4.3 BBB-přechod bsAbs navržen s jedné domény protilátky
sdAbs jsou malé (15 kDa), monomerní antigen vázající fragmenty protilátek, které poskytují různé výhody oproti jiným fragmentů protilátek jako „stavební bloky“ pro bsAbs. Oni se vyskytují v přírodě jako antigen vázající části těžkého řetězce protilátek v camelid druhů (tzv. VHH) a paryby (tzv. VNAR) nebo mohou být generovány z konvenční Igg získáním nebo strojírenství monomerní, stabilizovaný VH nebo VL domén (Hamers-Castermana et al., 1993; Husák a spol., 2012; Kim et al., 2014; Nuttall, 2012; Ward, Güssow, Griffiths, Jones, & Winter, 1989). sdAbs jsou vysoce stabilní a kompaktní a mají přístup k zapuštěné epitopů na bílkoviny, jako je například receptor dutin nebo do aktivních míst enzymů, které jsou často „skryté“ z konvenčních Igg a může dosáhnout cílové vazebné afinity srovnatelné konvenční protilátky (Lauwereys et al., 1998; Staus et al., 2014). Tyto monomerní antigen-vazebné jednotky nemají páru s lehkých řetězců, které je vynikající stavební bloky pro heterodimerized bsAbs, jak se vyhnout potížím nesprávné světlo-řetězové párování (Hamers-Castermana et al., 1993; Saerens, Ghassabeh, & Muyldermans, 2008). Heterodimerní bsab mohou být vytvořeny s jedním nebo oběma „rameny“ sdAb, které mají podobnou strukturu jako protilátky s těžkým řetězcem velbloudů (obr. 3E). sdab lze také použít v různých mono-, bi-nebo čtyřmocných fúzích s konvenčními terapeutickými protilátkami nebo Fabs (obr. 3E), obecně vyplývající v menších, méně složitých molekul, ve srovnání s těmi, které jsou generovány s scFvs nebo funkčních Bloků vzdušného prostoru jako stavební bloky, které mají tendenci být biophysically dobře vychovaný a snadné vyrobit (Holliger & Hudson, 2005). Humanizace vhhs i inženýrství sdAbs je dobře popsána, což umožňuje snadno generovat lidské (ized) sdab s optimální cílovou afinitou a výjimečnými biofyzikálními vlastnostmi (Vincke et al ., 2009).
vyhodnotit potenciál využití camelid VHH FC5 jako BBB nosič rámci bispecifické CNS-cílení protilátky, monovalentní a bivalentní fúze (N – a C-terminus) FC5 s lidskou Fc byly navrženy a hodnoceny in vitro a in vivo (Farrington et al., 2014). Zdánlivá vazebná afinita (Kdapp) k bivalentní fúzi FC5Fc u potkanů byla 75 nM, zatímco monovalentní vazba FC5Fc byla v mikromolárním rozmezí. Analýzy zřejmé, převtělování sazby (Papp), přes in vitro BBB model, zjevné CNS expozice odvozen z sérum/CSF farmakokinetiku systémově podávány protilátky vytvoří, a farmakologické odpovědi vyvolané chemicky konjugované BBB-nepropustné neuroaktivní peptidy v Hargreaves bolest model, za předpokladu, že důkazy, posílené BBB dopravy z těchto velkých (75 kDa) protilátek molekuly zprostředkované FC5: (1) in vitro byly hodnoty Papp ~ 200 cm/min pro oba mono – a bivalentní N-terminální Fc fúzní molekuly (FC5Fc) ve srovnání s 4-8 cm/min pro kontrolu VHH A20.1Fc nebo EG2Fc fúzí; (2) zjevná CNS expozice FC5Fc fusion byl 30-krát vyšší ve srovnání s kontrolou domény protilátky–Fc fúzí; (3) systémová farmakologická potence FC5Fc konjugáty s neuropeptidy dalargin nebo galanin v Hargreaves modelu zánětlivé bolesti byly až 60-krát vyšší ve srovnání s monomerní FC5–neuropeptid konjugátů. Tento výsledek byl přičítán dlouho oběhové poločas (~ 96 h) FC5Fc– ve srovnání s FC5–neuropeptid konjugátů; (4) různé kontrolní VHH–Fc neuropeptid konjugáty neprokázaly žádné systémové účinnost; (5) fúze FC5 s C-koncem Fc vedla k oslabené kapacitě křížení BBB. Na rozdíl od TfR-cílení BBB-nosiče protilátek, a to jak mono – a bivalentní FC5Fc fúzní proteiny vykazovaly podobnou míru transcytosis in vitro, podobné plazmová/CSF farmakokinetické profily, a podobné systémové energie v farmakodynamika modelu in vivo, i přes zjevné rozdíly v vazebnou afinitu a valenční (Farrington et al., 2014). Tyto studie prokázaly, že BBB-přechod jedné domény protilátky FC5 může být použit jako platforma BBB nosič v obou, heterodimerized „půl-protilátky“ a jako více snadno škálovatelné bi – nebo čtyřmocné fusion konvenční Igg (Farrington et al., 2014).
Další potenciální výhodou VHHs jako BBB nosičů je jejich přirozená odolnost vůči extrémním biofyzikální problémy, jako je teplota a pH, stejně jako proteázy degradace (Kim et al., 2014), často se vyskytující v různých endocytárních kompartmentech během transkytózy. FC5 i FC5Fc fúze jsou internalizovány do BEC přes klatrinem potažené vezikuly a jsou řazeny do časných endozomů. Zajímavé je, FC5 bylo také zjištěno, že stimuluje vylučování extracelulární microvesicles (exosomy) z BEC (Haqqani, Caram-Salas, et al., 2013; Haqqani, Delaney a kol., 2013), ve kterém byly detekovány jak FC5, tak zvýšené hladiny jeho domnělého receptoru Cdc50A Western blot a cílená hmotnostní spektrometrie. Tato studie naznačila, že přístřešek exosomy mohou být konečné váček z RMT cesta propuštěn z abluminal povrch nesoucí receptor-protilátka komplexu (schematicky znázorněno na Obr. 4). Cesta RMT a tvorba exosomu sdílejí některé pozoruhodné podobnosti. Jak je uvedeno v první objev exosomy, anti-TfR protilátek byla sledována pomocí elektronové mikroskopie v retikulocytů (Théry, 2011) z povrchu buňky, do clathrin-coated pits, uvnitř brzy endosomes, na povrchu vnitřních váčků z multivesicular endosomes a konečně propuštěn exosomy po fúzi multivesicular endosomes s plazmatickou membránou (Obr. 4). RMT objeví se odvíjí v podobné módě a BEC extracelulární microvesicles bylo prokázáno, že obsahují několik receptorů je známo, že nosit makromolekul přes HEB pomocí RMT, včetně TfR, LRPs, LDLR a IR (Haqqani, Delaney, et al., 2013).
Z popsaných studií, mělo by být zřejmé, že BBB nosič ruku CNS-cílení bsAb vyžaduje pečlivou optimalizaci pro každý RMT receptor. Důležité úvahy při tvorbě CNS-cílení bsAbs jsou popsány níže v zobrazení „ponaučení“ z TfR-BACE1 bsAb rozvoj a z vlastní práce s FC5 jako BBB-nosiče protilátek.