složek byla přítomna v nejranějších verzích spliceosomů.1-4 Opravdu, podmnožina spliceosomal proteomu, který obsahuje proteiny spojené s katalytického jádra vykazují významný stupeň ochrany u různých eukaryotických druhů, s řadou spliceosomal proteiny patří mezi nejvíce konzervované buněčné proteiny.85,86
jak bylo uvedeno výše, mnoho dobře charakterizovaných ribozymů je spojeno s proteiny in vivo, které zlepšují jejich katalytickou aktivitu několika známými mechanismy.83 patří mezi ně stabilizace funkční struktury RNA, pomoc při vazbě a polohování substrátů a pomoc při vazbě funkčně důležitých kovových iontů. Přímá účast na katalýze však dosud nebyla pozorována u žádného ze studovaných proteinů spojených s ribozymem.83,87 pokud se předpokládá, že spliceosom je RNA enzym, spliceosomální snRNA jsou neobvyklé ribozymy v mnoha ohledech. Snad nejdůležitější je, že jsou neobvykle malé pro ribozyme katalyzovat phosphodiester dluhopisů štěpení prostřednictvím aktivace nesousedící nukleofil. Jiné přírodní ribozymy katalyzující takové reakce, jmenovitě introny skupiny I a II a Rnáza P, jsou nejméně dvojnásobně delší než kombinovaná délka lidských snRNA U6 a U2. Tyto ribozymy jsou také mnohem větší než nukleolytické ribozymy, které aktivují sousední 2′ – hydroxylový nukleofil pro štěpení fosfodiesterových vazeb.24,88,89 větší velikost je myšlenka, aby tyto ribozymy složit do složitých struktur stabilizován více terciární interakce, což jim umožní vytvářet sofistikované aktivních míst umožňuje přesné polohování štěpení stránky, aktivní stránky, kovové ionty, a vzdálené nukleofil pro in-line nucleophilic útoku. Je možné, že U6 a U2 snRNAs, vzhledem k jejich krátké délce, v nejlepší formě neefektivní sestřih ribozyme, který vyžaduje další spliceosomal faktory pro stabilní umístění aktivní prvky stránek a reagující skupiny.předpokládá se, že prp8, který je nejzachovalejším spliceozomálním proteinem, hraje takovou roli v spliceozomálním aktivním místě. Prp8 je pravděpodobně nejzajímavější ze spliceosomálních proteinů, protože je neobvykle konzervován s 61% identitou mezi kvasinkami a lidmi.86 Nicméně, to má několik jasně odlišitelné funkční motivy v jeho ~ 2300 aminokyselin délka a funkční domény, které byly rozeznány zatím jsou degenerované a pravděpodobně vykonávat funkce nesouvisející s mobilní roli původního založení motivem.86 na druhé straně Prp8 jasně hraje velmi kritickou roli v spliceozomálně aktivním místě. To má být zesítěny na 5′ a 3′ splice sites a pobočka místě premessenger RNAs, kromě U5 a U6 snRNAs, což znamená, že je přítomen v spliceosomal katalytické jádro a přímo kontakty kritické hráči v sestřihu reakce.86,90 Dále bylo prokázáno, že Prp8 interaguje s několika klíčovými spliceozomálními proteiny včetně Snu114 a Brr2 (viz níže).86,91,92
Mutace v Prp8 jsou spojeny s širokým spektrem spliceosomal vady, včetně změn ve schopnosti spliceosomes odmítnout suboptimální splice stránek a potlačení vady způsobené mutace v jiných spliceosomal faktory, jako jsou Prp28, Brr2, U4 a U6 snRNAs.86,93,94 podmnožina mutantů Prp8 selektivně moduluje účinnost prvního nebo druhého kroku sestřihu, zejména v suboptimálních substrátech.58,86,95–97 Tato pozorování jsou nejlépe vysvětluje hypotéza uvádí, že Prp8 se podílí na stabilizaci alternativní, vzájemně se vylučující aktivní místo konformací, které jsou buď připravený za katalýzy první nebo druhý krok sestřihu, a že některé Prp8 mutanti by mohlo vést k selektivní hyperstabilization jednoho z těchto států.58,96,98 Zatímco významné důkazy naznačují, že Prp8 je pravděpodobné, že se podílejí umístění substrátů a stabilizaci aktivního místa, žádné přímé důkazy, v současné době existuje, že naznačuje, nebo vyvrací jeho další zapojení v kovových iontů koordinace nebo přímé účasti v spliceosomal katalýzy.
tato nejistota vyplývá ze skutečnosti, že o způsobu, jakým Prp8 plní svou funkci, je známo jen velmi málo. Inovativní transposon-zprostředkované screening testu vyplynulo, že velké regiony Prp8 jsou vysoce citlivé k vložení transpozony a pravděpodobně fungovat jako jeden konstrukční celek, i když to bylo možné vložit transpozony nebo dokonce rozdělit Prp8 do dvou fragmentů, na několika jiných polohách bez ztráty životaschopnosti.90,92 na Rozdíl od zvrhlé jaderný lokalizační signál v blízkosti jeho N konci a zvrhlík ROZUMÍTE (RNA recognition motif) motiv uprostřed bílkovin, pouze dvě další funkční domény byly identifikovány v tomto ~ 2300 aminokyselin dlouhý protein.86
degenerovaný varianta MPN/Jab1 domény, který je spojen s deubiquitinating enzymů se nachází v blízkosti C konce Prp8.86 Analýza s vysokým rozlišením struktura fragmentu Prp8 obsahující tuto doménu má prokázáno, že kovové ionty vázající místo isopeptidase centrum je narušena, a tak je pravděpodobné, že nebude fungovat jako deubiquitinating enzymu.99,100 In vitro, fragment Prp8 obsahující tuto doménu mohl přímo vázat na ubiquitin s afinitou, která byla srovnatelná s jinými známými ubiquitin vázající proteiny.101 Několik známých Prp8 mutace, které narušil sestřih také narušil in vitro ubiquitin binding, čímž se zvyšuje možnost funkční roli pro ubikvitinace v sestřihu nařízení. Důležitější je, proteomic analýzy ukázaly, že několik spliceosomal faktory, včetně Sad1, Snu114, Rse1, a Prp8 sám, jsou ubiquitní in vivo, a dále spliceosomal core protein Prp19 výstavy E3 ubiquitin ligázy aktivitu in vitro.101-105 Dále, ubiquitin hraje roli při tvorbě a udržování tri-snRNP, případně modulací Prp8-zprostředkované regulace funkce Brr2.102 Alternativně je také možné, že MPN/Jab1 domény funguje jako protein–protein interakce platformu. Počet mutací v Prp8, které patří do této domény následek dědičné slepoty retinitis pigmentosa,86 a tyto mutace se oslabila interakce Prp8 s Brr2 a Snu114.99,
high-rozlišení struktury další fragment Prp8 bylo zjištěno, že zahrnuje vysoce konzervovanou oblast (69% aminokyselinové identity mezi kvasinek a člověka) se nachází v blízkosti jeho C-terminální domény. Analýza struktury odhalila přítomnost β-vlásenky připomínající ty, které se nacházejí v ribozomálních proteinech a degenerované rnázové doméně podobné H.106-108 Zatímco celková geometrie RNase H-jako motiv na úrovni sekundární a terciární struktura byla dobře zachovaná, primární sekvence vykazovaly mnohem nižší úroveň ochrany, a pouze jeden ze tří katalytických reziduí je přítomen v aktivním místě. Zachované zbytky, aspartát, se podílí na koordinaci dvou katalytické kovové ionty v aktivním místě kanonických RNase H domén. V jedné studii mutace tohoto zbytku v Prp8 v kvasinkách nevedla k žádné detekovatelné růstové vadě, což by mohlo naznačovat redundanci nebo nedostatek kritické funkce.108 V jiné studii, jeho účinek nemůže být zkoumáno, protože mutace indukované misfolding proteinu fragment.107 oblast odpovídající aktivnímu místu domény Rnázy H nebyla pozorována žádná vazba kovových iontů, když byly krystaly pěstovány až 200 mM MgCl2, což naznačuje, že degenerované Aktivní místo postrádá schopnost vazby kovových iontů. Dále, fragment Prp8 obsahující tuto doménu ukázala velmi slabá RNA-vazebnou schopnost, s Kd 20 µM až 200 µM, v závislosti na RNA testovaných druhů.106-108 ačkoli fragment vykazoval velmi nízkou afinitu k vazebným RNA, vykazoval preferenci vazebných duplexních RNA obsahujících čtyřcestné spoje.108 v aktivovaných lidských spliceosomech se předpokládá, že U2 a U6 snRNA vytvoří takovou strukturu.53,69 Co to RNase H-jako domény zvláště zajímavé bylo, že aminokyseliny odpovídající jeho aktivní stránky jsou umístěny vedle reziduím v Prp8, které byly dříve zobrazeny zesíťovat na 5′ splice site v precatalytic spliceosomes.109 účinnost tvorby tohoto zesítění však byla snížena, jak prekatalytické spliceosomy postupovaly, aby se staly katalyticky aktivními spliceozomálními komplexy.109 pozorované snížení účinnosti zesíťování by mohlo být interpretováno tak, že naznačuje, že tato interakce je narušena u aktivovaných spliceozomů. Alternativně může interakce přetrvávat, ale tvorba samotného zesítění je zrušena kvůli malé změně prostředí zesítěných zbytků. Pokud se tento degenerovaný RNase H-like doména je skutečně umístěn v blízkosti 5′ splice site v katalyticky aktivní spliceosomes, je možné, že se může podílet na stabilizaci aktivní konformace snRNAs, umístění substrátů v aktivním místě, a/nebo koordinaci katalytické kovové ionty. Zatímco domény sám o sobě nemůže vázat RNA nebo kovové ionty, je možné, že v přítomnosti jiné aktivní prvky stránek to mohou být součástí substrátu nebo metal ion-vazebné kapsy. Přes tyto zajímavé možnosti zůstává role Prp8 v spliceozomální katalýze nejistá.