Biotin a jeho vazebného partnera avidinu jsou dnes běžně používané v molekulární biologii pro řadu různých technik a protokolů. V tomto příspěvku budeme diskutovat o přirozené roli biotinu, biotinylace, objev interakce biotin-avidin a využití biotinylace v molekulární biologii!
Dozvědět se o in vivo biotinylation bakteriální syntézy proteinů,
Biotin je nezbytný vitamin pro život
i když biotin je nejvíce obyčejně známý pro jeho roli v molekulární biologii, biotin (Vitamín H nebo Vitamín B7) je první základní koenzym, který je vyžadován u všech organismů pro život. Biotin je syntetizován pouze rostlinami, většinou bakterií a některými houbami, takže savci musí získat vitamín prostřednictvím vnějších zdrojů. Lidé absorbují většinu biotinu, který potřebují, v tenkém střevě z mikroflóry, která tam sídlí.
Biotin je kofaktor, který se ve své aktivní formě je kovalentně připojen na aktivní místo klíčových metabolických enzymů včetně biotin carboxylase a decarboxylases. Tyto enzymy katalyzují přenos karboxylových skupin na organické kyseliny za vzniku důležitých buněčných metabolitů. Biotin působí jako karboxylový nosič z jedné sloučeniny na druhou. Tyto enzymy závislé na biotinu jsou nezbytné pro procesy, jako je glukoneogeneze, lipogeneze, metabolismus aminokyselin a přenos energie.
Biotinylace je obecný proces, kterým se biotin přidává do proteinu nebo makromolekuly. Biotin může být přidán enzymaticky nebo chemicky. Enzymatická biotinylace se přirozeně vyskytuje v buňkách a je to proces, při kterém je biotin kovalentně vázán na specifický lysin v aktivním místě nově syntetizovaného enzymu. Biotin proteinová ligáza (BPL) je zodpovědná za tuto vysoce specifickou posttranslační modifikaci proteinů. Většina organismů má v celém proteomu méně než pět enzymů, které jsou biotinylovány. Například v E. coli je BPL, BirA, zodpovědný za biotinylaci pouze jednoho lysinu v celém organismu na proteinu biotinkarboxylového nosiče (BCCP).
Objev biotin-avidin interakce
V pozdní 1930 bylo pozorováno, že zvířata krmena stravě, a primárně bílky by vyvinout kožní léze a další hrozné zdravotní problémy. Toto onemocnění bylo nazýváno „poškození vaječného bílku“ a bylo zjištěno, že je způsobeno nedostatkem vitaminu H později přejmenovaného na vitamín B7 / biotin. Zranění vaječného bílku by tato zvířata sužovalo, i kdyby byla jejich strava doplněna biotinem. Něco ve vaječném bílku tedy vylučovalo biotin z absorpce. V roce 1940 byl Esmond e. Snell schopen vyčistit protein zodpovědný za vazbu biotinu, avidinu. Avidin byl příhodně pojmenován pro kuře, „ptačí“, vejce, ze kterého bylo očištěno. Snell později potvrdil, že avidin byl skutečně viníkem poškození vaječného bílku krmením potkanů vyčištěných avidinem (Kresege et al ., 2004). Avidin je glykoprotein, který se skládá ze čtyř identických podjednotek, z nichž každá může vázat jednu molekulu biotinu.
Biotin a avidin mají extrémně silnou afinitu k sobě navzájem. Ve skutečnosti je vazba mezi nimi jednou z nejsilnějších nekovalentních interakcí protein-ligand v přírodě. Jakmile je vazba vytvořena, není ovlivněna změnami pH, teploty nebo organických rozpouštědel.
použití biotinu v molekulární biologii
Biotin je relativně malá, ve vodě rozpustná molekula, která neinterferuje s makromolekuly, do kterých se přidává. Biotin má také exponovaný boční řetězec, který lze snadno manipulovat, aby se vytvořily reaktivní druhy bez ovlivnění vazebného místa avidinu. Se všemi těmito vlastnostmi není divu, že vědci začali využívat biotin a jeho silnou interakci s avidinem pro účely molekulární biologie a biotechnologie.
Jakmile je polypeptid biotinylated (více o tom níže), může být inkubovány nebo co-vyjádřil s avidin nebo strukturálně podobný protein, který byl objeven v roce 1960, strepavidin. Komplex Biotin-avidin pak může být použit a / nebo manipulován pro zamýšlený účel vědce. Dvě z nejčastějších použití biotinylace v laboratoři jsou experimenty s purifikací proteinů a imunoprecipitací. Biotinylované proteiny nebo komplexy lze snadno čistit pomocí sloupců nebo kuliček, které jsou potaženy avidinem.
interakce biotin-avidin byla také upravena pro použití v imunohistochemii a označování protilátek. V těchto experimentech se biotin přidává k primární nebo sekundární protilátce, která cílí na váš požadovaný protein nebo primární protilátku. Avidin navázaný na reportéra se pak přidá k reakci pro snadnou detekci. Vícenásobná vazebná místa biotinu nalezená na avidinu jsou také ideální pro zesílení signálu během těchto experimentů. Během detekce může být do vzorku přidán biotinylovaný reportér enzym, který je před inkubován s volným avidinem. Všechna volná místa vázající biotin v tomto komplexu se mohou vázat na vaši biotinylovanou protilátku. To vytváří velké mřížoviny biotin-avidin komplexy vázané na bílkovinu zájmů, což vede k zesílení reportér signál a snadnější detekci. Tato strategie se označuje jako Avidin-Biotinový komplex (ABC) imunohistochemie (IHC). Další informace o ABC a IHC naleznete v příručce Thermo Fisher Scientific.
existuje řada dalších aplikací molekulární biologie pro biotin a avidin. Krátký seznam některých dalších běžných aplikací a odkazy na příslušné příspěvky a webové stránky jsou uvedeny níže.
- EMSA (Electrophoretic Mobility Shift Assays)
- ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay)
- Southern/Northern Blotting
- Cell surface labelling
- Attaching polypeptides to a substrate
- Flow cytometry/fluorescence-activated cell sorting (FACS)
- In situ hybridization
Methods for biotinylating your macromolecule of interest
To utilize the natural binding of biotin a avidin, makromolekuly, které jsou předmětem zájmu, musí být nejprve biotinylovány. Vědci vyvinuli několik metod chemicky biotinylovat makromolekuly, které jsou zajímavé jak in vitro, tak in vivo.
Biotinylation činidla:
Biotin je vystaven postranní řetězec může být cross-spojeny aminokyseliny funkční skupiny in vivo prostřednictvím specializovaných chemických látek (biotinylation činidla). Existují různé biotinylation činidla k dispozici, které se liší ve funkčních skupin nebo zbytky, že cíl, stejně jako jejich rozpustnost a tím i různých činidel jsou užitečné pro biotinylation v různých mikroprostředí. Existují také reverzibilní a štěpitelná biotinylační činidla, která pomáhají při specifickém eluci biotinylovaných proteinů. Pro pomoc při určování, které biotinylační činidlo použít, podívejte se na nástroj pro výběr Biotinylačního činidla Thermo Fisher Scientific.
AviTag a BirA:
proteiny mohou být také biotinylovány využitím specificity e.coli BPL, BirA. Pokud si vzpomínáte, Bira biotinyluje pouze jeden lysin v celém proteomu E. coli. Na základě těchto znalostí vědci identifikovali sekvenci 13 aminokyselin potřebnou pro rozpoznávání a biotinylaci BirA. Tato 13 aminokyselinová sekvence se nazývá AviTag. Pomocí Avitagu lze označit zajímavý protein biotinem jednoduše vytvořením fúze, ve které se AviTag přidává buď k n nebo C konci proteinu. Bylo prokázáno, že přípravek BirA účinně biotinyluje proteiny exprimující AviTag v buňkách bakterií, kvasinek, hmyzu a savců. Podívejte se na Kay et al., 2009 pro metody biotinylace proteinů s Birou.
plazmidy, které obsahují AviTag i BirA, najdete v Addgene!
Oligonukleotid Označení:
Biotin mohou být přidány buď konečná sekvence DNA v Polymerázové Řetězové Reakci (PCR) pomocí biotinylated primer. Biotin může být také enzymaticky začleněn během PCR pomocí biotinu označeného dUTP. Existuje několik typů biotinových štítků, které lze přidat k oligonukleotidu v závislosti na vaší následné aplikaci. Biotin značené oligonukleotidy mohou být použity v mnoha aplikacích, včetně, ale bez omezení na In situ hybridizace, savý (Severní a jižní) a afinitní vazba.
Fotobiotinylace:
Fotobiotin lze použít k neselektivnímu označování DNA a RNA. Fotobiotin acetát se skládá z molekuly biotinu připojené k fotoreaktivní arylazidové skupině. Za silného viditelného světla se arylazidová skupina stává reaktivní a tvoří vazbu s blízkými nukleovými kyselinami (McInnes et al ., 1990). Fotobiotinylace je někdy jednodušší a levnější než jiné enzymatické metody. Vědci běžně používají tuto metodu k připojení proteinů nebo polypeptidů k pevnému substrátu (Holden a Cremer, 2003).
1. Chapman-Smith, A., & Cronan, J. E. „Molekulární Biologie Biotin Připevnění na Proteiny; Sympozium: Výživa, Biochemie a Molekulární Biologie Biotin“ J. Nutr, 129 (2009a): 477-484. Diváci: 10064313.
2. Chapman-Smith, a., & Cronan, je “ enzymatická biotinylace proteinů: posttranslační modifikace výjimečné specificity.“Trendy v biochemických vědách, 24.9 (1999b): 359–363. PubMed PMID: 10470036.
3. Řekl, H. M. “ Biotin: zapomenutý vitamin.“American Journal of Clinical Nutrition 75.2 (2002): 179-180. PubMed PMID: 11815306.
4. Nicole Kresge, R. D. S. and R. L. H. “ The Discovery of Avidin by Esmond e. Snell.“J Biol Chem 279.e5 (2004). PubMed PMID: 20353954.
5. Kay, B., Thai, s., & Volgina, v. „vysoce výkonná Biotinylace proteinů.“Metody Mol Biol, 498 (2009): 185-196. PubMed PMID: 18988027. PubMed centrální PMCID: PMC3223083.
6. McInnes, J. L., Forster, A. C., Skingle, D. C., & Symons, R.H. „příprava a použití fotobiotinu.“Metody v enzymologii 184 (1990): 588-600. PubMed PMID: 2388593
7. Holden, Ma, & Cremer, P. S. “ světlo aktivované vzorování molekul značených barvivem na površích.“Journal of American Chemical Society 125.27 (2003): 8074-8075. PubMed PMID: 12837056.
8. Pan, J. feng, Liu, n. hua, Shu, l. yuan, & Sun, h. “ aplikace technologie avidin-biotin ke zlepšení adheze buněk na nanovlákenných matricích.“Journal of Nanobiotechnology 13.1 (2015): 1–14. Diváci: 25980573. PubMed centrální PMCID: PMC4461904.
9. Huang, Q, Mao, Z., Li, S., Hu, J., & Zhu, Y. „non-radioaktivní metoda pro malé detekce RNA northern blotting.“Rýže 7.1 (2014): 1-7. Diváci: 26224555. PubMed centrální PMCID: PMC4884002.
10. Boer, e. de, Rodriguez, P., Bonte, e., Krijgsveld, J., Katsantoni, e., Heck, a., … Strouboulis, J. “ efektivní biotinylace a jednostupňové čištění značených transkripčních faktorů v savčích buňkách a transgenních myších.“PNAS 100.13 (2003): 7480-5. PubMed PMID:12802011. PubMed centrální PMCID: PMC164612.
11. Liou, Y. – R., Wang, y. – h., Lee, C. – Y., & Li, P.-C. „vztlakem aktivované třídění buněk pomocí cílených Biotinylovaných mikrobublin albuminu.“PLoS ONE 10.5 (2015). PubMed PMID: 25993512. PubMed centrální PMCID: PMC4439073.
12. Ludvík, L. B., Hughes, B. J., & Schwartz, S. a. „Biotinylated sondy v electrophoretic mobility shift assay zkoumat konkrétní dsDNA, ssDNA nebo RNA–protein interakce.“Výzkum Nukleových Kyselin, 23.18 (1995): 3792-3793. Diváci: 7479014. PubMed centrální PMCID: PMC307283.
13. Howarth, m., & Ting, a.Y. “ zobrazovací proteiny v živých savčích buňkách s biotin ligázou a monovalentním streptavidinem.“Nature Protocol 3.3 (2008): 534-545. PubMed PMID: 18323822. PubMed centrální PMCID: PMC2671200.
14. Bloch, B. “ Biotinylované sondy pro in situ hybridizaci histochemie: použití pro detekci mRNA.“Journal of Histochemie a Cytochemie : Úřední Věstník Histochemie Společnosti, 41.12 (1993): 1751-1754.PubMed PMID: 8245422.
Další zdroje na Addgene blog
- In vivo biotinylation bakteriální syntézy proteinů
- Naučte se, jak biotin se používá v Split-BioID: zlepšené metody pro studium protein-protein interakce
- Naučte se, jak biotin může být použit s CRISPR