DISKUSE
Naše výsledky ukazují, že při pečlivém plánování, přípravy a standardizace činidla a protokoly, nadnárodní síť laboratoří má schopnost produkovat konzistentní a srovnatelné HAI výsledky testu. Pět laboratoří veřejného zdraví a akademických laboratoří účastnících se této studie bylo součástí PCIRN, která byla vyvinuta za účelem zvýšení národní kapacity Kanady na podporu výzkumu vakcíny a další chřipky v případě pandemie. V pandemické situaci, s vysoce hlasitost, high-tlak, a geograficky rozptýlené ptáků testování, standardizace HAI testu bude mít zásadní význam pro zajištění srovnatelnosti výsledků mezi jednotlivými laboratořemi. Laboratoře PCIRN vykazovaly vysoký standard reprodukovatelnosti uvnitř laboratoře s 99,8% přesností duplikátů (99 .2% na 100% za laboratorní), 97.8% titry ve 2-násobný rozsah, v opakovaném testu dní (93.3% na 100% za laboratorní), a 91.1% testovaných sér prokazující titr reprodukovatelnost v průběhu každé opakování šest-test protokolu (60% na 100% za laboratorní). Mezilaboratorní reprodukovatelnost byla také vysoká, se střední titry přes všechna opakování ze čtyř nonreference laboratoře do 2-krát referenční laboratoře pro 100% testovaných sér. Na laboratorním základě byly titry 94,3% a 98.9% vzorků kvantifikovaných v rámci jediného ředění referenční laboratoře a konsenzuálních titrů (rozmezí 85% až 100% a 95% až 100%). Tato procenta splňují typické prahové hodnoty přijatelnosti pro variabilitu testu HAI (tj. alespoň 80% vzorků je v rozmezí 1 ředění nominálních hodnot a / nebo GMT všech testů). Specificita HAI testu (100%) a citlivost (87,5% až 100%) v laboratořích PCIRN byly podobně dobře v rámci akceptačních kritérií předchozích studií (tj. 100% negativní vzorky by měly kvantifikovat jako pod úrovní kvantifikace, a alespoň 80% pozitivní vzorky by měly kvantifikovat jako pozitivní ).
Pro vnitrolaboratorní součástí HAI assay variability, opakovatelnosti v rámci PCIRN laboratoře se objeví podobné prokázáno v jiných studiích (5, 22). Jedna námitka z těchto předchozích studiích byl více než třikrát opakuje byly zkoumány, i přes zdravý imunitní test validace postupů posuzování šest nebo více opakovaných testech (24-27). Jako takový, není jasné, zda jsou jejich údaje přímo srovnatelné s výsledky stanovenými v průběhu šesti testů v této studii. Nicméně naše zjištění z 0% na 6,7% (medián, 0%) zkoušek s výsledky lišící se o více než 2-krát od jiných test opakuje zdát srovnatelné s 4,8% na 7,1% bylo uvedeno dříve v jedné laboratoři (22) a 0% do 15% (medián, 2%) v devíti laboratořích (5).
Naše zjištění vysoké HAI titr reprodukovatelnost mezi geograficky rozptýlených PCIRN laboratoře kontrastu s předchozí zprávy, které ukazují značné rozdíly mezi mezinárodními laboratořemi provádění tohoto testu (5, 6, 9-12). Například údaje z velké společné studie (11 laboratoří) zjistily GCV na vzorek v rozmezí od 84% do 803% (medián GCV na virus 138%, 155% a 261%). Jiné studie uvádějí, GCVs pro H1N1 a H5N1 vzorků, která se rozkládala na 95% 345% (11) a 22% na 582% (6), a GMTs lišily mezi laboratořemi až 80-krát (11) nebo 128 krát (9). Zatímco předchozí zprávy často součástí vyššího počtu zúčastněných laboratoří než aktuální studie, i když jen šest laboratoří přispěla data, medián mezilaboratorních GCV byla 83% na pět H1N1 vzorků, přičemž 80% z nich vyšší než 4-násobný rozdíl mezi laboratořemi (11). V kontrastu, aktuální studie ukázala, medián GCVs na virus jen 39% a 17%, s 95% vzorků ve 4-násobný rozdíl mezi laboratořemi. Jeden vzorek překročil 4násobný rozdíl; titr nebyl kvantifikovatelný pro tento vzorek v jedné laboratoři, a proto byla nejnižší hodnota přiřazena spíše než měřena. Pokud vzorek byly vynechány z analýz, maximální GCV by 75.5%, což by představovalo hodnotu nižší než minimální GCV v jiných studiích. I když ten vzorek vykazovaly vyšší variabilitu než ostatní, tento nízký rozsah měření objevil obecně méně přesné než vyšší rozsahy. Například, spalného tepla v rozmezí od 43.4% na 156,4% na titry mezi 10 a 80 v porovnání s 11.1% na 53,1% na vyšší titry (Obr. 3). Větší variabilita s nižší titr vzorky byly také popsány dříve (23) a pravděpodobně přispěly k neshodě séroprotekce klasifikace v aktuálním studiu pro tři H1N1 vzorky s titry nejblíže k hranici 40 (shoda titry 22, 24, 43). Navzdory tomu zůstala diagnostická přesnost séroprotekce napříč laboratořemi PCIRN celkově vysoká (93,6%, když byly pro definování séroprotekce použity konsensuální titry a 89,5% ve srovnání s referenčními laboratorními hodnotami).
vysoká shoda mezilaboratorních titrů HAI v laboratořích PCIRN může souviset s pečlivou harmonizací postupů a činidel HAI v celém PCIRN. Účastníci předchozích studií, které vykazovaly vysokou interlaboratorní variabilitu, obecně používali metody Hai testu, které se mezi laboratořemi lišily. Proměnné testu, o nichž se předpokládá, že přispívají k variabilitě výsledků, zahrnovaly množství přidaného viru, systém virové kultury (např., oplodněná slepičí vejce proti tkáňové kultury), délka RDE léčby, počáteční zředění séra, typ a věk Rbc používány, a lhůty, v RBC vypořádání (5, 11, 12). Překvapivě, nicméně, když Wood et al. za předpokladu, komerční a veřejné laboratorní účastníků proti sezónní chřipce testování v Evropě s podrobným standardní operační postup a společné činidly/materiály, které uvedly, že mezilaboratorní odchylky byla výrazně zlepšila (10). Autoři spekulovali, že přetrvávající „místní technické variace“, stejně jako různí dodavatelé RBC, mohl ovlivnit Reprodukovatelnost mezi laboratořemi, ale poznamenal, že další standardizace byla nad rámec proveditelnosti jejich studie. Novější publikace interpretovat tyto nálezy, jak ukazuje, že HAI testu standardizace mezi laboratořemi, obecně platí, že není proveditelné, přístupu k harmonizaci HAI výsledky v různých laboratořích (8, 12), a alespoň jedna skupina se snažila vytvořit upravený a robustnější HAI testu generovat více spolehlivé a reprodukovatelné údaje (22).
V současné studii, PCIRN laboratoře striktně dodržovala standardní, veřejně dostupné Světové Zdravotnické Organizace HAI zkoušky protokol, ve kterém bodů předmětem technické nebo interpretační variace byly harmonizovány mezi laboratořemi před zahájení studie. RDE, RBC, virové zásoby) byly získány od stejných dodavatelů co nejvíce. Kromě toho omezení testování na jediného technologa na každém zkušebním místě umožnilo zvýšenou standardizaci. Možný účinek použití více pracovníků v každé laboratoři nebyl v této studii testován. Při použití více operátorů, by mohl potenciálně zvýšit variabilitu, jediná studie, která zkoumala tuto možnost pro HAI testování neprokázalo žádný významný rozdíl mezi výsledky dvou operátorů ve stejné laboratoři (22).
Potenciální variace mezi laboratořemi v virové kmeny pěstované pro použití v testu byly minimalizovány mezi PCIRN laboratořích pomocí virové zásob semen, pak z jediného zdroje, které byly pěstovány ve stejné buněčné linie za podobných podmínek na všech laboratoří. Spekulujeme, že mezilaboratorní Reprodukovatelnost by mohla být přístupná ještě dalším zlepšením, kdyby virové pracovní zásoby byly vyráběny centrálně a distribuovány zúčastněným laboratořím. Význam virový kmen variace pro HAI endpoint titry je dobře vidět na 2-na-3-fold-nižší titry doložena v jedné studii, kdy HAI test/Cal pH1N1 napětí ve srovnání s X179A reasortovaných, které stále vlastnil ekvivalent hemagglutinins a neuraminidases (11). Zásoby bohužel nebyly v rámci této studie sekvenovány, a proto nemůžeme ověřit, že všechny laboratoře používaly viry s identickými sekvencemi hemaglutininu. I když menší sekvence změny byly zavedeny místní šíření viru populací, variabilita mezi laboratořemi v této studii byla malá, a tak je těžké si představit, jak využívání zásob s identickými HA sekvence může dále snížit variabilitu. I když rozdíly nebyly větší než 2-krát v tomto malém vzorku, malé změny v HA sekvence zavádí místní šíření virové akcie by mohly být jedním z možných vysvětlení tendence k podcenění H1N1 titry a nadhodnocení H3N2 titry.
Různé studie uvádějí snížení mezilaboratorní variabilita v HAI titry kalibrací výsledky s mezinárodními standardy (6, 11-13); nicméně, takové normy neexistují pro aktuální sezónní chřipky B a chřipky A H3N2 kmeny virů, a neustálé antigenní drift sezónní kmeny, které disk roční změny složení očkovacích látek může vyžadovat neustálý vývoj a validace nových norem. V této studii se zdá, že mezilaboratorní srovnatelnost je lepší než srovnatelnost dosažená použitím i nejúčinnějších kalibračních standardů. Například po kalibraci s IS 09/194, Wood et al. (11) uvádí, že maximální rozdíly mezi geometric mean titers, GMTs v různých laboratořích snížil z 80-krát až 64-krát (tj. hodnota stále znatelně vyšší než maximální 11-krát v aktuální studie) a které se pohybuje množstvím spalného tepla mezi laboratořemi snížila z 95% na 345% (medián, 105%) 34% 231% (medián, 109%), tj. více než rozmezí 0% 156% (medián, 27%) v této studii. Podobně, použití na náhradní 10/202 zmenšil GCV mezi laboratořemi z řady 108% na 157% na sortiment 24% na 144% přes pět vzorků a maximální rozdíly mezi laboratořemi, z 43-krát až 21-krát (13), a pomocí 07/150 standardní, Stephenson et al. (6) snížil medián GCV 15 vzorků nibrg-14 H5N1 clade 1 ze 125% (rozmezí 31% až 582%) na 61% (34% až 535%).
Zatímco přesný důvod(y) pro vysokou úroveň dohody mezi PCIRN laboratoří ve srovnání s předchozí studií nelze určit, náš úspěch byl usnadněn tím, že podnět, který jsme měli jako národní síť pracovat na společném cíli, kterým reprodukovatelné procesy. Podrobný a přísný proces a činidla harmonizaci mezi lokalitami je snad jediný „nový“ aspekt jsme přivedli do této studie, ve srovnání s dlouhotrvající tělesné literatury, které ukazují na špatnou HAI reprodukovatelnost mezi laboratořemi. Naše data však naznačují, že při pečlivé standardizaci mohou být mezilaboratorní variace titrů HAI sníženy na úrovně podobné těm, které byly pozorovány v jednotlivých laboratořích. Případné další kroky v minimalizaci odchylky v HAI titry v laboratořích po celém světě by byla mobilizace sítí/konsorcia, provádění pokynů a/nebo regulační požadavky pro použití standardních postupů a činidel, standardizované školení pro zajištění reprodukovatelnosti a poskytování podpory a/nebo pobídky pro laboratoře, aby přijali „standardizace“ koncept.