- Abstrakt
- 1. Úvod
- 2. Materiály a metody
- 2.1. Zvířata
- 2.2. Buněčné Kultury
- 2.3. Imunofluorescenční Barvení Test
- 2.4. Western Blot
- 2.5. Kvantitativní (Real-Time) Polymerázová Řetězová Reakce (Real-Time PCR)
- 2.6. Statistická analýza
- 3. Výsledky
- 3.1. Rozdělení Astrocyty Označeny NDRG2, GFAP a S100ß v Různých Mozkových Oblastí,
- 3.2. V Morfologii Astrocytů Označeny NDRG2, GFAP a S100ß v Různých Mozkových Oblastí,
- 3.3. Na Colocalization z NDRG2, GFAP a S100ß do Astrocytů v Různých Mozkových Oblastí,
- 3.4. Vyjádření NDRG2, GFAP a S100ß Proteinů v Různých Mozkových Oblastí,
- 4. Diskuse
- dostupnost dat
- zveřejnění
- střet zájmů
- příspěvky autorů
- Poděkování
- doplňkové materiály
Abstrakt
Astrocyty mají různé morfologické charakteristiky v závislosti na mozkové oblasti, ve které se nacházejí. Žádný ze současných astrocytických markerů však nemůže úspěšně označit všechny subpopulace. Identifikace vhodného markeru pro konkrétní vědecké zkoumání je tedy kritická. Tady, porovnali jsme distribuci a proteinovou expresi tří markerů astrocytů: Ndrg2, GFAP a S100ß, v kůře, hipokampu a thalamu. Ndrg2-a s100ß-pozitivní astrocyty byly distribuovány rovnoměrněji než GFAP-pozitivní astrocyty v celém mozku. Imunoreaktivity NDRG2 a S100ß byly nejsilnější v dorzální kůře a thalamu, zatímco imunoreaktivita GFAP byla nejsilnější v hipokampu. Kromě toho byly hladiny proteinové exprese NDRG2, GFAP a S100ß u dospělých myší nejvyšší v kůře, hipokampu a thalamu. Také jsme zjistili astrocyte morfologie a zjistil, že v corpus callosum a mozkový stopky, GFAP pozitivní astrocyty byly nalezeny s početnější a delší procesy než NDRG2 – a S100ß-pozitivní astrocyty. Tyto výsledky ukazují, že NDRG2 a S100ß se vhodněji používají k vizualizaci celkové distribuce a změn počtu astrocytů, jakož i označení astrocytů v kůře a thalamu. GFAP se však vhodněji používá k označení astrocytů v corpus callosum, mozkovém stopce a hipokampu. Tyto výsledky pomoci průvodce vědci při výběru vhodné astrocyte značku a naznačují rozdíly v imunologické vlastnosti astrocytů na základě tkáně, ve které se nacházejí.
1. Úvod
astrocyty jsou již dlouho považovány za pomocné buňky, které poskytují neuronům pouze trofickou, metabolickou a strukturální podporu . V posledních letech však rozsáhlý výzkum ukázal, že hrají zásadní roli v mozkových fyziologických a patologických funkcích. Astrocyty pomoc při udržování iontové homeostázy a krevní mozkové bariéry, synapse tvorbu a odstranění, stejně jako ovládání cerebrální průtok krve a regulaci neurotransmiterů recyklace, glutamátové excitotoxicitě, a antioxidační stres . Důležité je, že astrocyty mají morfologické, populační a funkční rozdíly v různých mozkových oblastech . Proto, identifikace nejvhodnějšího markeru pro polymorfní a vícenásobné podskupiny astrocytů je rozhodující pro výzkum astrocytární Multifunkce.
Gliální fibrilární kyselý protein (GFAP) je nejvíce běžně používané astrocytic značku, ale jako major střední vlákna tvořící cytoskelet, GFAP immunolabeled jen asi 15% z celkového objem astrocytu , a více než 40% z astrocytů bylo zjištěno, že GFAP negativní v dospělém rat hippocampus . Navíc, GFAP označeny protoplazmatický lidské astrocyty špatně a byl vyjádřen pozdě v rozvoji fibrózní astrocyty .
Další běžně používané astrocytic marker je S100ß, Ca2+ vazba peptid vyskytující se v cytoplazmě a jádře astrocyty, že je zapojen do buněčného cyklu regulace a změny cytoskeletu . S100ß je však také exprimován v subpopulaci zralých oligodendrocytů, v epiteliálních buňkách choroidního plexu a v několika neuronech . Nedostatky GFAP a S100ß při označování astrocytů mohou vést k nepřesnostem nebo dokonce chybám při zkoumání funkcí astrocytů.
n-Myc downstream-regulovaný Gen 2 (NDRG2) byl poprvé objeven v normální lidské mozkové knihovně cDNA metodou subtraktivní hybridizace založenou na PCR . Jedná se o tumor supresor a Gen související s buněčným stresem spojený s proliferací a diferenciací buněk . Ndrg2 je široce exprimován v mozkové kůře, čichové žárovce, midcerebrální, hipokampu a thalamu . A co je nejdůležitější, NDRG2 je specificky exprimován v astrocytech mozku . Tak, NDRG2 je považován za román astrocytic marker, zejména pro zralou, nereaktivní, a nonproliferating astrocyty . Nicméně, ať už NDRG2 je spolehlivější než GFAP a S100ß jako astrocytic značku, stejně jako rozdíly v jejich distribuci a výraz v různých mozkových oblastech, nejsou hlášeny.
V současné studii jsme porovnávali rozložení, exprese proteinů, a vzájemné colocalization of astrocytic značky NDRG2, GFAP a S100ß v průběhu celého mozku myší. Zaměřili jsme se na identifikaci nejvhodnějšího markeru pro astrocyty v různých mozkových oblastech.
2. Materiály a metody
2.1. Zvířata
Mladé, dospělé, staré a C57BL/6 myších samců ve věku 1 měsíc, 3 měsíce, 6 měsíců, 9 měsíců a 12 měsíců byly získány z Experimentálních Zvířat Čtvrti Central South University. Zvířata byla volně jíst a pít, udržována při teplotě 25 ± 1°C a umístěna ve světle tmavém kruhu 12: 12-h, aby simulovala cirkadiánní rytmus zvířete. Bylo vynaloženo veškeré úsilí k minimalizaci utrpení zvířat a ke snížení počtu použitých zvířat. Všechny zvířecí experimentální postupy protokol schválil Etický Výbor pro Pokusy na Zvířatech Centrální Jižní University Animal Péče a Používání Výboru, Čína.
2.2. Buněčné Kultury
HT22 buněk (neuronů) a MA1800-57 buněk (astrocyte buněčné linie) byly kultivovány v Dulbecco ‚s Modified Eagle‘ s Medium (DMEM, HyClone) obsahujícím 10% fetální bovinní sérum (FBS, Gibco), 50 U/mL penicilinu a 50 µg/mL streptomycinu. Na OLN-93 buněk (oligodendroglial buněčné linie) byly uchovávány ve doplněno DMEM s 10% FBS, 2 mM Glutamin, 50 U/mL penicilinu a 50 µg/mL streptomycinu. Všechny buňky byly udržovány při 37°C ve směsi 95% atmosférického vzduchu a 5% CO2. Na HT22 buněk, OLN-93 buněk, a MA1800-57 buňky byly nasazeny na skluzavky a byly obarveny protilátkami proti mikrotubulové-associated protein 2 (MAP2), α-tubulinu, a GFAP, resp.
2.3. Imunofluorescenční Barvení Test
Po myši byly v narkóze s sodíku pentobarbitalu (50 mg/kg), jejich cerebrums byly extrahovány a fixovány 0.9% zima heparinizovaným fyziologickým roztokem a 4% paraformaldehydem. Po postfixaci byly cerebrumy postupně dehydratovány ve 20% sacharózových a 30% roztokech sacharózy. Řezy o tloušťce 10 µm byly připraveny za použití zmrazeného kráječe Leica CM1900. Mozkové řezy byly inkubovány v 1% H2O2 po dobu 15 min a 0,3% Triton X-100 po dobu 15 min, s 3×promytí v PBS postincubation mezi každé ošetření. Oddíly pak byly blokovány v 5% normálním kozím séru po dobu 1 h při pokojové teplotě a inkubovány přes noc při 4°C v zvlhčování box s primární protilátky takto: mouse anti-GFAP protilátky (#3670, 1:500, Buněčné Signalizace Technologie); králičí anti-NDRG2 protilátek (#5667, 1:200, Buněčné Signalizace Technologie); myší anti-NDRG2 protilátek (#DA281-6A5, 1:100, Sigma); králičí anti-S100ß protilátek (#2017-1, 1:500, Epitomics); myší anti-Glutamin Syntetáza (GS), protilátky (#MAB302, 1:200, Millipore); králičí anti-MAP2 protilátek (#ab32454, 1:500, Abcam); a myš, anti-α-tubulin protilátek (#T6199, 1:500, Sigma). Pak, řezy byly inkubovány se směsí Alexa-488 (zelená, Invitrogen) a Alexa-647 (červená, Invitrogen)-konjugované oslí anti-králičí nebo oslí anti-myší sekundární protilátky po dobu 2 h ve tmě při pokojové teplotě. 4,6-Diamidino-2-fenylindol (DAPI) (ZLI-9557, Zsbio) byl použit k barvení jader. Sekce byly namontovány s 50% glycerolem. Nakonec byly sekce prohlíženy a fotografovány pomocí fluorescenčního mikroskopu Olympus BX51 (Japonsko). Protilátky použité v naší studii byly široce používány v našich předchozích studiích a jinými vyšetřovateli a citlivost a specificita těchto protilátek byla potvrzena.
2.4. Western Blot
kůra, hippocampus a thalamus byly odebrány z myší C57BL/6 ve věku 1 měsíc, 3 měsíce, 6 měsíců, 9 měsíců a 12 měsíců. Vzorky byly homogenizovány v RIPA pufru a koncentrace proteinových vzorků byla měřena pomocí BCA Protein Assay Kit (Pierce Biotechnology, US). Vzorky proteinu byly odděleny 10% SDS-PAGE (SDS-PAGE Gel kit, CW0022S, Čína) a elektricky přeneseny na polyvinyliden difluoridové (PVDF) membrány. Součásti SDS-PAGE Gel kit obsahuje 30% Acr-Bis, SDS-PAGE Dělící Gel Buffer, SDS-PAGE Stacking Gel Buffer, APS (ammonium persulfate), a TEMED (N, N, N‘, N‘-tetramethylethylenediamine). Následně se membrány byly blokovány v 5% netučného sušeného mléka, zředěný v TBST (TBS s 0,05% Tween 20) po dobu 1 h při pokojové teplotě a pak inkubovány se specifickými primární protilátky: myší anti-GFAP protilátky (#3670, 1:1000, Buněčné Signalizace Technologie); králičí anti-NDRG2 protilátek (#5667, 1:1000, Buněčné Signalizace Technologie); králičí anti-S100ß protilátek (#2017-1, 1:1000, Epitomics); a králičí anti-GAPDH protilátek (#5174, 1:1000, Buněčné Signalizace Technologie) přes noc při 4°C. membrány byly poté inkubovány s HRP-konjugované sekundární anti-králičí nebo anti-myší protilátky (Thermo Scientific, USA) po dobu 2 h. Chemiluminiscenční signály byly vyvinuty pomocí Western Blesk Chemiluminiscenční Činidlo Plus (PerkinElmer Life Sciences; Wellesley, MA) a detekován analyzátorem obrazu li-COR Odyssey System (li-Cor Biotechnology, USA). Imunoreaktivita pásem proteinů byla kvantitativně analyzována softwarem Bio-Rad® Image Lab™. Hodnoty hustoty pásma byly normalizovány na GAPDH.
2.5. Kvantitativní (Real-Time) Polymerázová Řetězová Reakce (Real-Time PCR)
kortexu, hipokampu, thalamu byly shromážděny z C57BL/6 myší ve věku 1 měsíc, 3 měsíce, 6 měsíců, 9 měsíců a 12 měsíců. Celková RNA byla izolována pomocí sady TransZol Up Plus RNA (kód č. ER501-01, Transgen, Čína) a kvantifikováno pomocí NanoDrop 2000. Pak, 1000 ng celkové RNA byla přepsána reverzní v 20 µL reakce na 42°C po dobu 15 min., následuje 85°C po dobu 5 sec pomocí TransScript® All-in-One First-Strand cDNA Syntézu SuperMix pro qPCR (Kód Ne. AT341, Transgen, Čína). Komponenty kit obsahuje 5×TransScript® All-in-One SuperMix pro qPCR (TransScript® RT, RNase Inhibitor, Ukotvených Oligo(dT)18 Primer, Random Primer(N9), dntp, pufr), 5×TransScript® All-in-One Ne-RT Ovládací SuperMix pro qPCR, gDNA Remover a RNase-free vody. Jako negativní kontrola byl použit 5×TransScript® All-in-One no-RT Control SuperMix pro qPCR. PCR v reálném čase byla provedena v reakci 20 µL podle návodu výrobce pro TransStart Tip Green qRNA SuperMix (kód č. AQ141, Transgen, Čína). Použité primerové sekvence mRNA lze nalézt v tabulce 1. Reakce byla provedena při 94°C po dobu 30 sekund, následuje 40 cyklů 94°C po dobu 5 sec, 60°C po dobu 15 sec, 72°C po dobu 19 sekund na ViiA7 Real-Time PCR Detection System (2720 Thermal Cycler, Applied Biosystems). Primery a sekvence odvozené z relativní mRNA exprese byly analyzovány pomocí vzorce .
|
||||||||||||||||||||||||
2.6. Statistická analýza
statistické testy byly provedeny pomocí softwaru PRISM V7.0 (GraphPad). Srovnání mezi dvěma skupinami bylo provedeno pomocí studentských t-testů. Srovnání mezi různými skupinami byla provedena pomocí jednosměrné ANOVY s tukeyho posttestem. Všechny hodnoty byly prezentovány jako průměr ± SD. Hodnoty p<0,05 byly považovány za statisticky významné.
3. Výsledky
3.1. Rozdělení Astrocyty Označeny NDRG2, GFAP a S100ß v Různých Mozkových Oblastí,
regiony myši cerebra byly identifikovány podle označení buněčné jádra. K ověření konkrétních analyzovaných oblastí byl navíc použit odpovídající atlas mozku myši (obrázek 1). Pak jsme použili imunofluorescenční barvení pro detekci distribuce astrocyty označeny NDRG2, GFAP a S100ß v různých mozkových oblastech dospělých samců myší ve věku 6 měsíců. Ndrg2-a s100ß-pozitivní astrocyty byly hojnější a rovnoměrněji distribuovány než GFAP-pozitivní astrocyty v celém mozku (Obrázek 2). NDRG2-pozitivní astrocyty byly soustředěny v dorzální kůře (Oblast 1) a thalamus (Region 5), ale méně tak v hipokampu (Region 4), corpus callosum (Region 3), a spodní kůry (Oblast 2) a nejméně v mozkové stopky (Region 6) (Obrázky 2(a) a 2(b)). Astrocyty pozitivní na GFAP byly nejvíce koncentrovány v hipokampu; méně byly nalezeny v corpus callosum a mozkový stopky a téměř nezjistitelné v dorzální kůry, spodní kůry a thalamu (Obrázky 2(a) a 2(c)). S100ß-pozitivní astrocyty byly soustředěny nejvíce v dorzální kůře a thalamu, méně v hipokampu a ventrálního kůry, a nejméně ze všech v mozkové stopky a corpus callosum (Obrázky 2(b) a 2(c)). Distribuce astrocytů pozitivních na NDRG2 byla podobná distribuci astrocytů pozitivních na s100ß.
(a)
(b)
(a)
(b)
(a)
(b)
(c)
(a)
(b)
(c)
Astrocyty v různých mozkových regionů prezentovány unequable immunoreactivities na NDRG2, GFAP a S100ß (Obrázek 2). Astrocyty v dorzální kůře a thalamu silně reagovaly na NDRG2 a S100ß, ale slabě na GFAP. Astrocyty v hipokampu silně reagovaly na GFAP a mírně na NDRG2 a S100ß. Astrocyty ve ventrální kůře, corpus callosum a mozkovém stopce reagovaly slabě až mírně na NDRG2, GFAP a S100ß (Tabulka 2).
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|
+++: silně pozitivní; ++: mírně pozitivní; +: slabě pozitivní.
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
rozdělení astrocyty označeny NDRG2, GFAP a S100ß v různých mozkových oblastech myších samců byla podobná starých samců myší (12 měsíců) (Obrázek 3).
3.2. V Morfologii Astrocytů Označeny NDRG2, GFAP a S100ß v Různých Mozkových Oblastí,
Astrocyty jsou rozděleny především do dvou typů: vláknité astrocyty v bílé hmotě a protoplazmatické astrocyty v šedé hmotě. Proto jsme porovnali morfologie dvou typů označených různými markery v corpus callosum (bílá hmota, oblast 3) a hippocampus (šedá hmota, oblast 4) (Obrázek 4). Výsledky z dospělého samce myši (6 měsíců) ukázal NDRG2 – a S100ß-pozitivní astrocyty představila hvězdicovitý tvar, vyznačující se tím, velké a kulaté soma spolu s krátkými a hrubými cytoplazmatické procesy, které měl několik větví. Astrocyty pozitivní na GFAP představovaly radiální tvar charakterizovaný malými soma, dlouhými procesy a multibranches (obrázek 4). Navíc, v corpus callosum a mozkový stopky, astrocyty označeny GFAP prezentovány s hojnější delší procesy, než ty, označeny NDRG2 a S100ß (Obrázky 5 a 7).
3.3. Na Colocalization z NDRG2, GFAP a S100ß do Astrocytů v Různých Mozkových Oblastí,
NDRG2 byl téměř colocalized s GFAP v astrocytech ventrální kůra, corpus callosum, a mozková stopka, a většinou colocalized s GFAP v astrocytech hipokampu (Čísla 5 a 8(a)). NDRG2 neměl téměř žádnou kolokalizaci s GFAP v astrocytech dorzální kůry a thalamu (obrázek 5). NDRG2 a S100ß představovaly téměř úplnou kolokalizaci v astrocytech šesti mozkových oblastí (obrázky 6 a 8(b)). GFAP a S100ß prezentovány s významnou colocalization v astrocytech ventrální kůra, corpus callosum, a mozková stopka a téměř kompletní colocalization v astrocytech hipokampu (Obrázek 7). GFAP a S100ß neměly téměř žádnou kolokalizaci v astrocytech dorzální kůry a thalamu (Obrázek 7).
(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
také Jsme zjistili colocalization z NDRG2 a další astrocytic maker, glutamin syntetáza (GS), v astrocyty myší mozek. NDRG2 a GS měly významnou kolokalizaci v astrocytech (obrázek s1a). NDRG2 a GS prezentovány důkladné colocalization v vláknité astrocyty v corpus callosum a v protoplazmatický astrocytů hipokampu (Obrázek s1b). NDRG2 exprese proteinů v neuronální buněčné linii HT22 buněk, oligodendroglial buněčné linie OLN-93 buněk, a astrocytic buněčné linie MA1800-57 buňky byly také detekovány (Obrázek s2). Protein NDRG2 byl detekován v buňkách MA1800-57 a byl sotva detekován v buňkách HT22 a buňkách OLN-93 (obrázky s2a a s2b).
3.4. Vyjádření NDRG2, GFAP a S100ß Proteinů v Různých Mozkových Oblastí,
Jsme použili western blotting pro detekci exprese úrovně NDRG2, GFAP a S100ß proteiny ve třech mozkových oblastech dospělých myších samců (6 měsíců): kůra, hippocampus a thalamus (Obrázek 8(c)). Analyzovali jsme úrovně exprese těchto markerů ve stejné mozkové oblasti (Obrázek 8 (d)). V kůře, úroveň NDRG2 výraz byl výrazně vyšší než GFAP a S100ß úrovních exprese (p<0.001, p<0.05). Úroveň exprese S100ß byla také mnohem vyšší než GFAP (p<0.05). V hipokampu byla úroveň exprese GFAP vyšší než NDRG2 a S100ß (p< 0.01), a úroveň exprese NDRG2 byla o něco menší než úroveň exprese S100ß, i když rozdíl nebyl statisticky významný. V thalamu, hladina exprese S100ß byla výrazně vyšší než u GFAP a NDRG2 úrovních exprese (p<0.01), zatímco úroveň NDRG2 výraz byl podobný tomu GFAP.
dále jsme analyzovali úrovně exprese stejného markeru v různých mozkových oblastech (Obrázek 8(e)). Úroveň NDRG2 výraz v kůře byla mnohem vyšší, než v hipokampus a thalamus (p<0.01), a žádný významný rozdíl byl pozorován mezi hipokampus a thalamus. Úroveň exprese GFAP v hipokampu byl nejvyšší mezi tři regiony (p<0.001, p<0.01); žádný významný rozdíl byl pozorován mezi mozkové kůry a thalamu. Úroveň exprese S100ß v thalamu byla významně vyšší než v kůře a hipokampu (p< 0.01), přičemž mezi posledními dvěma nebyl pozorován žádný významný rozdíl.
Jsme také detekován protein úrovně NDRG2, GFAP a S100ß v kortexu, hipokampu, thalamu u myších samců ve věku 1 měsíc, 3 měsíce, 6 měsíců, 9 měsíců a 12 měsíců (Čísla 9(a)-9(f)). Protein úrovně NDRG2 a GFAP v kortexu, hipokampu, thalamu postupně zvyšuje s věkem (p<0.05, p<0.01). Hladiny bílkovin S100ß v kůře a thalamu, ale ne v hipokampu, se s věkem postupně zvyšovaly (p< 0.05, p<0.01, p< 0.001). MRNA hladiny NDRG2, GFAP a S100ß v kortexu, hipokampu a thalamu u myších samců ve věku 1 měsíc, 3 měsíce, 6 měsíců, 9 měsíců a 12 měsíců byly shodné s těmi z hladiny proteinů (p<0.05, p<0.01, Čísla 9(g)-9(i)).
(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)
(h)
(i)
(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)
(h)
(i)
4. Diskuse
V této studii, jsme zjistili, že astrocyty označeny NDRG2 a S100ß byly distribuovány více široce a rovnoměrně, než ty označené pomocí GFAP v celém mozku mladých, zralých a starých myší. To naznačuje, že NDGR2 a S100ß jsou vhodnější markery sledovat celkové rozložení a počet změn astrocytů. Navíc, naše výsledky ukázaly, že astrocyty v různých mozkových regionů prezentovány různé úrovně imunoreaktivitu na NDRG2, GFAP a S100ß, což naznačuje, že v kůře a thalamu, NDRG2 a S100ß jsou vhodnější astrocytic značky než GFAP. Nepřekonatelná imunoreaktivita astrocytů na NDRG2, GFAP a S100ß může být také způsobena citlivostí a specificitou protilátek, které jsme použili. Navíc, morfologii astrocytů označeny NDRG2 a S100ß byly podobné navzájem, ale byly zjevně odlišné od těch, označeny GFAP, protože tyto značky označeny různými cytoskeletální struktury. NDRG2 obarví cytoplazmu a buněčné membrány a slabě obarví jádro . GFAP hlavně skvrny soma a procesy, ale ne jádro, zatímco S100ß skvrny jádra a část cytoplasmy a procesů . Porovnáním morfologii astrocytů označeny NDRG2, GFAP a S100ß, zjistili jsme, že GFAP byl vhodnější marker pro astrocyty v corpus callosum, mozková stopka, a zejména hipokampu. Proteiny NDRG2 a S100ß byly nejvíce exprimovány v kůře a thalamu. Usuzujeme, že NDRG2 je vhodnější pro astrocyty v mozkové kůře, zatímco S100ß je vhodnější pro astrocyty v thalamu při kvantifikaci astrocytic hustoty. Různé proteinové exprese vzory NDRG2, GFAP a S100ß v kortexu, hipokampu, thalamu potvrdil astrocytic funkční heterogenity.
bylo zjištěno, že astrocyty hrají důležitou roli při udržování homeostázy a aktivně se účastní téměř všech neurologických poruch, jako jsou ischemické mrtvice, traumatická poranění mozku, Alzheimerova choroba a Parkinsonova choroba . Bylo prokázáno, že astrocytická morfologie, genová exprese a funkce se lišily mezi různými oblastmi mozku . Vláknité astrocyty a protoplazmatické astrocyty jsou dvě hlavní subpopulace identifikované jejich morfologií . Vláknité astrocyty mají dlouhé, tenké procesy, a hvězda jako vzhled, zatímco protoplazmatický ty mají četné jemné procesy, které kontakt a pouzdro synapse . Je zajímavé, že mnoho genů je heterogenně exprimováno podmnožinami astrocytů. Tyto geny kódují proteiny, jako jsou glutamátové transportéry a iontové kanály , stejně jako glutamátové , dopaminové a opioidní receptory .
heterogenita genové exprese znamenala funkční rozmanitost astrocytů. Například příjem glutamátu se liší mezi různými podskupinami . Kromě toho se spontánní oscilace vápníku liší mezi různými vrstvami somatosenzorické kůry. Astrocyty kortikální vrstvy 1 vykazovaly častou asynchronní aktivitu Ca2+, zatímco astrocyty vrstvy 2/3 vykazovaly občasnou synchronní aktivitu Ca2+. V kůře reagují astrocyty na glutamát a norepinefrin se zvýšením vápníku, zatímco hipokampální astrocyty vykazují vápenaté reakce na ATP, GABA, glutamát, acetylcholin, prostaglandiny a endokanabinoidy . Studie také ukázaly, že Kultivované astrocyty z různých oblastí mozku mají různé schopnosti stimulovat růst neuritů a větvení . Jako astrocyty v různých oblastech mozku představují různé vlastnosti morfologie a funkce, určit nejvhodnější marker pro astrocyty v různých mozkových regionů je zásadní pro astrocytic vědci.
ačkoli bylo hlášeno několik proteinů selektivně exprimovaných astrocyty, žádný nebyl zcela omezen na všechny astrocytické podtypy. GFAP, nejrozšířenější astrocytic značku, je přednostně vyjádřeny v bílé hmotě astrocyty nad šedé hmoty ty a nedokáže popsat všechny procesy astrocyty . Ještě důležitější je, že existují podmnožiny GFAP-negativních astrocytů, které představují napěťově závislé k + proudy, zatímco GFAP-pozitivní astrocyty představují klasický vzorec časově a napěťově nezávislých proudů .
předchozí studie zjistily, že S100ß byl schopen označit astrocyty v šedé i bílé hmotě; byl však také exprimován v několika oligodendrocytech a neuronech . S100ß bylo zjištěno, že být vyjádřeny většinou v thalamu astrocyty, podtypu buněk, které se podílejí na čištění DAergic nečistoty produkované degenerace DAergic terminály u Parkinsonovy choroby, tím, že usnadňuje přítomnost lyzosomy a tvorbu autophagosomes . Transkriptomická analýza astrocytů identifikovala rodinu aldehyddehydrogenázy 1, člen L1 (ALDH1L1), jako astrocytický marker . ALDH1L1 však také označil oligodendrocyty . Podobně, excitační aminokyseliny transportérů glutamátu/aspartát transportér (GLAST), glutamin syntetáza (GS), glutamát transportéru-1(GLT-1), vimentinu, connexin 43, aquaporin 4, a buněčného povrchového glykoproteinu CD44 měl také omezení při označování astrocyty .
NDRG2 je výslovně vyjádřeno v astrocytech obou potkanů a myší a je spojena s růstem a zrání embryonální vývoj mozku . Kromě buněčné proliferace, diferenciace a transmembránových transportů se NDRG2 podílí také na stresových reakcích, depresi, ischemických onemocněních a neurodegenerativních poruchách . U myší a lidí se NDRG2 podílí na vývoji poruchy pozornosti / hyperaktivity (ADHD), což je onemocnění spojené s pohybovým centrem v mozkové kůře . Flugge a kol. detekována exprese NDRG2 v cerebrums lidí, kosmani, strom, rejsci, krysy a myši, a navrhl, NDRG2 byl nový astrocytic marker, zejména pro zralou, nereaktivní, a nonproliferating astrocyty . V této studii jsme se poprvé zjištěna distribuce vzor NDRG2-pozitivní astrocyty v různých mozkových regionů a rozdíly s astrocyty označeny klasické markery GFAP a S100ß.
astrocyty a astrocytické markery se během normálního stárnutí mozku změnily. Předchozí práce ukázala, že astrocyty jsou aktivovány brzy ve stárnutí a významné zvýšení astrocytů pozitivních na GFAP bylo zjištěno v hipokampálních oblastech starých myší . Hladiny GFAP proteinu a GFAP mRNA se zvýšily v různých částech stárnoucích mozků, jako je mozková kůra, hipokampus a cerebellum . Mezi různými zprávami o s100ß ve stárnoucím mozku zůstávají nesrovnalosti . Studie stále více ukázaly, že NDRG2 je spojován s poruchami souvisejícími s věkem, jako je Alzheimerova choroba. V naší studii hladiny GFAP a NDRG2 mRNA v kůře, hipokampu, thalamu postupně zvyšuje s věkem, zatímco hladiny S100ß mRNA v hipokampu a thalamu se zvyšuje s věkem, ale ne v kůře.
měli Bychom si uvědomit, že v současné době, mnoho značky kromě těch, které jsme testovali, jako ALDH1L1, GLAST, GLT-1, CD44, a vimentinu, se používá k označení astrocyty. V naší studii jsme pouze oproti klasické mozkové astrocyty označeny románu navrhla značka NDRG2 a nejčastěji používané markery: GFAP, S100ß a GS v mozku.
Na závěr naše studie ukazuje, že NDRG2 a S100ß jsou vhodnější markery astrocytů v mozkové kůře a thalamu, respektive, stejně jako pro pozorování celkové distribuce a změny v počtu astrocytů v celém mozku. Mezitím, GFAP je lepší, aby NDRG2 a S100ß při označování procesů a větve astrocytů v corpus callosum, mozková stopka, a zejména hipokampu. Naše studie ukazuje na důležitost výběru nejvhodnější marker pro astrocyty v různých myší mozkové regiony, které stanoví pokyny pro neurovědy vědci při zkoumání astrocytic funkce.
dostupnost dat
údaje použité na podporu zjištění této studie jsou zahrnuty do článku.
zveřejnění
Zengli Zhang a Zhi Ma jsou spoluautory.
střet zájmů
autoři prohlašují, že nemají žádný střet zájmů.
příspěvky autorů
Zengli Zhang a Zhi Ma přispěli stejnou měrou k této studii.
Poděkování
Tato práce byla podpořena Pekingu Přírodní Science Foundation (ne. 7194321, aby Zhang Lixia), Národní Přírodní Science Foundation Číny (ne. 81801138 k Yulong Ma, bez. 81771206 na Wangyuan Zou), Mladý Učenec Výzkumný Grant Čínské Anesteziolog Asociace (ne. 21700001 k Yulong Ma), Miaopu Založení Čínské PLA General Hospital (ne. 18KMM47 až Lixia Zhang) a Pekingská Městská věda & technologická Komise (no. 1811000017180022 to Hang Guo).
doplňkové materiály
Doplňkový Obrázek 1. Kolokalizace NDRG2 a GS v astrocytech. Doplňující Obrázek 2. Exprese proteinu NDRG2 v buněčných liniích. (Doplňkové materiály)