Lidské T buňky express CD25 a Foxp3 po aktivaci a vykazují efektorové/paměťové fenotypů bez jakékoliv regulační/supresorové funkce

Aktivace T buněk indukuje expresi CD25 a Foxp3 spojené s efektorové a paměťové fenotyp diferenciace

PBMC byly stimulovány bryostatin-1 (5 nM) a ionomycin (1 µM) (B/I) v přítomnosti 80 U/mL IL-2 (Peprotech) pro 16 h. Aktivace B/I napodobuje intracelulární signály, které vedou k aktivaci T buněk zvýšením aktivity proteinkinázy C a intracelulárního vápníku . Buňky byly promyty třikrát a kultivovány na 106 buněk/mL v kompletním médiu s 40 U/mL IL-2 (Peprotech) na 3 dny a exprese Foxp3 byla stanovena pomocí průtokové cytometrie analýzy. Exprese FoxP3 byla také stanovena na čerstvě izolovaných T buňkách v den 0. Jak je znázorněno na obr. 1A (horní panel), přítomnost samotného IL-2 po dobu 3 dnů významně nezvýšila expresi Foxp3 nebo CD25 nad výchozí hladiny v den 0 (obr. 1C). Aktivace B / I však indukovala expresi Foxp3 a CD25 v CD4+ a CD8+ T buňkách (obr. 1A, prostřední panel). Na B/I aktivaci CD4+CD25+Foxp3+ T buňky byly se zvýšil z 1% na 23% (P = 0.016) a CD8+CD25+Foxp3+ T buňky byly se zvýšil z 0,6% na 9% (P = 0.013). Rozšíření kultury v přítomnosti IL-2 za 6 dní, bez jakékoli další stimulace zachována CD4+CD25+Foxp3+ T buňky nad základní úrovní v neaktivované T-buněk (1% vs. 7%; P = 0, 031) vzhledem k tomu, že CD8+CD25+Foxp3+ T buněk klesla na základní úrovni (o 0,6%). Tyto výsledky naznačují, že aktivací indukovaná exprese Foxp3 v CD4+CD25+ T buňkách je stabilnější než v CD8+CD25+ T buňkách. Absolutní počet T buněk se zvýšil 3 a 6 dní po stimulaci B / I a expanzi v přítomnosti IL-2 (obr. 1B). Aktivace T buněk pomocí anti-CD3/CD28 Abs pro 3 dny vyrábí podobné výsledky jako pro B/I aktivace zvýšením CD4+CD25+FoxP3+ T buňky z 0,4% na 8,7% (Obr. 1C). Fenotypové analýzy T buněk odhalily CD44+ efektor a CD44+CD62L+ paměťové fenotypy před a 6 dní po aktivaci B/I (obr. 1D, horní panel). Zatímco efektorové CD4+ a CD8+ T buňky byly po aktivaci sníženy (18% až 9% a 21% až 13%), paměťové CD4+ a CD8+ T buňky byly zvýšeny (82% až 91% a 79% až 87%). Po aktivaci B/I vykázaly CD4+ T buňky 6násobné zvýšení exprese FoxP3 u fenotypů CD44+, CD62L+ (CD44+: 2,6% až 15%; CD62L+: 2% až 12%). Kromě toho jak CD4+, tak CD8+ T buňky vykazovaly FoxP3high expresi po aktivaci ve srovnání s expresí FoxP3low v den 0 (obr. 1D, střední a spodní panely). Všechny CD4 + Foxp3+ T buňky exprimovaly CD44, z nichž 80% také exprimovalo CD62L (obr. 1D, prostřední panel, zcela vpravo). Tyto údaje ukazují, že 20% CD4 + Foxp3+ T buněk je efektorových a 80% jsou paměťové fenotypy. Podobný fenotypový trend byl detekován pro CD8+Foxp3+ T buňky, vykazující 100% CD44+ z toho 67% byly CD62L+ T buňky (obr. 1D, spodní panel, zcela vpravo). Tyto výsledky ukazují, že 33% CD8 + Foxp3+ T buněk je efektorových a 67% jsou paměťové fenotypy. Údaje uvedené na obr. 1A-D naznačují, že zvýšená exprese FoxP3high v efektorové T buňky, byl vzhledem k diferenciaci buněk, spíše než buněčné proliferace, protože relativní procent CD44+CD62L – efektorových T-buněk klesla po B/I aktivace. Podobný mechanismus může existovat v paměťových T buňkách kvůli expresi FoxP3high po aktivaci ve srovnání s FoxP3low v den 0.

Aktivace indukované exprese FoxP3 v CD4+ T buněk nedokáže zprostředkovat regulační funkce in vitro

T-buňky byly označeny CFSE a stimulovaných anti-CD3 (1 ug/ml) a anti-CD28 (1 ug/ml) Abs v přítomnosti nebo nepřítomnosti B/I-aktivované CD4+CD25+FoxP3+ T buněk (2:1 a 20:1 odpovědi:tlumič poměry) po dobu 3 dnů. Průtoková cytometrie analýza ukázala podobné sazby šíření bránou CD8+ T buněk v přítomnosti nebo nepřítomnosti indukovatelných FoxP3+ T buněk (Obr. 2A, 60% vs. 61% a 65%). Aktivace CD3 / CD28 také indukovala expresi FoxP3 v RESPONDÉRSKÝCH CD4+ T buňkách. Gated CD4+FpxP3+ T buňky také vykazovaly 70-75% proliferaci po aktivaci (obr. 2A). Analýza apoptózy T buněk odhalila podobné míry apoptózy u T buněk reagujících na léčbu v nepřítomnosti nebo přítomnosti CD4+FoxP3+ T buněk (obr. 2B, 57% vs. 57 a 59%). Většina B/I-aktivované CD4+FoxP3+ T buněk (74-76%) bylo zjištěno, že apoptotických během anti-CD3/CD28 aktivace v co-kultury s odpovídač T-buněk.

Alogenní aktivace T-buněk v MLR indukuje exprese Foxp3 v CD4+CD25+ T buněk spojené s efektorové/paměťové fenotyp

Jsme provedli 8-denní alogenní MIR určit, zda indukci exprese Foxp3 T-buněk, byla stabilní v průběhu MIRU a zda takové indukované Foxp3+ výraz by inhibici T buněčné proliferace. Buňky reagující a stimulující byly získány od různých zdravých dárců. Stimulátor buňky byly ozářeny (5000 rad) a kultivovány s odpovědí buňky na 8 dní v přítomnosti 10 µM BrdU (BD Pharmingen). Buňky byly poté obarveny příslušným Abs a podrobeny analýze průtokové cytometrie. Jak je znázorněno na obr. 3A (horní panel) 86% CD4+CD25+ T buněk a 93% z CD8+CD25+ T buněk, ukázala, inkorporace BrdU v důsledku buněčné proliferace. U samotných buněk reagujících na léčbu nebo stimulátorů nebyla zjištěna žádná proliferace (údaje nejsou zobrazeny). Takové alogenní šíření konala v přítomnosti aktivace indukované exprese Foxp3 v CD4+ T-buněk tak, že 8% CD4+ T buňky CD25+Foxp3+ (Obr. 3A, spodní panel). CD8+CD25+ T buňky na druhé straně nevykazovaly stabilní expresi Foxp3. Tyto výsledky jsou v souladu s naším pozorováním na obr. 1 ukazuje, že exprese Foxp3 v CD4+ T buňkách je stabilnější než exprese v CD8+ T buňkách 6-8 dní po aktivaci T buněk. V předchozích zprávách, supresivní testy in vitro byly provedeny v přítomnosti vysokým poměrem CD4+CD25+ T buněk (Tregs) odpovídač buňky, určit supresivní funkce na aktivaci T buněk a proliferaci. Takové umělé zvýšení poměru CD4+CD25+ T buněk k odpovědi buňky by snížení in vivo validita pozorování. Frekvence CD4 + CD25+Foxp3+ T buněk indukovaná během MLR byla 8%, což je považováno za fyziologicky relevantní rozmezí, jak uvádí jiné skupiny . Frekvence přirozeně se vyskytujících Tregů u myší je také kolem tohoto rozmezí, přesto má regulační účinky na inhibici autoimunity. Pokud Foxp3 exprimující CD4+ T buňky měly nějakou regulační funkci, měly inhibovat buněčnou proliferaci během kultivace in vitro. Podobně jako B / I-indukovaná aktivace T buněk, fenotypy T buněk v MLR zahrnovaly CD44+ efektor (16%) A CD44+CD62L+ paměťové T buňky (84%) (obr. 3B). Opět všechny CD4+Foxp3+ T buňky exprimovaly CD44, z nichž 90% také exprimovalo CD62L (obr. 2B). Tyto údaje ukazují, že 10% CD4 + Foxp3+ T buněk je efektorových a 90% jsou paměťové fenotypy. Podobný fenotypový trend byl detekován pro CD8 + Foxp3+ T buňky, vykazující 100% CD44+ z toho 76% byly CD62L+ T buňky. Tyto výsledky ukazují, že 24% CD8 + Foxp3+ T buněk je efektorových a 76% jsou paměťové fenotypy. Nedostatek regulační funkce v těchto Foxp3+ T buněk může být z důvodu jejich efektorové/paměťové fenotyp, neboť bylo zjištěno, že exprese Foxp3 v lidské paměti T-buněk za následek snížené supresorovou aktivitu . Kromě toho buňky Treg typu 1 (Tr1) poskytují supresorovou funkci v nepřítomnosti exprese FoxP3 . Vzhledem k roli Foxp3 jako hlavní regulátor Treg linie, nasazení a údržba v myši , nezdá se, že mít takové dobré víře regulační funkce pro Treg lineage závazek v lidských T buňkách.