Rozmanité motiv komplety zadat, non-redundantní DNA vazebné aktivity AP-1 členů rodiny v makrofázích

Statistické analýzy

Na Obr. 1c, rozdíly v genové expresi byly testovány pomocí nezávislého t-testu (stupeň volnosti = 1, dvouocasý) na dvou replikačních experimentech (n = 2). Odlišně exprimované geny na obr. 1b byly identifikovány pomocí EdgeR55 s výchozími parametry a pomocí cut offs FDR < 0.05 a log2 násobná změna ≥2. Na Obr. 2c, rozdíly mezi jednotlivými skupiny (Veh, Sdílené, a KLA 1 h) byly zkoumány pomocí nezávislého T-testu (stupeň volnosti = 1, two-tailed); o počet míst v každé skupině pro každou monomeru jsou následující ATF3 (Veh = 1447, Společná = 7460, KLA = 6997), Jun (2390, 3751, 3401), JunD (1351, 5976, 6422). Význam Pro Motivy na obr. 4a byla vypočtena s použitím koeficientu pravděpodobnosti test (stupeň volnosti = 1) porovnání předpovědi z plné TBA model a rozrušený TBA model ve všech lokusech vázán v Veh léčených makrofágy pro Atf3 (n = 23,160), Jun (n = 15,548), a JunD (n = 19,653). Význam Pro Motivy v doplňkovém obr. 4C byla vypočtena s použitím koeficientu pravděpodobnosti test (stupeň volnosti = 1) porovnání předpovědi z plné TBA model a rozrušený TBA model ve všech lokusech vázán JunD v GM12878 (n = 7451), H1-embryonálních kmenových buněk (n = 12,931), HepG2 (n = 41,318), K562 (n = 47,477), a SK-N-SH (38,960). Význam Pro Motivy na obr. 5b, Doplňkový obr. 5B a doplňkový obr. 5C byla vypočtena s použitím koeficientu pravděpodobnosti test (stupeň volnosti = 1) porovnání předpovědi z plné TBA model a rozrušený TBA model ve všech lokusech vázán v KLA léčených makrofágy pro Atf3 (n = 36,745), Jun (n = 17,481), JunD (n = 31,641), Fos (n = 24,365), Fosl2 (n = 10,619), a JunB (n = 13,376). Hodnoty významnosti pro obr. 6f a S6F byly vypočteny pomocí F-testu; počet loci analyzovány pro monomery v léčených vehikulem makrofágy jsou ATF3 (n = 4163), Jun (n = 3004), a JunD (n = 4148); počet loci analyzovány pro monomery v KLA-ošetřené makrofágy jsou: Atf3 (n = 4577), Jun (n = 3232), JunD (n = 4366), Fos (n = 4477), a JunB (n = 3616).

Generování vlastní genom pro BALB/cJ

vlastní genom pro BALB/cJ tím, že nahradí invariantní pozice mm10 genomu alely uvádí Myší Genom Project (verze 3 VCF)43. Pro C57BL / 6J byl použit referenční genom mm10 z prohlížeče genomu UCSC. Umožnit srovnání mezi BALB/cJ a C57BL/6J během analýzy, souřadnice pro vlastní genom pro BALB/cJ byla posunuta, aby odpovídala pozice mm10 referenčního genomu pomocí MARGE34. Neanalyzovali jsme žádné čtení, které spadalo do delecí v BALB / cJ. Čtení, která se překrývají s vložením, byla přiřazena k poslední překrývající se poloze v referenčním kmeni.

Analýza ChIP-seq vrcholy

Sekvenování čte z ChIP-seq experimenty byly mapovány na mm10 shromáždění myši referenční genom (nebo BALBc/J vlastní genom) pomocí nejnovější verze Bowtie2 s default parameters56. Mapovány ChIP-seq čte identifikovat domnělé TF vazebná místa s HOMER57 příkazu findPeaks (s parametry -velikost 200 -L 0 -C 0 -fdr 0.9), pomocí vstupního Čipu experiment odpovídající léčbu stavu. Abychom snížili počet falešně pozitivních vrcholů, vypočítali jsme IDR na každém vrcholu (pomocí verze 2.0.3 idr program) s HOMER vrchol skóre vypočítat pro každé opakování experimentu jako vstup do IDR a poté se filtruje všechny vrcholy, které měl IDR ≥ 0.0558. De novo motivy byly vypočteny s Homerem findMotifsGenome.pl příkaz s výchozími parametry. Obohacení de novo motivů bylo vypočteno pomocí findKnownMotifs.pl program v Homeru s výchozími parametry.

Kvantifikaci RNA výraz čte generované z RNA-seq experimenty byly zarovnány mm10 myši referenční genom (nebo BALBc/J vlastní genom) pomocí HVĚZDIČKOVÝ vyrovnávač s default parameters59. Kvantifikovat úroveň exprese každého genu, vypočítali jsme RPKM se čteními, která byla v exonu. Osn-normalizované sekvenování čte byly použity k identifikaci rozdílně vyjádřené geny s EdgeR55; jsme za to geny s FDR < 0,05 a změny v expresi mezi dvěma experimentální podmínky dvojí nebo větší rozdílně vyjádřen. Kvantifikovat expresi rodící RNAs jsme komentovaný naše ChIP-seq vrcholů s počtem GRO-seq čte (normalizovaný na 10 milionů), které byly v rámci 500 bps vrcholu center pomocí HOMER annotatePeaks.pl příkaz.

TBA model training

pro každý monomer AP-1 za každého léčebného stavu jsme vyškolili model pro rozlišení vazebných míst pro každý monomer od sady náhodně vybraných genomických lokusů. Sada náhodné pozadí loci zvyklí trénovat každý model byl vybrán podle následujících kritérií: (1) GC obsah, distribuci pozadí loci odpovídá GC obsah vazebných míst pro daný monomeru, a (2) neobsahují žádné nejednoznačné nebo unmappable pozice, a (3) počet pozadí sekvence odpovídá počtu vazebných míst. k. Pro každou sekvencí v kombinované sady vazebných míst a pozadí loci, jsme vypočítali nejvyšší log-odds skóre (také odkazoval se na jako motiv skóre) pro každý n motivy, které budou zahrnuty v model60 Motiv zápasy v oba směry byly považovány za. Skóre Log-odds méně než 0 bylo nastaveno na 0. Za standardní postupy předzpracování před tréninkem lineární model, jsme standardizovaných log-odds skóre pro každý motiv, škálování sada skóre pro každý motiv tak, aby střední hodnota je 0 a rozptyl je 1. Normalizace váhy skóre pro všechny motivy na stejný rozsah (déle motivy mají větší maximální skóre) a také pomáhá snížit účinek multi-kolinearita na modelu školení. A tak, funkce používané pro trénink našeho modelu je matice n x 2k skóre log-odds standardizovaných v každém řádku. Generovat odpovídající pole štítků, jsme přiřadili každé vazebné místo štítek z 1 a každé pozadí loci štítku 0. Pomocí této funkce matrix a label pole, trénovali jsme vah pro každý motiv pomocí L1 penalizován modelu logistické regrese jak je provádí scikit-learn Python package61. Váhy Motif uvedené v naší analýze jsou průměrné hodnoty v pěti kolech křížové validace s použitím 80% údajů pro trénink a 20% pro testování v každém kole. Modely byli vyškoleni pro Čip-seqs získané v této studii, stejně jako data stažena z NCBI Gene Expression Omnibus (přístupové číslo GSE46494) a KÓDOVÁNÍ dat portálu (https://www.encodeproject.org).

Kvantifikace více kolinearity

posoudit rozsah multi-kolinearita v motivu skóre funkce jsme byli zvyklí trénovat našich modelů, jsme se každý prvek matice odpovídající každému experimentu a vypočtené hodnoty VIF pro jednotlivé motif38. Pro výpočet VIF nejprve určíme koeficient určení, R2, pro každý motiv regresí skóre log-odds pro jeden motiv proti skóre log-odds zbývajících motivů. Dále pomocí koeficientu určení lze toleranci pro každý motiv vypočítat jako rozdíl mezi 1 a koeficientem určení (1-R2). Vif je reciproční tolerance \(\frac{1}{{1-R^2}}\). Pro výpočet koeficientu určení jsme použili modul linear_model balíku Sklearn Python.

Motiv seskupování a slučování

zaznamenal podobnost všech párů DNA sekvence motivy pomocí výpočtu Pearsonova korelace vyrovnané poloze pravděpodobnost matice (PPMs) odpovídající dané dvojici motifs62. Pearson korelace pro dvojice motivy a a B o délce já se vypočítá pomocí vzorce:

PPMs byly nejprve zarovnány pomocí Smith–Waterman zarovnání algorithm63. Kratší motivy jsou před zarovnáním polstrovány hodnotami frekvence pozadí. Mezery v zarovnání nebyly povoleny a každá pozice v zarovnání byla skórována Pearsonovou korelací. Pearsonova korelace byla poté vypočtena pomocí optimálního zarovnání. Další, sady motivů, které mají PPMs s Pearson korelace 0.9 nebo vyšší byly sloučeny do iterativně zarovnání každého PPM v nastavení, a pak v průměru nukleotidových frekvencí v každé poloze.

posouzení významnosti motivů pro TBA

hodnoty p pro TBA byly vypočteny pomocí testu poměru log-věrohodnost. Každý motiv byl odstraněn ze sady funkcí používaných k trénování narušeného modelu TBA (pomocí pětinásobné křížové validace). Poté jsme použili úplný model (obsahující všechny motivy) a rozrušený model pro výpočet pravděpodobnosti pozorování vazby na všech vazebných místech a sekvencích pozadí pro daný monomer a všechny oblasti pozadí. Rozdíl v pravděpodobnosti vypočtený úplným modelem a rozrušeným modelem byl poté použit k provedení testu chí-kvadrát pro každý motiv. Test chí-kvadrát byl proveden pomocí scipy python package64.

porovnání s jinými metodami

BaMM motif a gkm-SVM byly obě spuštěny s výchozími parametry. Použili jsme nejnovější verzi větším měřítku ministerstva-SVM, LS-MINISTERSTVA (kompilované ze zdrojových kódů stažených z https://github.com/Dongwon-Lee/lsgkm na 8/25/16), a BaMM motiv; v1.0 staženo z https://github.com/soedinglab/BaMMmotif39,65. Oba modely byly vyškoleny pomocí pětinásobné křížové validace. Výkon modelu byl hodnocen pomocí funkcí roc_auc_score a precision_score z modulu metriky sklearn.

Předpovídání změny v AP-1 vazebné po jednu hodinu KLA léčby

předvídat změny v závazné po KLA léčby, jsme spekulativní motiv závaží se dozvěděl, pro každý z n motivy (wn) TBA model trénovaný na Vozidle léčených dat (Wveh = ) a TBA model trénovaný na 1-h KLA léčených dat (Wkla = ) pro každý AP-1 monomeru. Předpokládané změny v závazné pro každou sekvenci je pak rozdíl mezi skalární součin normalizovaných motiv skóre vypočtené pro každé sekvence k vazebná místa (Sk = ) s KLA motiv váhy a skalární součin motivem skóre a Veh motiv závaží (Δkla−veh,k = Wkla⋅Sk − Wveh⋅Sk). Byly provedeny předpovědi pro všechny genomické lokusy, které se protínají s vrcholem pro jeden z monomerů AP-1 ve stavu léčby vehikulem nebo KLA.

Předpovídání kmen-specifická vazba s TBA

předvídat kmen-konkrétní závazné, jsme spekulativní motiv závaží se dozvěděl, pro každý z n motivy (wn) TBA modelu (W = ) pro každý AP-1 monomeru pomocí C57BL/6J dat, a motiv skóre, vypočtená pro každý z k vazebná místa pomocí genomické sekvence pro C57BL/6J a BALBc/J (SC57,k = , SBAL,k = ). Dále vypočítáme rozdíl motivem skóre pro C57BL6/J a BALBc/J (Dn = ) a pak standardizované skóre rozdíly pro každý motiv přes všechny k vazebná místa, která měla mutace při porovnávání BALBc/J C57BL/6J, poddajný standardizované motiv skóre rozdíly pro každou vazebné místo (Zn = standardizovat(Dn) = ). Nakonec jsme se pak předpověď pro kmen-konkrétní závazné výpočtem skalárního součinu motiv váhy a standardizovaný rozdíl motivem skóre mezi C57BL6/EiJ a BALBc/J pro kth zmutoval vazebné místo (ΔC57−BAL = W⋅).

TBA-2Strain model vzdělávání

Pro každý genomových lokusů, které protíná s vrcholem na jeden AP-1 monomery, v C57BL/6J nebo BALBc/J, jsme vypočítali nejvyšší log-odds skóre pro každý z n motivů, které budou zahrnuty do modelu, pomocí genomické sekvence z obou kmenů, čímž se získá dvě sady motiv skóre pro každý z k vazebná místa (SC57,k = , SBAL,k = ). Byly zvažovány shody motivů v obou směrech. Skóre Log-odds méně než 0 bylo nastaveno na 0. Pomocí skóre motif vypočítáme standardizovaný rozdíl skóre motif napříč dvěma kmeny, jak je popsáno ve výše uvedené části (Zn = ). A tak, funkce používané pro trénink našeho modelu je matice n Po k skóre log-odds standardizovaných v každém řádku. Dále jsme vypočítali log2 složit poměr počtu ChIP-seq čte v C57BL/6J ve srovnání s BALBc/J reprezentovat rozsah napětí-konkrétní závazné. Pomocí této funkce matrixu, a nastavení log2 složit poměr vazba mezi oběma kmeny, jako závislá proměnná, trénovali jsme vah pro každý motiv pomocí lineární regrese jak je provádí scikit-learn Python balíček. Váhy Motif uvedené v naší analýze jsou průměrné hodnoty v pěti kolech křížové validace s použitím 80% údajů pro trénink a 20% pro testování v každém kole. Předpovědi pro vazbu specifickou pro kmen lze provést pomocí vypočtených hmotností podle postupu v předchozí části.

ChIP protocol

Protein a A G Dynabeads 50/50 mix od Invitrogen jsou žalovány za čip (10001D, 10003D). IP mix se skládá z 20 µL kuliček/2 µg protilátky na 2 miliony buněčných čipů. Protilátky proti členům rodiny AP-1 byly vybrány pro cílení na nezachované oblasti, aby se minimalizoval potenciál nespecifické vazby. Protilátky jsou uvedeny v doplňkové tabulce 3. Pro přípravu byly perličky promyty 2× 0,5% BSA-PBS, poté byly perličky-protilátky inkubovány s 0,5% BSA-PBS po dobu nejméně 1 hodiny na rotátoru (4 °C). Wash 2× s 0.5% BSA–PBS, poté resuspendovány v ředicím pufru (1% Triton, 2 mM EDTA, 150 mM NaCl, 20 mM Tris–HCl (pH 7.4), 1× Inhibitory Proteázy). Dvojité zesíťování pro čip: médium bylo dekantováno z buněk v 10 cm deskách, jednou krátce promyjte PBS (RT). Disukcinimidyl glutarát (Pierce Cat # 20593) (zředěný v DMSO při 200 mM)/PBS (RT) byl použit po dobu 10 minut. Poté byl formaldehyd přidán do konečné koncentrace 1% po dobu dalších 10 minut. Reakce byla uhasena 1: 10 1 M Tris pH 7,4 na ledu. Buňky byly odebrány a dvakrát promyty studeným PBS, odstředěním při 1000 × g po dobu 5 minut. Izolace a sonikace jader: resuspendujte buněčné pelety v 1 mL izolačního pufru jader (50 mM Tris–pH 8,0, 60 mM KCl, 0,5% NP40) + PI a inkubujte na ledu po dobu 10 minut. Centrifugujte 2000 × g po dobu 3 minut při 4 °C. Resuspendujte jádra ve 200 µL čerstvého lyzačního pufru (0,5% SDS, 10 mM EDTA, 0,5 mM EGTA, 50 mM Tris-HCl (pH 8)) + PI. Ultrazvukové vibrace: Jádra byla pak ozvučují (10 milionů buněk) za 25 min v Biorupter (nastavení = 30 s = O, 30 s = Off, Střední) pomocí tenké stěny trubek (Diagenode Kočka# C30010010). Po sonikaci spin maximální rychlost po dobu 10 minut při 4 °C. čip nastavit: Sonikovaná DNA byla zředěna 5× 800 ředicím pufrem (1% Triton, 2 mM EDTA, 150 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl (pH 7,4), 1× inhibitory proteázy). Alikvot je odstraněn pro vstupní vzorky (5%). Vzorky zapnuté při 4 °C při otáčení. Mytí: ChIP jsou vyprané 1× s TSE I (20 mM Tris–HCl, pH 7.4, 150 mM NaCl, 0.1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA), 2× s TSE III (10 mM Tris–HCl, pH 7.4, 250 mM LiCl, 1% IGEPAL, 1% deoxycholát, 1 mM EDTA), 1× s TE + 0.1% Triton X-100, přenést do nové zkumavky a pak umýt jindy s TE + 0.1% Triton X-100. Elution: Eluujte elučním pufrem 200 µL (1% SDS, 10 mM Tris pH 7,5) po dobu 20 minut při RT, protřepejte vírem nebo nutátorem nebo rotátorem. Zesítění: přidá se 10 µL 5 M NaCl a inkubuje se při 65 °C (nebo alespoň 8 h). Vyčistěte vzorky pomocí Zymo ChIP DNA Clean and Concentrator. Elute ve 100 µL. Vezměte 40 µL a pokračujte protokolem library prep.

PolyA RNA izolace a fragmentace

izolace RNA: RNA byla izolována pomocí TRIZOL-reagent (Ambion kočka# 15596018) a DIRECT-ZOL RNA mini-prep kit (cat# 11-330 MB). Izolace Poly-a RNA: použití 0.2 Celková RNA jako výchozí materiál pro ideální efektivitu mapování a minimální klonalitu. Sbírejte 10 µL kuliček oligo (dT) (NEB cat# s1419s) na vzorek RNA. Kuličky byly dvakrát promyty 1× DTBB (20 mM Tris-HCl pH 7,5, 1 m LiCl, 2 mM EDTA, 1% LDS, 0,1% Triton X-100). Kuličky byly resuspendovány v 50 µL 2× DTBB. 50 µL kuliček bylo smícháno s 50 µL RNA a zahříváno na 65 °C po dobu 2 minut. RNA-korálky byly potom inkubovány po dobu 10 minut při RT při rotaci. RNA-kuličky byly poté odebrány na magnetu a promyty 1× každý RNA WB1 (10 mM Tris-HCl pH 7,5, 0,12 M LiCl, 1 mM EDTA, 0,1% LDS, 0.1% Triton X-100) a WB3 (10 mM Tris-HCl pH 7,5, 0,5 M LiCl, 1 mM EDTA). Přidá se 50 µL Tris-HCl pH 7,5 a zahřívá se na 80 °C po dobu 2 minut, aby se elutoval. Sbírejte RNA a proveďte druhou sbírku korálků Oligo-dT. Po umytí druhá sbírka, místo eluci byl 1× 1× first strand buffer; 250 mM Tris–HCl (pH 8.3), 375 mM KCl, 15 mM MgCL2 (ThermoFisher SSIII kit Cat# 18080093). Fragmentace: přidejte 10 µL 2× first strand buffer a 10 mM DTT a fragmentu DNA při 94 °C po dobu 9 min. Sbírejte kuličky na magnetu a přeneste eluát obsahující fragmentovanou mRNA do nového PCR proužku. By měla Obnovit 10 µL fragmentované RNA. První pramen syntéza: smíšené Jsme roztříštěné RNA s 0,5 µL random primeru (3 µg/µL) Život Tech #48190-011, 0.5 µL oligo-dT (50 µM od SSIII kit), 1 µL dntp (10 mM Životnost Tech, kočka 18427088) a 0,5 µL SUPERase-V (ThermoFisher Kočka#AM2696) a teplo 50 °C po dobu 1 min. Okamžitě položte na led. Pak jsme přidáno 5,8 µL ddH2O, 0.1 µL aktinomycin (2 µg/µL, Sigma kočka#A1410), 1 µL DTT (100 mM, Život Tech kočka# P2325), 0.2 µL 1% Tween a 0,5 µL Superscript III a inkubujte při teplotě do 25 °C po dobu 10 min, poté 50 °C po dobu 50 min. Korálek vyčistit: Přidali jsme 36 µL RNAClean XP (Ampure XP) a smíchali jsme, inkubovali 15 minut na ledu. Kuličky byly poté shromážděny na magnetu a promyty 2× 75% ethanolem. Kuličky byly potom sušeny na vzduchu po dobu 10 minut a eluovány 10 µL syntézy H2O bez nukleázy. druhého řetězce. 10 µL cDNA/RNA bylo smícháno s 1,5 µL 10× Blue Buffer (Enzymatics kočka# B0110L), 1 µL dUTP/dNTP mix (10 mM Affymetrix kočka# 77330), 0.1 µL dUTP (100 mM Affymetrix kočka# 77206), 0.2 µL RNase H (5 U/µL Enzymatics kočka# Y9220L), 1 µL DNA polymerázy I (10 U/µL Enzymatics kočka#P7050L), 0.15 µL 1% Tween-20 a 1.05 µL vody bez nukleázy. Reakce byla inkubována při teplotě 16 °C po dobu 2,5 h. Korálek uklidit: DNA byla čištěná přidáním 1 µL Seradyn 3 EDAC SpeedBeads (Thermo 6515-2105-050250) na reakci v 28 µL 20% PEG8000/2,5 M NaCl (13% konečná koncentrace) a inkubovat při RT po dobu 10 min. Korálky byly poté shromážděny na magnetu a promyty 2× 80% ethanolem. Kuličky byly sušeny na vzduchu po dobu 10 minut a eluovány ve 40 µL vody bez nukleázy. DNA je připravena na přípravu knihovny.

Library prep protocol

dsDNA end repair: smíchali jsme 40 µL DNA z čipových nebo RNA protokolů s 2,9 µL H2O, 0.5 µL 1% Tween-20, 5 µL 10× T4 ligázy pufru (Enzymatics kočka# L6030-HC-L), 1 µL dNTP mix (10 mM Affymetrix 77119), o 0,3 µL T4 DNA pol (Enzymatics P7080L), o 0,3 µL T4 PNK (Enzymatics Y9040L), 0.06 µL Klenowův (Enzymatics P7060L) a inkubovány po dobu 30 min při 20 °C. 1 µL Seradyn 3 EDAC SpeedBeads (Thermo 6515-2105-050250) v 93 µL 20% PEG8000/2,5 M NaCl (13% konečné) bylo přidáno a inkubovány po dobu 10 min. Čištění korálků: korálky byly shromážděny na magnetu a promyty 2× 80% ethanolem. Kuličky byly sušeny na vzduchu po dobu 10 minut a poté eluovány v 15 µL ddH2O. dA-Tailing. DNA byla smíchána s 10.8 µL ddH2O, 0.3 µL 1% Tween-20, 3 µL Blue Buffer (Enzymatics kočka# B0110L), 0.6 µL dATP (10 mM Tech 10216-018), 0.3 µL Klenowův 3-5 Exo (Enzymatics P7010-LC-L) a inkubuje 30 min při 37 °C. 55.8 µL 20% PEG8000/2,5 M NaCl (13% konečné) byl přidán inkubovány po dobu 10 min. Pak bylo provedeno vyčištění korálků. Korálky byly eluovány ve 14 µL. Ligace adaptéru ve tvaru Y. Vzorek byl smíchán s 0,5 µL BIOO čárový kód adaptér (BIOO Scientific kočka# 514104), 15 µL Rapid Ligation Buffer (Enzymatics cat@ L603-LC-L), 0.33 µL 1% Tween-20 a 0.5 µL T4 DNA ligázy (HC Enzymatics L6030-HC-L) a inkubovány 15 min při RT. 7 µL 20% PEG8000/2,5 M NaCl bylo přidáno a inkubovány po dobu 10 min při RT. Korálek uklidit byla provedena a korálky byly eluovány v 21 µL. 10 µL bylo poté použito pro amplifikaci PCR (14 cyklů) pomocí primerů IGA a IGB (AATGATACGGCGACCACGA, CAAGCAGAAGACGGCATACGA).

GRO-seq

vznikající transkripce byla zachycena globálním jaderným sekvenováním (GRO-seq). Jádra byla izolována z TGEMs pomocí hypotonické lýzy (10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 2 mM MgCl2, 3 mM CaCl2; 0. 1% IGEPAL CA-630) a flash zmrazené V Gro-zmrazovacím pufru (50 mM Tris-HCl (pH 7,8), 5 mM MgCL2, 40% glycerolu). Běžet. 3-5 × 106 BMDM jádra byla běh s BrUTP-označené NTPs s 3× NRO pufru (15 mM Tris–Cl (pH 8.0), 7,5 mM MgCl2, 1, 5 mM DTT, 450 mM KCl, 0, 3 U/µL SUPERase V, 1.5% Sarkosylu, 366 µM ATP, GTP (Roche), Br-UTP (Sigma 40 Aldrich) a 1.2 µM CTP (Roche, omezit běh-na délku ~40 nukleotidů)). Reakce byly zastaveny po 5 minutách přidáním 500 µL činidla Trizol LS (Invitrogen), vortexed po dobu 5 minut a RNA extrahována a vysrážena podle popisu výrobce. RNA pelety byly resuspendovány v 18 µL ddH2O + 0.05% Tween (dH2O + T) a 2 µL fragmentace mix (100 mMZnCL2, 10 mM Tris–HCl (pH 7.5)), pak inkubovány při 70 °C po dobu 15 min. Fragmentace byla zastavena přidáním 2,5 µL 100 mM EDTA. Obohacení BrdU. Obohacení BrdU bylo provedeno pomocí BrdU protilátky (IIB5) A AC kuliček (Santa Cruz, sc-32323 AC, lot #A0215 a #C1716). Korálky byly promyty jednou s GRO binding buffer (0.25× fyziologický roztok-natrium-fosfát-EDTA pufru (SSPE), 0.05% (obj./obj.) látky Tween, 37,5 mM NaCl, 1 mM EDTA) + 300 mM NaCl následovaly tři myje v GRO závazné pufrem a resuspendovány v 25% (obj./obj.) kaše s 0,1 U/µL SUPERase-v. Fragment RNA, 50 µL studené GRO binding buffer a 40 µL rovnovážného stavu BrdU protilátky korálky byly přidány i vzorky pomalu otáčet při 4 °C po dobu 80 min. Korálky byly následně točil na 1000 × g po dobu 15 s, supernatant odstraněn a korálky převedeny do Millipore Ultrafree-MC sloupec (UFC30HVNB; Millipore) ve 2 × 200 µL Gro vazebného pufru. IP reakce byla dvakrát promyta 400 µL Gro vazebného pufru, než byla RNA eluována inkubací v 200 µL Trizol LS (ThermoFisher) za mírného míchání po dobu 3 minut. Eluce se opakuje podruhé, přidá se 120 µL dH2O + T ke zvýšení supernatantu a extrahuje se podle popisu výrobce. Konec opravy a decapping: Pro end-opravy a decapping, RNA pelety byly rozpuštěny v 8 µL TET (10 mM Tris–HCl (pH 7.5), 1 mM EDTA, 0.05% Tween 20) po energické míchání ve vortexové třepačce, zahřeje se na 70 °C po dobu 2 min a umístěny na led. Po rychlé rotace, 22 µL Repair master mix (3 µL 10× PNK vyrovnávací paměti, 15.5 µL dH2O + T, 0.5 µL SUPERase-V RNase Inhibitor (10 U), 2 µL PNK (20U), 1 µL RppH (5U)) byl přidán, promíchány a inkubovány při 37 °C po dobu 1 h. Na fosforylovat 5 end, 0.5 µL 100 mM ATP byl následně přidán a reakce byly inkubovány po dobu 45 min při 37 °C (vysoká koncentrace ATP hasí RppH činnost). Po ukončení opravy se přidá 2,5 µL 50 mM EDTA, reakce se smíchají a poté se zahřívají na 70 °C po dobu 2 minut, než se umístí na led. Druhé obohacení BrdU bylo provedeno, jak je podrobně popsáno výše. RNA pelety byly rozpuštěny v 2.75 µL TET + 0.25 µL Illumina TruSeq 3’Adapter (10 µM), zahřeje se na 70 °C po dobu 2 min a umístěny na led. 7 3 ‚ hlavní mix (4.75 µL 50% PEG8000, 1 µL 10× T4 RNA ligase buffer, 0.25 µL SUPERase-V, 1 µL T4 RNA Ligázy 2 zkrácený (200U; NEB)) bylo přidáno, dobře promíchat a reakce inkubovány při 20 °C po dobu 1 h. Reakce byly naředěny přidáním 10 µL TET + 2 µL 50 mM EDTA, zahřeje se na 70 °C po dobu 2 min, umístěné na ledu a třetí kolo BrUTP obohacení byla provedena. Pelety RNA byly během 75% promývání ethanolem přeneseny na PCR proužky a vysušeny. Vzorky byly rozpuštěny ve 4 µL TET (10 mM Tris–HCl (pH 7,5), 0,1 mM EDTA, 0,05% Tween 20) + 1 µL 10 µM reverzní transkripce (RT) primer. Pro žíhání Rtprimeru byla směs inkubována při 75 °C po dobu 5 minut, 37 °C po dobu 15 minut a 25 °C po dobu 10 minut. Podvázat 5‘ Illumina TruSeq adaptér, 10 µL 5 ‚ hlavní mix (1.5 µL dH2O + 0.2% Tween 20, 0.25 µL denaturated 5’TruSeq adaptér (10 µM), 1.5 µL 10× T4 RNA ligase buffer, 0.25 µL SUPERase-V, 0.2 µL 10 mM ATP, 5.8 µL 50% PEG8000, 0.5 µL T4 RNA ligázy 1 (5U; NEB)) byl přidán a reakce byly inkubovány při 25 °C po dobu 1 h. Reverzní transkripce byla provedena pomocí Protoscript II (NEB) (4 µL 5× NEB FirstStrand pufr (NEB; E7421AA), 0.25 µL SUPERase-V, 0.75 µL Protoscript II (150U; NEB)) při 50 °C po dobu 1 h. Po přidání 30 µL PCR master mix (25 µL 2× LongAmp Taq 2× Master Mix (NEB), 0.2 µL 100 µM přímý primer, 2.8 µL 5 M betain a 2 µL 10 µM jednotlivé čárové kódy primer), směsi byly zesíleny (95 °C po dobu 3 min, (95 °C po dobu 60 s, 62 °C 30 s, 72 °C 15 s) x13, 72 °C po dobu 3 min). PCR reakce byly vyčištěny pomocí 1,5 objemů SpeedBeads (GE Healthcare) v 2,5 M NaCl / 20% PEG8000. Knihovny byly velikost vybrána na stránce / TBE gely na 160-225 párů bází. Gelové plátky byly rozdrceny spřádáním 0,5 mL perforované PCR zkumavky umístěné na horní straně 1,5 mL zkumavky. Přidá se 150 µL Gel EB (0,1% LDS, 1 m LiCl, 10 mM Tris-HCl (pH 7,8)) a suspenze se inkubuje za míchání přes noc. Očistit eluované DNA, 700 µL Zymogen Čip DNA binding pufru bylo přidáno do 1,5 mL zkumavky obsahující drcené gel plátek a Gel EB, smíšené pipetováním a suspenze převedena do ZymoMiniElute sloupci. Vzorky byly nejprve roztočeny při 1000 × g po dobu 3 minut, poté 10 000×g po dobu 30 s. Průtok byl odstraněn, a vzorky promyje se 200 µl Zymo WashBuffer (s EtOH). Zbytky gelu byly odstraněny šleháním a kolony promyty přidáním dalšího 200 µL Zymo Washbufferu (s EtOH). Průtok byl odstraněn, sloupy točil suché odstředěním na 14 000 × g po dobu 1 min a DNA eluována přidáním 20 µL předehřátého Sekvenování TET (10 mM Tris–HCl (pH 8.0), 0,1 mM EDTA, 0.05% Tween 20). Knihovny byly sekvenovány.

Western blotting

Buňky byly lyžují s Igepal lyzačního pufru (50 mM Tris pH 8.0, 150 mM NaCl, 0.5% Igepal) a koncentrace proteinu byly stanoveny pomocí BioRad proteinového testovacího činidla za použití BSA jako standardu. Proteiny byly odděleny na NuPage 4-12% gradientních gelů Bis-Tris (Invitrogen) a přeneseny na nitrocelulózovou membránu (Amersham). Membrány byly blokovány v TBS s 0,1% Tween-20 a 5% BSA. Membrány byly blotovány s uvedenou primární přes noc při 4 °C. peroxidáza-konjugované sekundární protilátky byly detekovány pomocí ECL plus western blotting detection system (Amersham).

Zvířata a buněčné kultury

TGEMs byly shromážděny za 3 dny po podání injekce z mužů 8-týden C57Bl/6J, nebo BALB/cJ myší, a, á 20 × 106 buněk na 15 cm Petriho misce v DMEM + 10% FBS a 1× penicilin–streptomycin. Jeden den po pokovování byly buňky doplněny čerstvým médiem a ošetřeny PBS (Veh) nebo 100 ng/mL KLA po dobu 1 hodiny a poté přímo použity pro následné analýzy. iBMDM jsou produkovány infekcí BMDM retrovirem obsahujícím myc a Braf V600E66. Zvěčněné buňky se pak pěstují během několika týdnů. Všechny pokusy na zvířatech byly prováděny v souladu s etickými standardy stanovenými University of California, San Diego Institutional Annual Care and Use Committee (Iucac).

produkce Lentiviru

pLentiguide byla upravena tak, aby obsahovala lešení U6-bsmbi-spgRNA a CMV promotor pohánějící tagBFP2. 2 CRISPR průvodci byly vloženy pro každý cíl pomocí PCR amplifikace s H1 promotor (bsmbi stránky/guide1/lešení/H1 promotor/guide 2/bsmb1 stránky) pro celkem 2 návody na virus (U6 a H1 řízený) (Doplňující Tabulka 4). Virus byl vyroben se systémem pVSVg / pp20x2. Dva dny po transfekci, média bylo odebráno a centrifugována při 4 °C po dobu 2 h na 20 000 × g. Mobilní pelet byl rozpuštěn přes noc při 4 °C v OPTI-MEM a skladovány při -80 °C.

Výroba CRISPR KO iBMDMs

KO iBMDMs byly vyrobeny pomocí lentiviral infekce. iBMDM-CAS9-IRES-EGFP byly infikovány MOI 100, měřeno na 293T buňkách, s Lentiblastem (OZ biosciences) (5 µL každé činidlo) v OPTI-MEM. To se pak odstředí při 1300 g po dobu 1 hodiny při pokojové teplotě. Média byla poté odstraněna a buňky byly doplněny v médiu kostní dřeně (30% L-buněk, 20% FBS, 1% penicilin/streptomycin v DMEM) po dobu 2 dnů. Buňky byly poté tříděny na infekci expresí transgenu na virové sekvenci (tagBFP2).

souhrn hlášení

Další informace o experimentálním návrhu jsou k dispozici v souhrnu zpráv o výzkumu přírody, který je spojen s tímto článkem.

dostupnost kódu