RNases jsou jako záporák super-hrdinové mezi laboratorní enzymy. Jsou všemocní, destruktivní a zdánlivě nezničitelní.
je To proto, že byly vytvořeny zlé vládce, za jediným účelem, aby život obtížný pro odvážní vědci, kteří bojují každý den, aby produkovat vysoce kvalitní, neporušené RNA preps.
Ok, dělám si legraci z části overlords. Ale proč mají RNases všechny ty supervelmoci? A co můžete udělat, abyste je porazili? Pojďme to zjistit.
supervelmoci RNáz, vysvětleno.
Rnázy jsou všemocné
to je pravda. Rnázy se nacházejí ve všech typech buněk a organismech od prokaryot po eukaryoty. jsou všude. To je jeden z hlavních důvodů, proč jsou v laboratoři takovým problémem. Vznášejí se ve vzduchu, na každém povrchu vašeho těla. Což znamená, že kontaminují vše, čeho se vzduch nebo jakýkoli povrch vašeho těla dotkl. Což je v podstatě všechno. Také zejména Rnáza a velmi silně adsorbuje na sklo, takže je ještě těžší ji odstranit z lahví atd.
Rnázy jsou vysoce destruktivní
Rnázy mají obecně velmi vysokou specifickou aktivitu vůči svému substrátu (RNA). To znamená, že nejmenší množství Rnázy může snadno prorazit vaše vzácné prepy RNA. Mimochodem, to je také jeden z důvodů, proč rnáza (Rnáza A) byla prvním enzymem, který měl odvozený mechanismus katalýzy (Findlay et al 1962).
RNases jsou Zdánlivě Nezničitelný
Se zobrazí jako Fénix zotavení po autoklávování
Convential moudrost říká, že pokud vás autoklávu RNases, že denaturovat, ale pak renature a znovu získat dílčí funkce po ochlazení. Tento úžasný, legendární odvaha je povolen série intramolekulární disulfidové vazby, které udržují strukturu nedotčenou, a to i po vodíkové vazby, které normálně držet 3D struktury proteinů v místě jsou rozbité. Stejně jako všechny bajky je to do jisté míry pravda. Ale čtěte dál a zjistíme, že tato konkrétní supervelmoc byla medializována spinovými lékaři v RNase Baddies Inc.
ani EDTA je nemůže zastavit!
na Rozdíl od jiných nukleázami, mnoho RNases nevyžadují kovové ionty za katalýzy, protože používají 2-prime hydroxylovou skupinu RNA substrátu jako reaktivní druhy Tak jednoduše přidáním TE neinhibuje nich, jako by pro DNA-zvykal nukleázami.
Jak porazit zlé Rnázy
netrap se, kolega vědec. Rnázy mohou být impozantní nepřátelé, ale mají slabiny, které můžeme využít.
kopněte je do H
Rnázy se spoléhají na zbytky histidinu ve svém aktivním místě pro katalýzu. Diethylpyrokarbonát (DEPC), který je alkylačním činidlem specifickým pro histidin, je může inaktivovat. Autoklávování pak odstraní DEPC, aby se zabránilo alkalyaci jakýchkoli jiných proteinů ve vás nebo ve vašich vzorcích.
autoklávování funguje, do té míry
tolik legendární nezničitelnost RNáz tváří v tvář autoklávování je v jádru pravda, ale také velmi přehnaná, jak jsem zmínil výše. Pěkná malá studie od společnosti Ambion ukázala, že Rnázy (nebo alespoň Rnáza A) nejsou zcela odolné vůči autoklávování. Spíše je jejich aktivita decimována autoklávováním, ale malá část aktivity Rnázy zůstává po autoklávování.
ale pokud samozřejmě malé množství Rnázy má stále hodně RNA žvýkací síly. To znamená, že rutinní autoklávování jako součást dekontaminačních postupů Rnázy je určitě užitečné – je to jen to, že se na něj nemůžete spolehnout, abyste odstranili veškerou aktivitu.
nemohou vydržet (suché) teplo
zatímco mokré teplo (autoklávování) částečně ničí Rnázy, není naděje, že vydrží suché teplo. Suché teplo oxiduje Rnázy-jakýkoli jiný protein, bez ohledu na to, jak robustní jsou. Takže pro čištění skla, pár hodin při 180 degC by to mělo udělat.
Chemical warfare
pro čištění povrchů Rnázy, tak robustní, jak jsou, nemohou vydržet věci jako peroxid vodíku, silné kyseliny/báze, Trizol atd. To vše se běžně používá k odstranění i těch nejtěžších RNáz.
kryptonit pro Rnázy: Inhibitory
snad nejlepší zbraní, kterou máme v naší zbrojnici proti Rnázám, jsou inhibitory Rnázy. Nejčastěji jsou komerčními inhibitory Rnázy verze inhibitoru placentární ribonukleázy (RI). Jako někdo, kdo se rok snaží zdokonalit RNA in situ hybridizace bez pomoci inhibitoru Rnázy (kvůli falešné ekonomice mým šéfem!), Vím, jak dobrý je tento kryptonit Rnázy. Jeden mikrolitr RI a najednou moje experimenty začaly fungovat.
já říkám, že to je nejlepší zbraň v naší zbrojnici proti RNases, protože na rozdíl od všech ostatních řešení uvedené výše, RNase inhibitory jsou specifické, takže lze (obecně), dát je tam, kde se to počítá ve svém workflow a získat ochranu, kterou potřebují od zla. Nebuďte bez těchto věcí, pokud pracujete s RNA.
pomohlo vám to? Pak prosím sdílejte s vaší sítí.