Actomyosiinin supistumiskaavojen avulla myoblastiviennin avulla ja tehostavat erilaistumista YAP nuclear Exportin kautta

Myoblastit ottavat pitkänomaisen muodon erottaakseen ja säätelemään aktiiniverkostoaan leviämisalueelle

arvioidakseen solumuodon, aktiiniverkoston ja fokaalisten kiinnikkeiden välistä suhdetta, me viljeltiin c2c12 myoblasteja homogeenisella fibronektiinikerroksella (Fn). 24 tunnin viljelyn jälkeen myoblastit kiinnitettiin ja värjättiin aktiinille niiden morfologisten parametrien määrittämiseksi (Kuva. 1 A). FN-pinnoitetut substraatit mahdollistivat spesifisten solujen ja substraattien vuorovaikutusten syntymisen käyttämällä spesifisiä transmembraani-integriinejä. Useat α-integriinialayksiköt, jotka yhdistyvät β1-alayksikköön, ilmenevätkin luuston myogeneesin aikana, sillä ne ovat tärkeitä myogeenisten solujen migraatiossa,myoblastifuusiossa, lihassyyn kypsymisessä tai lihasintegriteetin ylläpidossa32, 33. Laminiinilla(LAM) päällystetyillä substraateilla tehdyt lisäkokeet osoittivat, että molemmat morfologiset parametrit (solun muoto-indeksi, solun kehä ja solun pinta-ala, täydentävä Kuva. 1a) ja solujen ja substraattien vuorovaikutukset (fokaalisten kiinnikkeiden lukumäärä ja pinta-ala, täydentävä Kuva. 1B) olivat tilastollisesti samanlaisia FN: llä ja LAM: llä, validoimalla Fn-päällysteen c2c12-myoblastien morfologioiden tutkimiseksi in vitro fuusio – /differentiaatioprosessin aikana.

Kuva 1

Myoblastit ottavat pitkänomaisen muodon erottaakseen ja säätääkseen aktiiniverkostonsa leviämisalueelle. A) värikoodatut epifluoresenssikuvat tyypillisistä c2c12-yksittäisistä myoblasteista, joissa esiintyy erilaisia Solumuotoindeksejä (CSI) in vitro. Solut värjättiin falloidiinilla aktiiniksi. Asteikkotangot ovat 20 µm. Morfologinen analyysi B) CSI: stä (R2 = 0, 80), C) solun kehästä (R2 = 0, 97) ja D) solun alueesta (R2 = 0.82) osoittavat, että c2c12-solujen keskimääräinen pinta-ala in vitro oli 2057 ± 618 µm2 ja CSI: n keskiarvo 0, 37 ± 0, 15 (n = 101 B, C ja D). Punaiset käyrät ovat Gaussin sopukoita. E) aktiinin fluoresenssin intensiteetin Lineaarinen kehitys solun alueen funktiona (R2 = 0,748, n = 28). Vinkuliinin kokonaispinta-alan kehittyminen solun pinta-alan (F) funktiona (R2 = 0, 783, n = 28) ja (G) sekä F-aktiinin (n = 28) voimakkuus. H) C2c12-myoblastien proliferaation (keltaisena) ja erilaistumisen (punaisena) Aikajana in vitro. Musta nuoli osoittaa proliferaatiovälineiden korvaamista erilaistumisvälineillä. (I, J) Myoblastien kuvasuhde kohdissa P0, P2 (proliferaatiovaiheet, keskiarvo = 0, 40 ± 0, 16, kun P0, n = 150 molemmilla) ja D2 (differentiaatiovaihe, keskiarvo = 0, 24 ± 0, 07, n = 100).

määritimme myoblastien morfologiaa kuvaavan CSI-indeksin antamalla tietoa solujen venymästä. Pyöristettyjen solujen CSI on lähellä 1, kun taas pitkänomaisten solujen CSI on lähellä 0. Löysimme CSI: n 0,1-0,8 keskiarvolla 0.37 ± 0, 15 (n = 101), mikä viittaa suureen vaihteluun solujen morfologioissa (Kuva. 1b). Myoblastien keskimääräinen ympärysmitta oli 259 ± 82 µm (Kuva. 1C, n = 101) ja laaja leviämisalue (~1000 – ~4000 µm2), keskiarvo 2057 ± 618 µm2 (Kuva. 1D, n = 101). Näitä c2c12-myoblasteista saatuja löydöksiä vahvistettiin tekemällä ylimääräisiä morfologisia mittauksia (CSI, solujen kehä ja solualue) primaarisilla ihmisen myoblasteilla (16ubic, Supplementary Fig. 2A), jotka tulevat potilaan hauiksista, joihin FSHD ei vaikuta (ts. joilla on vahvistettu puuttuvan 4QA poisto). Kuten on esitetty täydentävässä Kuvassa. 2B-D, tuloksemme osoittavat, että 16UBISTEN myoblastien CSI vaihteli välillä 0, 14-0, 86 keskiarvolla 0, 44 ± 0, 17 (n = 90), mikä viittaa suureen vaihteluun ihmisen myoblastien solumorfologioissa, kuten on havaittu C2C12-soluissa. Yhdessä tuloksemme osoittavat, että solujen morfologioiden vaihtelu ei riipu solutyypistä tai mistään soluviljelmän artefaktista.

seuraavaksi tutkimme aktiinifilamenttien jakautumista c2c12-myoblastipopulaatiossa ymmärtääksemme, voivatko vaihtelevuutta levittävät alueet moduloida aktiinisytoskeletonia. Havaintomme osoittivat, että F-aktiiniverkon kokonaisfluoresenssivoimakkuus oli lineaarisesti verrannollinen solualueeseen (Kuva. 1E, n = 31, R2 = 0, 748), mikä viittaa siihen, että mitä suuremmaksi myoblasti leviää, sitä enemmän aktiinifilamentteja muodostuu. Kuten on esitetty täydentävässä Kuvassa. 3, Seuraavaksi luonnehdimme vinculiinin sisältämien kiinnikkeiden jakautumista sen määrittämiseksi, miten solun muodon vaihtelut vaikuttavat solun ja substraatin vuorovaikutuksiin c2c12-myoblasteissa. Havaitsimme, että solusubstraattien kiinnikkeiden kokonaispinta-ala solua kohti kasvoi solupinta-alan myötä (kuva. 1F, n = 31, R2 = 0, 783) ja F-aktiinin fluoresenssin intensiteetillä (Kuva. 1G). Tuloksemme osoittavat, että c2c12-myoblastit omaksuvat erilaisia solumuotoja ja leviämisalueita, mutta puolestaan sopeuttavat sekä aktiinifilamenttien että vinkuliiniliimojen määrän leviämiseensä. Saadaksemme lisää tietoa solun muodon roolista myoblastin erilaistumisessa, tarkastelemme seuraavaksi solun kuvasuhteen kehitystä proliferaation aikana (P0 6 tunnissa ja P2 48 tunnissa) ja erilaistumisen (D2 96 tunnissa) vaiheissa (Kuva. 1t). Kuten kuvassa. 1I, J, havaintomme osoittavat, että myoblastit kasvattivat kuvasuhdettaan 0,40 ± 0,16 (P0) – 0,36 ± 0,09 (P2) ja 0,24 ± 0,07 (D2), mikä viittaa siihen, että myoblastit venyvät merkittävästi ja ottavat kuvasuhteen 1:4 erottuakseen. Lisäksi tuloksemme osoittivat, että aktiinin stressikuidut olivat erittäin suuntautuneita D2: ssa (täydentävä Kuva. 4A, B), joka vastaa myös merkittäviä ydinenergian venymiä (täydentävä Kuva. 4c). Yhdessä löydöksemme osoittavat, että F-aktiiniverkkoa moduloivat myoblastimorfologian muutokset ja osoittavat, että myoblastien erilaistuminen vaati solujen venymistä kuvasuhteeseen 1:4 asti.

aktiiniverkon ja ytimen tilaorganisaatiota ohjaa myoblastimorfologia

me kontrolloimme myoblastimorfologioiden sisäistä vaihtelua käyttämällä liimamikropatterneja standardoimaan niiden leviämisalueita ja säätelemään niiden muotoja. Käyttämällä microcontact-tulostustekniikkaa 20, loimme fibronektiinin (FN) liimamaiset mikropatternit, joiden vakiopinta-ala on 1600 µm2 ja erilaisia geometrioita. Käytimme pyöristettyä (CSI = 1), neliömäistä (CSI = 0,79), kolmiomaista (CSI = 0,60) ja suorakulmaisen eri kuvasuhteita (CSI = 0,50 ja 0,34 1:4: lle ja 1: lle:7 kuvasuhteet, vastaavasti) FN mikropatterns viljelyn yksittäisten myoblasts (Kuva. 2 A). Nämä erilaiset mikropatternien geometriat mahdollistivat myoblast-muodon standardoinnin in vitro laajalla alueella ja niiden leviämisalueen hallinnan.

kuva 2

aktiiniverkon ja ytimen tilaorganisaatiota ohjaa myoblastimorfologia. (A) Epifluoresenssikuvat c2c12-soluista, jotka on kasvatettu 1600 µm2: n fibronektiini (Fn) – mikropattereilla ja jotka ovat immunologisia F-aktiinia (vihreä), tumakkeita (sininen) ja vinkuliinia (punainen) varten. Ympyränmuotoiset, neliömäiset, kolmiomaiset ja suorakulmaiset (1:4 ja 1:7 kuvasuhteet) mikropatternit vastaavat CSI: tä = 1, 0.79, 0.60, 0.50 ja 0.34. Asteikkotangot ovat 20 µm. B) tyypillisiä esimerkkejä aktiinifilamenttien tilajärjestelystä mikropatteroiduissa c2c12-soluissa, jotka on värikoodattu suuntaustensa mukaan. Asteikkotangot ovat 20 µm. C) aktiiniverkon suunta pyöristettynä (n = 12 mustana), neliönä (n = 11 punaisena), kolmion muotoisena (n = 19 sinisenä) ja 1:4 (n = 18 vihreänä) tai 1:7 (n = 11 vaaleanpunaisena) suorakulmaisina mikropatteroituina myoblasteina. D) ydinalan kuvasuhteen ja E) ydinalan orientaation kehitys myoblastien eri geometrioissa (10 ≤ n ≤ 15 kutakin CSI: tä kohti).

määrittääksemme kvantitatiivisesti solugeometrian roolin aktiinisytoskeletonin spatiaalisessa organisaatiossa määritimme aktiinisäikeiden orientaation kullekin solulle shape34, 35. Falloidiinilla värjätyt aktiinifilamentit värikoodattiin suuntautumisensa funktiona värigradientilla, joka vaihteli vaaleansinisestä, kun aktiinifilamentit olivat järjestäytyneet yhdensuuntaisiksi (0°) vaaka-akselille ja punaisiksi (+90°) tai oransseiksi (-90°) niille, jotka järjestäytyivät kohtisuoraan vaaka-akselille (Kuva. 2b). Havaitsimme, että aktiinifilamentit pyöristetyissä soluissa jakautuivat satunnaisesti, ja orientaatiot vaihtelivat -90°: sta +90°: een. Neliöidyissä soluissa näytteillä aktiinifilamentit, jotka on järjestetty kolmeen pääkulmakulmaan: 0° – 25°, 50° – 90° ja -50° -90°, kun taas kolmiokennoissa aktiinifilamentit järjestäytyivät pääasiassa kuvion kolmen sivun mukaan 0°, 60° ja -60°. Mielenkiintoista, huomasimme, että aktiinifilamentit olivat erittäin suuntautunut yhdensuuntaisia pitkän solun akselin (0°) suorakulmainen solujen 1:4 (CSI = 0.50) ja 1:7 (CSI = 0.34) kuvasuhteet. Vinkuliinia sisältävien adheesioiden kvantifiointi ei viitannut tilastollisiin adheesioalueiden eroihin solujen morfologioiden välillä (täydentävä Kuva. 5A-C), kun taas fokaalisten kiinnikkeiden orientaatio moduloitiin solun muodon (täydentävä Kuva. 5D, E), kuten aktiinifilamenttien osalta on todettu. Havaintomme osoittavat, että sekä 1:4 että 1: 7 suorakulmaiset myoblastit mahdollistavat aktiinin sytoskeletonin vahvemman organisaation (Kuva. 2C) ja fokaaliset kiinnikkeet, mikä viittaa siihen, että myoblastin venymä johtaa supistuvien dipolien muodostumiseen.

kun otetaan huomioon solun tuman rooli myoblastien erilaistumisessa myotubeissa, selvitimme seuraavaksi, voivatko solumuodon ja sytoskeletoniarkkitehtuurin muutokset moduloida nukleuksen muotoa ja suuntaamista36. Havaitsimme, että ydinvoiman kuvasuhde kasvoi merkittävästi CSI: n laskiessa (Kuva. 2D). Pyöreissä mikropatterneissa olevissa pyöristetyissä soluissa (Csi = 1) oli pyöristetty ydin, jolle oli ominaista keskimääräinen kuvasuhde 1,11 ± 0,06, kun taas suorakulmaisissa soluissa, joiden kuvasuhde oli 1:4 (CSI = 0,50) ja 1:7 (CSI = 0,34), esiintyi suuria ydinformaatioita, joiden kuvasuhteet olivat 1,39 ± 0,21 ja 2,19 ± 0,23. Huomasimme myös, että tuman orientaatiota moduloi solun morfologia (Kuva. 2 E). Havaitsimme, että ytimen suunta pyöristetyissä, neliömäisissä ja kolmiomaisissa soluissa ulottui laaja-alaisesti kulmiin (~15° – ~60°), joiden keskimääräinen suunta oli ~40° (pyöreä, n = 11), ~33° (neliö, n = 14) ja ~43° (kolmio, n = 10) suhteessa vaaka-akseliin. Suorakulmaisten solujen osalta tuloksemme osoittivat, että Tuma oli suuntautunut soluakselin suuntaisesti keskimääräisellä kulmalla ~14° (1:4, n = 15) ja ~2° (1:7, n = 10).

solujen venymä lisää myoblastin supistuvuutta

seuraava käsittelemämme kysymys oli, miten solumuodon muutokset vaikuttavat myoblastin supistuvuuteen. Vastataksemme tähän kysymykseen, käytimme traction force microscopy (TFM) määrittää vetojännityksiä aiheuttama mikropatteroitu myoblasts. Kuten kuvassa. 3a havaitsimme, että suurimmat jännitykset kohdistuivat mikropatteroituneiden myoblastien raajoihin solumuodosta riippumatta. Kuten aiemmin on havaittu muissa solutyypeissä37, supistumiskykyinen stressi kerääntyy mieluiten mikropatteroitujen myoblastien kulmiin (neliöt ja kolmiot) tai molempiin ääripäihin (1:4 ja 1:7 suorakulmiot). Määritimme yksittäisten mikropatteroitujen myoblastien aiheuttaman kokonaisstressin määrittääksemme, muuttaako solun morfologia solun supistuvuutta. Kuten kuvassa. 3B, pyöristetyt solut (CSI = 1) aiheuttivat kokonaisjännityksen 170,7 ± 46,4 N/m2, kun taas suorakulmaiset solut (CSI = 0,34, kuvasuhde 1:7) aiheuttivat suuremman kokonaisjännityksen (295,9 ± 156.8 N / m2), mikä viittaa siihen, että pitkänomaiset solumuodot johtavat lisääntyviin vetojännityksiin. Lisäksi havaitsimme, että suorakulmion muotoiset solut (CSI = 0,34, kuvasuhde 1:7) osoittivat suurempaa maksimaalista jännitysarvoa (684,3 ± 257,8 Pa, kuva. 3C), kun taas pyöristetyt myoblastit osoittivat alhaisimman maksimaalisen stressiarvon (351,5 ± 123,6 Pa). Ottaen huomioon, että supistumiskykyiset jännitykset kohdistuivat solun kehälle ja että CSI: n alentaminen johtaa lisääntyneisiin vetojännityksiin, piirrimme maksimaalisen jännitysarvon massan keskipisteestä solun ääreen ulottuvan etäisyyden funktiona (Kuva. 3D), joka vastaa 22, 6 µm (CSI = 1), 28, 28 µm (CSI = 0, 79), 33, 98 µm (CSI = 0, 60), 41, 23 µm (CSI = 0, 50) ja 53, 45 µm (CSI = 0, 34). Kuten kuvassa. 3D, havaitsimme, että suurin supistumiskyky lisääntyi lineaarisesti, kun etäisyys centroidista solun päähän (R2 = 0.958, n = 65), mikä viittaa siihen, että myoblastien pitkulaiset morfologiat käyttävät enemmän traktiovoimia.

aktomyosiiniverkoston osuuden määrittämiseksi supistumiskykyisten voimien muodostamisessa myoblasteissa c2c12-soluja hoidettiin g-aktiinia sitovalla Latrunkuliini B: llä (LatB) ja myosiini II: n estäjällä Blebistatiinilla (Bleb). Immunostetut myoblastit falloidiinilla osoittivat, että LatB-ja Bleb-käsitellyillä soluilla oli diffuusi aktiiniverkko (Kuva. 3E), mikä osoittaa, että molemmat lääkkeet vaikuttivat merkittävästi F-aktiinin järjestämiseen. Käytimme TFM: ää mikropatteroituihin myoblasteihin, joita hoidettiin molemmilla lääkkeillä, määrittääksemme aktomyosiiniverkoston roolin supistuvien voimien muodostamisessa eri geometrioiden myoblasteissa. Löydöksemme osoittavat, että LatB-hoito aiheutti merkittävää supistumiskyvyn heikkenemistä, joka lisääntyi soluvenymän myötä. Pyöristetyt solut osoittivat supistuvan jännityksen häviävän ~62%, kun taas LatB: llä käsitellyille suorakulmaisille soluille 1: 4 ja 1: 7 oli ominaista supistuvan jännityksen häviäminen ~88% ja ~86% (Kuva. 3 F). Lisäksi havaitsimme, että supistumiskykyinen stressi 1:4 suorakulmainen solut käsitelty Bleb oli ominaista menetys ~80% supistumiskykyinen voima, osoittaa, että myosin II molekyylimoottorit ovat avainpelaajia myoblast supistumiskyky voimia.

yhdessä nämä tulokset osoittavat, että aktomyosiiniverkoston supistuvuus lisääntyy pitkulaisilla myoblasteilla luomalla tiheä rinnakkaisten aktomyosiinikuitujen verkosto.

soluparien supistumiskyky lisääntyi niiden fuusion ja pitkänomaisten mikropatternien kohoamisen jälkeen

ymmärtääksemme, miten myoblastimorfologia voi vaikuttaa myotubien supistumiskykyisiin ominaisuuksiin, pidämme kahden myoblastin minimimallia. Määritimme ensin eri muotoisille mikropattereille pinnoitettujen solujen kaksoisolentojen vetovoimat P1: ssä (24 h proliferaatioalustassa) (täydentävä Kuva. 6 A). CSI: n laajan kirjon välillä ei ollut tilastollisia eroja supistumiskykyisessä stressissä (täydentävä Kuva. 6B) huolimatta actin-verkoston hyvin määritellystä suuntauksesta (täydentävä Kuva. 6C)ja ytimet (Supplementary Fig. 6D, E) on 1:4 ja 1:7 suorakulmainen mikropatterns. Tämän havainnon perusteella kvantifioimme supistumiskykyisen stressin, jonka aiheuttavat ympyränmuotoiset (CSI = 1) ja suorakulmaiset (CSI = 0,50, 1:7 kuvasuhde) Fn-mikropatternit viiden lisäpäivän aikana (D5, Kuva. 1H) erilaistumisväliaineena. Käytimme MitoTracker Red CMXRos (ThermoFisher Scientific), elävä mitokondrioiden värjäys, jotta myoblast doublets fuusioitiin (Kuva. 4A) 38. Kuten kuvassa. 4B, C, havaitsimme, että yhteenlaskettu supistumiskykystressi kasvoi hieman pyöreillä mikropattereilla kasvatetuissa fuusioiduissa solukaksikoissa (267 ± 64 Pa) verrattuna pyöreisiin fuusioimattomiin solukaksikkoihin (157 ± 37 Pa), kun taas fuusioidut pitkänomaiset doubletit olivat yli kaksi kertaa supistuvampia (543 ± 193 Pa) kuin fuusioimattomat pitkänomaiset doubletit (211 ± 73 Pa). Nämä tulokset osoittavat, että solujen supistuvuus lisääntyi solujen fuusion jälkeen ja lisääntyi merkittävästi pitkänomaisissa morfologioissa.

Kuva 4

soluparien supistuvuus kasvoi niiden fuusion ja kohoamisen jälkeen pitkulaisissa mikropatterneissa. (A) Epifluoresenssikuvat C2c12-solupareista fuusioimattomina (D) ja fuusioituneina (FD) pyöreillä ja suorakulmaisilla (1:7 kuvasuhde) Fn-mikropatterneilla ja värjättyinä mitokondrioita varten Mito Trackerilla. Asteikkotangot ovat 20 µm. B) edustavat kartat pyöreisiin ja suorakulmaisiin FN-mikropatterneihin fuusioituneiden c2c12-soluparien aiheuttamasta supistumiskykyisestä jännityksestä. C) fuusioimattomien (d), (yksiväristen tankojen) ja sulatettujen (FD, tiivistettyjen tankojen) c2c12-soluparien kokonaisjännityksen kehittyminen pyöreissä (harmaissa) ja suorakulmaisissa (violeteissa) Fn-mikropatterneissa. Ympyrä D: n = 8; ympyrä FD: n = 5; suorakulmio D: n = 6 ja suorakulmio FD: n = 8. ** p < 0, 01.

Aktomyosiinin kontraktiilisuus edistää myotuubin erilaistumista

kysyimme sitten, voisiko myoblastien aktomyosiinin kontraktiilisuus vaikuttaa myotuubin erilaistumiseen. C2c12 myoblasteja viljeltiin Fn-pinnoitetuilla substraateilla proliferaatioaineissa 2 päivän ajan (P2, Fig. 1H) päästä solujen yhtymäkohtaan. Tämän jälkeen lisättiin joko LatB tai Bleb 30 minuutiksi ja proliferaatioaine korvattiin erilaistumisviljelyalustalla. 4 päivän kuluttua erilaistuminen keskipitkällä (D4, Kuva. 1H), C2C12-solut kiinnitettiin ja värjättiin DNA: lle ja Troponintille, joka on erilaistumisen merkkiaine (Kuva. 5). Arvioimme latb-ja Bleb-hoitojen vaikutusta värjäämällä alfa-aktiniinia kontrollimyotuubeihin (CTRL) ja Latrunkuliini B: llä (+LatB) ja blebistatiinilla (+Bleb) hoidettuihin myotuubeihin. Kuten todetaan täydentävässä Kuvassa. 7, control myotubes läsnä tyypillinen juovikas Z-bändi malleja, kun taas LatB ja Bleb hoitoja häiritä juovikas malleja myotubes. Ohjaus MYOTUBES (CTRL)oli ominaista keskimääräinen kuvasuhde 7.99 ± 3.38 (Kuva. 5a) ja positiivinen troponiini T-alue 51, 7 ± 5, 6% (Kuva. 5b). Havaintomme osoittavat, että LatB-ja Bleb-hoidot vähensivät troponiini T-alueen osuutta 44,9 ± 5,2%: iin ja 44,4 ± 5,1%: iin. Lisäksi havaitsimme, että fuusioindeksi oli tilastollisesti alhaisempi LatB-(27 ± 3%) ja Blebb-käsitellyillä (29 ± 3%) soluilla kuin kontrollisoluilla (38 ± 5%), mikä vahvistaa aktomyosiinin supistumiskykyä myoblastien erilaistumisessa (Kuva. 5c). Yhdessä nämä tulokset osoittivat, että myoblastien aktomyosiinin supistuvuus edistää myotuben erilaistumista.

kuva 5

Aktomyosiinin kontraktiilisuus edistää myotuubin erilaistumista. (A) myotube-kuvasuhteen jakautuminen 4 päivän jälkeen eriytymisväliaineissa (n = 114, R2 = 0, 915). B) troponiini T: n positiivisen pinta-alan prosenttiosuuden ja C) fuusioindeksin kehitys kontrollisoluissa (CTRL), LatB-ja Bleb-käsitellyissä soluissa (n = 20 kullekin). (D) tyypillisiä epifluoresenssikuvia ohjaus Myotubes (Ctrl), LatB ja Bleb-käsitelty myotubes muodostettu 4 päivän jälkeen eriyttäminen media. Myotubes oli immunosäädetty DNA (sininen) ja troponiini T (punainen). Asteikkotangot ovat 100 µm. * p < 0, 05, **p < 0, 01 ja ei merkitsevää.

Myoblastien venymä laukaisee YAP: n ydinviennin, mikä on välttämätöntä myoblastien erilaistumiselle myotubeiksi

saadaksemme lisää tietoa myotuben erilaistumista säätelevistä solunsisäisistä mekanismeista, pohdimme YAP: n roolia määrittämällä sen sijainnin joko sytoplasmassa tai myoblastien ytimessä, johon se sitoutuu ja aktivoi tead transkriptio factors39. Tätä varten kvantifioimme sytoplasman ja ydinsyklin välisen suhteen mikropatteroituneissa myoblasteissa (Kuva. 6A ja täydentävä Kuva. 8). Solun venymä 1:4 ja 1:7 suorakulmaiset mikropatternit lisäsivät sytosolien ja ydinpolttoaineiden YAP-suhdetta (Kuva. 6B), mikä viittaa siihen, että solun venymä laukaisee YAP-ydinviennin aktomyosiiniverkon aiheuttaman ydinpuristusvoiman kautta40. Tarkistaaksemme, liittyykö YAP: n lokalisointi joko sytoplasmaan tai tumaan erilaistumisprosessin tiettyihin vaiheisiin, värjäsimme YAP: n c2c12-soluissa proliferaatiovaiheen 24 tunnin (P1) ja 48 tunnin (P2) jälkeen ja erilaistumisvaiheen 96 tunnin (D2) ja 264 tunnin (D9) kohdalla (Kuva. 6C ja täydentävä Kuva. 9). Mielenkiintoista on, että tuloksemme osoittivat, että sytoplasma/ydin YAP-suhde kasvoi 0,37 ± 0,07: stä P1: ssä 0,68 ± 0,06: een P2: ssa ja 0,67 ± 0,06: een D2: ssa ja laski sitten 0,42 ± 0,10: een D9: ssä (kuva. 6D). Mielenkiintoista on, että sytoplasminen / ydinvoima YAP-suhde D9: ssä ei eroa tilastollisesti P1-arvoista, mikä viittaa siihen, että sytoplasminen/ydinvoima YAP-suhde erilaistuneissa myotubeissa on samanlainen kuin myoblasteilla. Näiden tulosten todentamiseksi keräsimme myoblasteja proliferaatiovaiheessa P1 (24 h) ja erilaistumisvaiheessa D2 (96 h) ja eristimme niiden sytoplasmat ja ydinmateriaalit. Suoritimme bicinchoniinihappo (BCA) – proteiinimäärityksen ja sytoplasma-ja ydinuuttojen sisältämät proteiinit analysoitiin elektroforeesilla (Kuva. 6 E). Western blot-löydöksemme osoittivat, että sytoplasma/ydin YAP-suhde kasvoi 0,62 ± 0,08: sta P1: ssä 0,87 ± 0,24: ään D2: ssa (Kuva. 6 f). Tämä Yap: n biokemiallinen kvantifiointi osoitti merkittävää YAP: n ydinvientiä c2c12-solujen erilaistumisessa ja vahvistaa havaintojamme.

kuva 6

Myoblastivienti laukaisee YAP: n ydinviennin, mikä on välttämätöntä myoblastien erilaistumiselle myotubeiksi. (A) Epifluoresenssikuvat C2c12-soluista, jotka on kasvatettu 1600 µm2: N FN-mikropatterneilla ja jotka ovat immunologisia YAP: tä varten. Asteikkotangot ovat 20 µm. (B) sytoplasman ja ydinpoikkeaman suhde eri myoblastimorfologioissa (N = 10 kullekin). (C) epifluoresenssikuvat c2c12-solujen konfluenteista, jotka on immunisoitu YAP: tä varten proliferaatiovaiheen 1.päivänä (P1, 24 h) ja erilaistumisvaiheen 2. päivänä (D2, 96 h) ja 9. päivänä (D9, 264 h). Asteikkotangot ovat 100 µm. (D) sytoplasman ja ydinvoiman välinen YAP-suhde P1: ssä (n = 50), P2: ssa (n = 30), D2: ssa (n = 30) ja D9: ssä (n = 30). E) Western blot analysis of YAP (65 kDa) expression in C2C12 proliferation and differentation. (F) sytoplasmasta ydinreaktioon (keskiarvo ± S. D.) proliferaation ja erilaistumisen aikana (3 rinnakkaisnäytettä kutakin tilaa kohti 20.106 solulla/toistolla). G) sytoplasman ja ydinvoiman YAP-suhde D2: ssa ja H) fuusio-indeksi kontrollissa (CTRL) ja leptomysiinillä (LMB) käsitellyissä soluissa D4: ssä. ** p < 0, 01, ***p < 0, 0001 ja n.S ei merkittävä.

näiden tulosten perusteella arvioimme Yap: n roolia estämällä leptomysiini B: n avulla aktiivisen viennin tumasta sitoutumalla suoraan vientiin141. Alberto Elosegui-Artola ja työtoverit ovat osoittaneet viime aikoina, että leptomysiini B: tä (LMB) voidaan käyttää tehokkaasti tutkittaessa, miten sytoskeletonin aiheuttamat supistumiskykyiset voimat ajavat YAP nuclear translocationia39. Kun käsittelimme c2c12-myoblasteja P2: ssa (48 h) LMB: llä, havaitsimme, että sytoplasman ja ydinvoiman välinen YAP-suhde oli merkittävästi pienempi LMB-käsitellyissä soluissa D2: ssa (96 h, Fig. 6G), mikä viittaa siihen, että YAP on keskittynyt pääasiassa ytimeen, kun ydinvoiman vienti estyy. Lisäksi havaintomme osoittivat, että LMB-käsiteltyjen solujen fuusioindeksi D4: ssä (kuva. 6H) oli hyvin alhainen(3,8 ± 1.5%) verrattuna kontrollisoluihin (42,4 ± 9,1%), mikä osoittaa, että c2c12: n erottelu edellyttää aktiivista ydinaineiden vientiä.

Vastaa

Sähköpostiosoitettasi ei julkaista.