Sulfát-redukujících bakterií v lidských výkalech a jejich asociace s zánětlivé střevní onemocnění

Abstrakt

Jsme hledali hořečnatý-snižuje bakterie v trusu 41 zdravých jedinců a 110 pacientů z Hepato-Gastroenterologie Jednotky pomocí specifické tekuté médium (Test-kit Labège®, Compagnie Française de Géothermie, Orléans, Francie). 110 pacientů bylo odděleno u 22 pacientů se zánětlivými onemocněními střev a 88 pacientů hospitalizovaných pro jiné dolní (n=30) nebo horní (n=58) nemoci zažívacího traktu. Bakterie snižující síran byly izolovány od 10 zdravých jedinců (24%), 15 pacientů se zánětlivými onemocněními střev (68%) a 33 pacientů s dalšími příznaky (37%). Multiplex PCR byl navržen pro identifikaci Desulfovibrio holky (dříve Desulfomonas pigra), Desulfovibrio fairfieldensis a Desulfovibrio desulfuricans, a aplikovat na výše uvedené izoláty. Kmeny bakterií snižujících síran sestávaly z D. piger (39 izolátů), D.fairfieldensis (19 izolátů) A D. desulfuricans (jeden izolát). Výskyt D. holky, byla významně vyšší u pacientů se zánětlivým onemocněním střev (55%) ve srovnání se zdravými jedinci (12%) nebo u pacientů s jinými příznaky (25%) (P<0.05).

1 Úvod

Crohnova nemoc (CD) a ulcerózní kolitida (UC) jsou chronická zánětlivá onemocnění střev (IBD) neznámé etiologie, ale je pravděpodobné, že spoléhat se na životní prostředí, genetické a imunitní faktory . Byl navržen infekční původ a mnoho mikroorganismů bylo zapojeno do absence přesvědčivých argumentů. U obou syndromů však střevní zánět reaguje na antibiototerapii. U zvířecích modelů chronické kolitidy je luminální flóra nezbytným kofaktorem pro vznik onemocnění . To může vysvětlit obnovený zájem o roli střevní flóry jako příčiny těchto poruch .

bakterie snižující síran (SRB)jsou anaerobní mikroorganismy, které provádějí odlišnou redukci síranu za účelem získání energie, což vede k uvolnění velkého množství sulfidu. Obvykle jsou izolovány z environmentálních zdrojů, ale jsou také přítomny v zažívacím traktu zvířat a lidí. Jako Desulfomonas pigra byl překlasifikován na Desulfovibrio piger comb. Novum. , lidské izoláty SRB sestávají téměř výhradně z druhů Desulfovibrio . Nedávná zjištění naznačují, že SRB může mít roli v lidských nemocech. Byly spojeny s klinickou závažností lidské parodontitidy a izolovány z hlubokých abscesů( břicha nebo mozku), krve nebo moči . V těchto nastavení, většina kmenů byly identifikovány jako Desulfovibrio fairfieldensis, nedávno navrhl nový druh , 16S ribozomální RNA gen (16S rDNA) sekvence. Desulfovibrio desulfuricans, typový druh rodu Desulfovibrio, byl také izolován z lidských vzorků . Implikace SRB v IBD byla navržena jako jejich metabolický konečný produkt, sirovodík, je cytotoxická sloučenina . Tato sloučenina může působit inhibicí oxidace butyrátu, hlavního zdroje energie pro kolonocyty. Poškození funkcí střevního epitelu by vedlo k buněčné smrti a chronickému zánětu. Druhy SRB spojené s IBD však dosud nebyly identifikovány. Jejich identifikace by umožnila hledat faktory virulence a jejich náchylnost k antimikrobiálním látkám.

v lékařských laboratořích jsou SRB zřídka izolovány z lidských vzorků kvůli pomalému růstu. Kolonie se objevují po více než 3 dnech inkubace a nejsou zaznamenány, jsou zarostlé doprovodnou flórou, pokud nejsou dominantním nebo jediným přítomným druhem. Jejich hledání ve stolici je tedy obtížné, pokud není použito konkrétní médium. Taková média obvykle obsahují organickou sloučeninu (donor elektronů a zdroj uhlíku), síran (akceptor elektronů), železo a redukční činidlo. Růst SRB ve specifických kultivačních médiích je snadno detekovány černání střední důsledku sirovodíku (H2S) výroby, což má za následek vznik železnatý sulfid sraženina. Po izolaci z klinických vzorků může být identifikace na úrovni druhů obtížná. Například není možné rozlišit d. fairfieldensis A D. desulfuricans fenotypovými testy. Amplifikace genů je tedy cenným nástrojem k dosažení takové identifikace.

hlavním cílem této studie bylo zjistit, které druhy Desulfovibrio mohou být spojeny s IBD, pokud existují. Pro tento účel, zvláštní kapalné médium (Test-kit Labège®, Compagnie Française de Géothermie, Orléans, Francie) byl použit pro růst SRB z výkalů zdravých jedinců a pacientů hospitalizovaných v Hepato-Gastroenterologie Jednotka Střediska et Hospitalier Universitaire de Nancy, Francie. Pro identifikaci izolátů na úrovni druhů byla navržena multiplexní PCR.

2 materiály a metody

2.1 pacienti

výkaly 41 zdravých jedinců (17 mužů a 24 žen; průměrný věk 38 let, rozsah 1-101 let) a 110 pacientů (67 mužů a 43 žen, průměrný věk byl 57 let, rozmezí 14-100 let) z Hepato-Gastroenterologie Jednotka Střediska et Hospitalier Universitaire de Nancy, Francie, byly shromážděny. Zdraví jedinci konzultovali postupně kontrolu. Ve stolici nebyl nalezen žádný patogenní mikroorganismus. Zdravým jedincům a pacientům nebylo podáno žádné antibiotikum v měsíci před získáním vzorku. Pacienti byli rozděleni do tří skupin: IBD (n=22) zahrnovalo 17 CD a pět UC; další nižší střevní onemocnění (n=30) zahrnuto 23 pacientů léčících se s mírné nebo středně závažné příznaky, jako je bolest břicha, střevní tranzit problémy a rectorrhagia, a sedm pacientů s tlustého střeva rakoviny; horní části trávicího traktu onemocnění (n=58) součástí žlučové kameny, cirhóza, jater-buněčný karcinom, žaludku a pankreatu. IBD byly diagnostikovány na základě klinických, endoskopických a histologických nálezů. Většina pacientů s IBD vykazovala aktivní onemocnění (Tabulka 1).

2.2 SRB detekce a výčet

Jeden gram výkalů byl smíchán se 4 ml fosfátem pufrovaného fyziologického roztoku pufru a centrifugovány (3000 rpm, 5 min). Jeden mililitr supernatant byl naočkován ihned v tekutém médiu (Test-kit Labège®, Compagnie Française de Géothermie, Orléans, Francie) podle pokynů výrobce. Stručně řečeno, testovací soupravy Labège® se skládají z lahviček obsahujících 9 ml specifického média (organické sloučeniny: laktát a acetát, redukční činidlo: citrát titaničitý) anaerobně podmíněné pro detekci SRB. Naočkuje se injekční stříkačkou přes gumový uzávěr. Toto bezbarvé a bezbarvé médium bylo původně navrženo pro detekci SRB ze vzorků prostředí. Byl porovnán s běžně používaným pevným médiem Postgate E (organická sloučenina: laktát, redukční činidla: kyselina askorbová a kyselina thioglykolová), inokulovaná paralelně v anaerobní atmosféře. SRB byly vyčísleny pomocí dlouhých a úzkých zkumavek naplněných druhým médiem a naočkovány desetinnými ředěními výkalů. Všechna naočkovaná média byla inkubována při 37°C po dobu 2 měsíců. Přítomnost SRB byla zjištěna tvorbou černé sraženiny (sulfidu železnatého) v kapalném médiu a výskytem černých kolonií v pevném médiu.

2.3 Design PCR primerů

16S rDNA sekvencí Desulfomonas a Desulfovibrio kmeny jsou k dispozici v GenBank databázi byly porovnány pomocí Sekvence Navigator software, verze 1.0.1 (Applied Biosystems Inc., Foster City, CA, USA). Umožnilo navrhnout šest primerů pro identifikaci SRB dříve izolovaného od lidí pomocí PCR, související s d. holky (dříve Desulfomonas pigra) ATCC 29098T, D. desulfuricans Essex 6 ATCC 29577T, D. desulfuricans MB ATCC 27774, a. D. fairfieldensis ATCC 700045. D. desulfuricans Essex 6 A D. desulfuricans MB byly diferencovány, protože 16S rDNA sekvence těchto kmenů vykazují rozdíl 3%. Primery byly 27K-F (5′-CTG CCT TTG CTG ATA CTT AG-3′), 27-R (5′-GGG CAC CTC CCT GTT TCG ROUBÍK-3′), Essex-F (5′-CTA CGT TGT GCT AAT CAG CAG CGT AC-3′), Fair-F (5′-TGA ATG AAC TTT TAG GGG AAA GAC-3′), Prase-F (5′-CTA GGG TGT AAT TCT CAT CAT CCT AC-3′), a P687-R (5′-GAT ATC TAC TTT GGA TCC CAC TAC ACC-3′) (Tabulka 2). Specifičnost těchto primerů byla zkontrolována na všech bakteriálních sekvencích dostupných z databáze GenBank pomocí programu Blast, verze 2.0(Národní centrum pro biotechnologické informace, Bethesda, MD, USA).

2.4 SRB identification by multiplex PCR

Four collection strains (D. piger ATCC 29098T, D. desulfuricans Essex 6 ATCC 29577T, D. desulfuricans MB ATCC 27774, and D. fairfieldensis ATCC 700045) and 12 clinical strains (two strains related to D. desulfuricans Essex 6, dva kmeny související s D. desulfuricans MB a osm kmenů identifikováno jako D. fairfieldensis) byly použity jako pozitivní kontroly. Citlivost PCR byla hodnocena ředěním kvantifikovaných suspenzí bakteriálních kmenů. Specifičnost PCR byla kontrolována s negativní kontroly, včetně kmenů (Bilophila wadsworthia ATCC 49260T, Desulfovibrio gigas DSM 1382T, Desulfovibrio vulgaris DSM 644T) a časté střevní klinické kmeny patřící do následujících druhů: Bacteroides křehké, Bacteroides merdae, Bacteroides thetaiotaomicron, Bacteroides uniformu, Bacteroides vulgatus, Campylobacter jejuni, Citrobacter freundii, Bakterie neškodné, Enterobacter římské říše, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Escherichia coli, Eubacterium malé, Eubacterium lepkavé, Fusobacterium nucleatum, Kodaň kanálu, Klebsiella oxytoca, Klebsiella pneumoniae, Morganella morganii, Peptostreptococcus velký, Proteus nádherné, Proteus společné, Providencia stuartii, Pseudomonas aeruginosa, Serratia marcescens, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, a Streptococcus bovis.

na konci inkubační doby bylo všech 151 naočkovaných testovacích souprav Labège® zkontrolováno pomocí multiplexu PCR. Extrakty DNA byly získány z 500 µl kultivačního média po centrifugaci a resuspenzi v TE pufru (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8). Stručně řečeno, buňky byly pomocí lyse postupně lysozymu (3 mg ml−1), SDS (1%, w/v) a proteináza K (0,25 mg ml−1). Po noční inkubaci při 37°C byla DNA extrahována standardní metodou fenol / chloroform/isoamylalkohol. Každý 50-µl PCR směs obsahovala 5 µl extraktu DNA (přibližně 50 ng DNA) a konečné částky 0,4 µM každého primeru, 0,8 mM z každé deoxynucleoside trifosfát (Boehringer Mannheim-Biochemicals, Mannheim, Německo), 0,4 mM Tris–HCl buffer, 1,5 mM MgCl2, a 1,5 U Taq DNA polymerázy (Life Technologies Gibco BRL, Paisley, UK). Všechny reakce byly provedeny pomocí systému GeneAmp PCR 2400 (Perkin-Elmer, Norwalk, CT, USA). Počáteční krok denaturace 94°C po dobu 4 min, následovalo 30 cyklů denaturace (94°C, 1 min), žíhání (55°C, 1 min) a extenze (72°C, 2 min) a závěrečná extenze (72°C, 5 min). Negativní (voda místo extraktu DNA) a pozitivní (d. fairfieldensis DNA extract) kontroly byly zahrnuty v každém běhu. Amplifikované produkty byly vyřešeny elektroforézou v 1,5% (w/v) agarózových gelech obsahujících ethidiumbromid (1,6 mg ml−1). Jako marker velikosti byl použit 100-bp dna žebřík (Gibco BRL Life Technologies, Rockville, MD, USA). D. piger, D. desulfuricans Essex 6, D. desulfuricans MB a D. fairfieldensis byly identifikovány 255, 255-, 396 -, a 534-bp band, resp. D. piger a D. desulfuricans Essex 6 byly dále diferencovány samostatnými PCR testy za použití příslušných specifických primerů. U negativních vzorků byla provedena amplifikace 16S rDNA pomocí konsensuálních primerů 27f a 1525r ke kontrole nepřítomnosti inhibice PCR kontaminanty.

3 výsledky

3.1 SRB detekce a výčet

U zdravých jedinců a podle výše uvedených kritérií, SRB byly nalezeny v 10 výkaly (24%) s oběma Test-kit Labège® a Postgate je střední. U pacientů z Hepato-Gastro-Enterologické jednotky byla SRB vypěstována ze 42 výkalů za použití Postgate média. Tři další vzorky byly nalezeny pozitivní s testovacím kitem Labège®. Mezi 110 studovanými pacienty byl SRB detekován kulturou u 45 pacientů (41%). Tři další vzorky poskytly nejednoznačné výsledky s testovací soupravou Labège® (přítomnost tmavě nahnědlé sraženiny). Průměrné doby detekce růstu SRB byly 2 a 6 dní při použití testovací sady Labège® (rozmezí 1-11 dní) a média Postgate (rozmezí 3-39 dnů). Průměrný počet SRB ve stolici zdravých jedinců a pacientů byl 105 g−1 (rozmezí 102-109 g-1). Počet SRB tedy nesouvisel s klinickým stavem pacientů.

3.2 identifikace SRB multiplexem PCR

citlivost testu multiplexu PCR byla 100 bakterií na ml. Jeho specificita byla zjištěna nepřítomností křížových reakcí mezi čtyřmi diferencovanými genospeciemi. Každá pozitivní kontrola byla shledána pozitivní pouze s odpovídající sadou primerů. Všechny kmeny používané jako negativní kontroly ke kontrole specificity, včetně typových kmenů D. gigas a D. vulgaris, daly negativní výsledky se čtyřmi sadami primerů. Specificita reakcí byla dále potvrzena sekvenováním amplifikovaných produktů. Získané sekvence vždy odpovídaly očekávaným. Pro SRB-negativní vzorky pomocí PCR, 16S rDNA amplifikace povoleno zahodit možnost inhibice PCR kontaminanty.

pacienti z Hepato-Gastroenterologie Jednotky, 45 pozitivní a tři nejednoznačné výkaly dal pozitivní výsledky pomocí PCR. Odpovídali D. pigerovi (n=33), D.fairfieldensis (n=14) nebo oběma (n=1). Nebyl prokázán žádný d. desulfuricans (Tabulka 3). Kulturně negativní baňky byly také negativní pomocí PCR.

3.3 Vztah Desulfovibrio druhů s IBD

šíření druhů významně nelišily při porovnání zdravých jedinců a pacientů s non-zánětlivé onemocnění střev. D.piger byl sotva převládající než D. fairfieldensis. Naopak u pacientů s IBD byl D. piger 4krát častější než D. fairfieldensis. Tento rozdíl byl patrný zejména u CD, protože pacienti s IBD sestávali hlavně z pacientů s CD. Dále, prevalence D. holky byla významně vyšší u pacientů hospitalizovaných pro IBD ve srovnání se zdravými jedinci, nebo u pacientů hospitalizovaných pro jiná onemocnění (P<0.05). Neexistoval žádný vztah mezi stadiem onemocnění a přítomností SRB. Terapie nezměnila míru izolace těchto bakterií.

4 Diskuse

přítomnost SRB ve střevním traktu zvířat a lidí byla uznána za dlouhou dobu, i když identifikace na úrovni druhu zřídka provádí. Naše výsledky potvrzují, že tyto bakterie jsou běžnými obyvateli střevního traktu člověka. Většina studií střevního SRB od pacientů s IBD se spoléhala na mikrobiologickou analýzu fekálních vzorků založenou na kultivaci, a proto identifikovala SRB na úrovni rodu . Nedávné studie však naznačují, že možná role SRB v patogenezi IBD může souviset s fyziologickými a / nebo fylogenetickými rozdíly mezi kmeny SRB . Proto jsme vymysleli multiplex PCR pro identifikaci těchto bakterií na úrovni druhů. Vzhledem k obtížnosti izolace a vzácnosti specifických vyhledávání je prevalence SRB v lidských klinických vzorcích jistě podceňována. Test-kit Labège®, vyvinutý pro detekci SRB z environmentálních vzorků, se ukázal jako vhodné médium pro detekci SRB z výkalů i z tělních tekutin (Loubinoux, nepublikovaný výsledek). Bylo prokázáno výrobcem růst životního kmeny SRB jako D. desulfuricans DSM 1926, Desulfotomaculum nigrificans DSM 574T, Desulfobacter postgatei DSM 2034T a Desulfobulbus propionicus DSM 2032T. V našich rukou se ukázalo, že je citlivější než běžně používané médium Postgate, protože u pacientů bylo zjištěno šest dalších izolátů Desulfovibrio. Navzdory bohaté doprovodné flóry, Test-kit Labège® povoleno rychlý růst SRB ze stolice vzorků jako střední čas detekce byl 2 dny (oproti 6 dní v Postgate je střední). To může souviset s kvalitou média, ale také se způsobem inokulace vzorků, který zajišťuje udržení přísné anaerobiózy. Ve srovnání s Postgate je střední, přidání acetát laktát rozšiřuje detekci spektra o pomalu rostoucí acetát metabolismem SRB jako Desulfobacter spp. Navíc přítomnost citrátu titaničitého, který je velmi účinným redukčním činidlem (redoxní potenciál Test-kit Labège® je asi -600 mV), umožňuje rychlejší detekci většiny kmenů SRB.

je možné, že některé kmeny SRB nebyly detekovány Test-kit Labège®, být zarostlý doprovodné flóry nebo z důvodu nízké číslo ve vzorcích. Nicméně, Test-kit Labège® je přizpůsobena k růstu nejvíce SRB, a všechny pozitivní baněk byly identifikovány pomocí PCR jako D. holky, D. fairfieldensis nebo D. desulfuricans. Přes inkubační dobu 2 měsíce nebyly prokázány žádné další druhy. Je tedy možné, že naše zjištění odpovídají skutečné lidské flóře sestávající téměř výhradně z D. pigera A D. fairfieldensis. D. desulfuricans byl izolován jednou a byl také popsán u lidí v předchozí studii, ale ve střevním traktu je pravděpodobně neobvyklý. Ve většině případů D. piger A D. fairfieldensis se vzájemně vylučovaly. Spojení obou druhů bylo pozorováno pouze jednou v případě rakoviny tlustého střeva. K potvrzení téměř non-překrývání výskytu D. holky a D. fairfieldensis, pět kolonií SRB dospělý v pevné Postgate je střední byly identifikovány pomocí PCR pro každý pozitivní Test-kit Labège®. V každém případě byl dosažen stejný výsledek a pět kolonií patřilo ke stejnému druhu(údaje nejsou zobrazeny). Provedli jsme také sledování 10 pacientů (pět SRB pozitivních a pět SRB negativních) po dobu 2 měsíců a stolice byly kultivovány každý týden. U každého pacienta byl stejný výsledek (SRB-pozitivní nebo SRB-negativní) získán se všemi vzorky(údaje nejsou zobrazeny). Nicméně, bylo by zajímavé sledovat pacientů s IBD po delší dobu, aby se zjistit, zda aktivita onemocnění má důsledek na populaci SRB.

D. desulfuricans je běžně izolován od prostředí, a také byl považován za nejrozšířenější druhy Desulfovibrio u lidí, až do nedávné popis D. fairfieldensis. Člověk tak může být překvapen velmi nízkým výskytem d. desulfuricans v naší populaci. Až dosud byly D. piger A D. fairfieldensis izolovány výhradně z lidských vzorků. Naše výsledky tedy ukazují, že oba druhy mohou být specifické pro lidský střevní trakt. To však musí být určeno specifickým hledáním těchto bakterií v jiných ekologických výklencích. D. piger byl popsán pouze jednou a byl považován za neobvyklý nález u lidí. Naše výsledky naznačují, že to může být nejčastější SRB ve střevním traktu. Tento druh však nebyl nikdy popsán v infekčních procesech. Naopak D. fairfieldensis, zjevně méně častý v lidských výkalech, byl izolován mimo lumen tlustého střeva z krve a septických sbírek . Tedy, D. fairfieldensis může mít další invazivní vlastnosti ve srovnání s jinými druhy Desulfovibrio, což by vysvětlovalo jeho zotavení z klinických vzorků. Je zajímavé, že v našem seriálu pacientů, prevalence D. holky ve stolici je výrazně vyšší u pacientů hospitalizovaných pro IBD (převážně CD) než u zdravých jedinců nebo u pacientů hospitalizovaných pro jiná onemocnění. To může mít dvě vysvětlení: buď D. holky má fyziologické vlastnosti, které způsobují, že nástupu léze a/nebo se podílet na přetrvávání chronické zánětlivé procesy, nebo kolonizace tohoto druhu je zvýhodněný místních podmínek v IBD pacientů. Spojení SRB s IBD již bylo popsáno . D. piger nebyl od svého prvního popisu v roce 1976 dále zvažován . To znamená, zjištění, že tato bakterie, která se považují za ‚non-patogenní druh, je častým obyvatelem lidských střev a nejrozšířenější druhy SRB v IBD pacientů je překvapující. Měly by být provedeny další studie, aby se objasnil způsob, jakým může být D. piger zapojen do těchto chronických zánětlivých procesů.

poděkování

tato práce byla částečně podpořena compagnie Française de Géothermie (Orléans, Francie) a FCT grantem posti 36562 / ESP / 2000 ICP. Jsme zavázáni k pozdní Dr. Wee Tee (University of Melbourne, Austrálie) za laskavé poskytnutí čtyři kmeny D. fairfieldensis (včetně kmen ATCC 700045) a také Prof. D. Raoult (University of Marseille, Francie) za poskytnutí jeden kmen D. fairfieldensis. Děkujeme D. Meng a a. M. Carpentier (Laboratoire de Bactériologie-Virologie UMR CNRS 7565) pro jejich vynikající technické pomoci, Dr. a. Dao a Prof. B. Fortier pro poskytování stolice od zdravých jedinců, stejně jako sestry z Hepato-Gastroenterologie Jednotky za jejich laskavost.