Polymery získané z přírodních zdrojů, nebo monomery
Aminokyselin a sacharidů na bázi materiálů byly důkladně prozkoumány pro nukleové kyseliny dodání, jako více důkladně přezkoumány jinde . Tyto přírodní stavební kameny mají potenciál mít sníženou cytotoxicitu a, pokud jsou optimalizovány, lepší celkovou funkci ve srovnání s plně syntetickými biomateriály. Zde budou zkoumány polymery nukleových kyselin na bázi peptidů a uhlohydrátů (obr. 29,7 B).
prvním sledovaným polymerem na bázi aminokyselin byl poly(Lys) a mnoho iterací tohoto kationtového polymeru bylo rozsáhle studováno podobným způsobem jako PEI a další syntetické polycace popsané výše. Poly (Lys) může účinně komplexovat nukleové kyseliny, ale jeho účinnost transfekce je nízká a vyžaduje buněčnou léčbu endosomolytickými látkami, jako je chlorochin, aby se zvýšila genová exprese. Nicméně rané studie o poly (Lys) přinesly důležité mechanistické poznatky týkající se polyplexové formulace, intracelulárního obchodování a úniku endozomu . Zatímco klinický příslib poly (Lys) je omezený, tyto rané studie měly významný dopad na pole.
Poly (histidin) (poly (His)) je další polymer na bázi aminokyselin, který prokázal určitou užitečnost pro genovou terapii. Aminokyselina His má imidazolovou R-skupinu obsahující sekundární amin, který poskytuje Poly(His) s aktivitou protonové houby pro endozomální únik . Polymery obsahující Lys i His byly také úspěšně využity v kombinacích. V těchto hybridní polymery, primární aminy na Lys jsou plně protonované a kationtové při fyziologickém pH, což umožňuje efektivní elektrostatické komplexů s DNA. Nižší pKb sekundárních aminů z His poskytuje doplňkovou aktivitu protonové houby pro únik endozomu . Na transfekci účinnost polymery s poly(Jeho) roubované na poly(Lys) se výrazně zlepšila přidáním endosomal narušení agent chlorochin, což znamená, že polymery na pokoji jsou ještě částečně náchylné k endosomal navádění . Bylo také zjištěno, že vysoce rozvětvené architektury polymerů His/Lys a redukovatelných polykací obsahujících His účinně dodávají siRNA . Existuje také precedens pro začlenění podjednotek na bázi aminokyselin do jiných systémů genové terapie, aby se vytvořily „hybridy“ se zvýšenou funkčností doručení. Například jeho byl také použit k modifikaci chitosanu (diskutováno více dále), aby se zvýšila jeho endozomální úniková a transfekční účinnost .
Cell-pronikající peptidy (Cpp) a pH-citlivý, fusogenic peptidy jsou další dvě třídy peptidy, které byly pečlivě prozkoumány, aby vyvolat buněčné vychytávání a endosomal uniknout, resp. Tyto peptidové třídy byly použity jak v kombinaci, tak jako součásti multifunkčních polymerních a lipozomálních dodacích systémů. Většina CPP a fusogenních peptidů je odvozena od bakteriálních toxinů a virových vektorů nebo jsou syntetickými analogy přirozeně se vyskytujících peptidů. Trans-aktivační transkripční faktor, HIV-1 , a antennapedia peptid odvozený z Drosophila jsou dva příklady dobře-studoval CPPs. Tyto peptidy jsou obvykle bohaté na kationtové aminokyseliny, a jako výsledek, syntetické, bylo také zjištěno, že CPP bohaté na arginin různých typů zprostředkovávají absorpci biomakromolekulárních nákladových buněk. Fúze CPP s doménou vázající dsRNA byla použita k přenosu siRNA do primárních buněk považovaných za obtížně transfektovatelné . Další CPP odvozené od Transportan 10 (označené PepFect) a CADY byly navrženy pro efektivní intracelulární podání. Fúze nádor pronikající a CPPs mají být generovány, které ukázaly, tlumení hluku z onkogenu zlepšení přežití u myší schopnost CPPs vyvolat buněčné internalizace byla hybnou silou pro dodání několika tříd terapeutických nákladu včetně plazmidové DNA a siRNA (viz CPP recenze pro dodatečné informace).
Fusogenní peptidy jsou peptidy reagující na pH, které se mohou fúzovat nebo tvořit póry přes endozomální membránu. Příkladem je difterický toxin, který má podjednotky, které tvoří transmembránové póry v endosomes, které umožňují vstup disulfid-spojené toxin fragment do cytosolu . Dalším příkladem je hemaglutinin, chřipkový protein, který vytváří fúzi endozomální membrány závislou na pH a dodává virový genetický materiál do cytoplazmy . Peptid GALA je syntetický, pH-dependentní, fusogenní peptid, který byl rozsáhle charakterizován . SLAVNOSTNÍ self-sestaví a vloží do lipidové dvojvrstvy, v kyselém pH, tvořící pór, který umožňuje membrány tranzitu . Například GALA byla úspěšně použita pro zvýšení účinnosti cytosolického dodávání nákladu nukleových kyselin zabaleného v PAMAMU a liposomech .
polysacharid chitosan, oligosacharidy-jako cyklodextriny, a řadu dalších sacharid obsahující glycopolymers představují další polymer třídy pro nukleové kyseliny dodání. Například, přírodní aniontové sacharidové bázi polymerů mohou být vyrobeny do termodynamicky stabilní, polyelectrolyte komplex (PEC) NPs prostřednictvím spontánní asociace spouští přes míchání polyelektrolyty opačné starosti, jak uvádí Prokop et al. . Typicky, PEC NPs jsou vyrobeny smícháním polyanionic core polymerů, jako je alginát nebo chondroitin sulfát s corona polycations jako spermin-hydrochlorid nebo poly(methylen-co-guanidine) – hydrochlorid. Tento multipolymeric nanočásticové přístup bylo prokázáno, že být efektivní pro přenos genů in vitro , zejména v buněčných systémů, které jsou obvykle refrakterní k přenosu genů, jako pankreatické ostrůvky a antigen-prezentující buňky. Kromě toho mohou být koronální povrchy PEC zdobeny komplexy PEG-ligand, aby se zvýšilo cílení buněk a snížilo nespecifické vychytávání.
Chitosan, polysacharid se skládá z glukosamin a N-acetyl glukosamin jednotky vázané přes β(1→4) glykosidickými vazbami, je jedním z nejvíce důkladně studoval sacharidové polymery. Chitosan těží z toho, že je „zeleným“ přístupem, protože se jedná o obnovitelný zdroj odvozený od chitinu. Tento přírodní polymer je také biologicky rozložitelný a netoxický. Ten Alonso laboratorní představil chitosan-založené NPs prostřednictvím ionotropní gelace, založený na interakci mezi negativní skupiny pentanatricum tripolyphosphate a kladně nabité aminoskupiny na chitosan. Chemie chitosan je také adaptabilní na nonviral genové terapie, protože obsahuje několik primárních a sekundárních aminů schopen endosomolysis prostřednictvím proton sponge effect. Proto byl chitosan zkoumán jako polymer reagující na pH pro dodávání nukleových kyselin. Howard a kol. zaměstnán chitosan NPs obsahující siRNA srazit zvýšenou zelený fluorescenční protein (eGFP) v obou H1299 lidský plicní karcinom buňky a myší peritoneální makrofágy (77.9% a 89,3% snížení eGFP fluorescence, respektive) . Chitosan NP má vysoký potenciál pro transmukózní podání. Účinné in vivo RNAi bylo dosaženo v bronchiolární epitelové buňky eGFP transgenní myši po nosní podání chitosan/siRNA formulace (37% a 43% snížení ve srovnání nesouladu a neošetřené kontroly, respektive). Hlavní nevýhody chitosanu jsou špatná rozpustnost ve fyziologických pufrech a nižší endosomolytická aktivita ve srovnání s některými silnějšími polymery protonové houby. V důsledku toho bylo provedeno několik variant chitosanu s úpravami pro zvýšení endozomálního úniku a rozpustnosti. Například PEI a imidazoly byly konjugovány s chitosanem, aby se zvýšil jeho výkon v genových terapiích .
kationtové polymery obsahující beta-cyklodextriny (β-CD) vykazovaly časný příslib klinické RNAi. Kationtového β-CD na bázi polymerů (ßCDPs) syntetizovány kondenzaci diamino-cyklodextrinu monomeru s diimidate komonomerní jsou schopny tvořit polyplexes s nukleových kyselin, a jejich transfekci výkon závisí na ßCDP struktury . Polycace obsahující β-CD jsou zvláště jedinečné, protože cyklodextriny obsahují vnitřní dutinu, kterou lze použít k vytvoření inkluzních komplexů s hydrofobními skupinami. Například β-CD pevně váže do hydrofobní molekuly adamantinových, a to poskytuje pohodlné „zvládnout“, ze které se functionalize povrchu polyplexes vyrobeny z ßCDPs s PEG nebo cílení ligandy . Davisova laboratoř přeložila tento koncept z lavičky do klinických studií . Tento nosič byl základem pro zprávu demonstrující první příklad lidské RNAi pomocí cílených polymerních NP. Tento nosič byl složen z ßCDPs funkcionalizovaných jak PEG, tak transferinem ligandu zaměřeným na rakovinu . Po tomto orientačním nálezu bylo klinické hodnocení ukončeno především z důvodu toxických příhod omezujících dávku bez následných studií. Arrowhead Pharmaceuticals se následně zaměřili na konjugáty a nebyly zahájeny žádné následné klinické studie fáze III.
řada dalších nových, syntetických kationtových glykopolymerů je také ve vývojovém potrubí pro klinické aplikace dodávky nukleových kyselin . Reineke lab učinila klíčové příspěvky v této oblasti (viz nedávná recenze Ref. ) a příkladem třídy glykopolykací vyvinutých touto skupinou jsou poly (glykoamidoamin) s (PGAAs). Knihovna PGAAs byla vytvořena kondenzační reakcí mezi sacharidovými a oligoaminovými komonomery. Tyto Pgaa byly měněny na základě různých parametrů, včetně velikosti uhlohydrátů, hydroxylového čísla a stereochemie, aminového čísla a toho, zda byly přítomny heterocyklické skupiny. Tyto polymery byly testovány na dodávku genů a byly identifikovány optimalizované formulace, které usnadňují účinné balení DNA a intracelulární doručovací vlastnosti. Skupina Reineke také hledala různé polymery na bázi trehalózy a slibné výsledky nadále naznačují potenciál klinické translatability této bezpečné a účinné třídy polymerů . Tento glykopolymer byl také upraven tak, aby dodával transkripční aktivátor založený na CRISPR .
exosomy jsou extracelulární vezikuly odvozené od buněk obsahují různé typy nukleových kyselin. Tato přirozená vozidla se účastní buněčné komunikace a stále více se používají při podávání léků a genů . Hlavní výzvou při využívání exosomů pro dodávání genů je načítání vozidel nukleovými kyselinami. Zatímco elektroporace je běžnější způsob nakládání DNA, ultrazvuku, vytlačování, a zmrazovacích cyklů jsou jiné metody pro načítání exosomy . Zatížení exogenní siRNA nebo DNA zůstává výzvou kvůli nízké účinnosti a agregaci během elektroporace. U regenerativní medicíny mohou exosomy odvozené z kmenových nebo progenitorových buněk podporovat regeneraci tkání samostatně bez exogenně dodané DNA včetně regenerace svalů, hojení ran, angiogeneze a opravy chrupavky .