aiheuttama Escherichia colin resistenssimekanismi ampisilliinin laboratoriossa

Johdanto

patogeenisen Escherichia colin resistenssimekanismi aiheuttaa usein ripulia, sepsistä ja muita kliinisiä oireita, ja se on edelleen yksi tärkeimmistä ihmisten ja eläinten terveyteen vaikuttavista suolistopatogeeneistä. Ampisilliini (AMP), puolisynteettinen β-laktaamiantibiootit, käytetään laajalti hoitoon ihmisen ja karjan E. coli-infektio, mutta viime aikoina sen resistenssi on lisääntynyt.1-3 AMP toimii bakteerien aktiivisessa replikointivaiheessa estäen bakteerien soluseinän synteesiä. Bakteerit usein vastustavat tällaista antibioottia seuraavilla tavoilla: koodaa β-laktamaasia, muuttaa kohdeproteiinia soluseinässä, vähentää ulomman kalvon läpäisevyyttä ja lisää lääkkeen efflux-pumpun ilmentymistä. Eläimet käyttävät antibakteerisia lääkkeitä, jotka leviävät ympäristöön eritteiden välityksellä, mikä paitsi saastuttaa ympäristöä myös aiheuttaa suurta haittaa ihmisten terveydelle ja jalostusteollisuuden kestävälle kehitykselle.4,5

koko genomin sekvensoinnin (WGS) on osoitettu ohjaavan bakteeriresistenssin ehkäisyä ja hallintaa.6 yhden nukleotidin polymorfismi (SNP) viittaa pääasiassa DNA-sekvenssin polymorfismiin, joka johtuu yksittäisen nukleotidin vaihtelusta genomitasolla, ja resequencing-analyysi eri SNP: iden seulomiseksi voi suoremmin tutkia lääkeaineresistenssiä. Simuloimme mikrobien kliinisten antibioottien prosessia AMP – laboratorioinduktiomenetelmällä ja tutkimme lääkeresistenssin asteen ja mutaatiopaikan välistä suhdetta. Seulotaan ei-synonyymi yhden nukleotidin polymorfismi (non-SNP) lääkkeille resistenttien ja herkkien kantojen välillä, jotta voidaan ymmärtää ei-SNP: n rooli lääkkeille resistenteissä kannoissa. Tämän tutkimuksen tarkoituksena on ymmärtää E. colin lääkeresistenssin lakia ja mekanismia, tarjota uusia tavoitteita uusien antibioottien kehittämiselle, tehdä antibioottien järkevä käyttö ja ratkaista E. colin moniesiintyminen ja monilääkeresistenssin hoito kliinisessä käytännössä.

materiaalit ja menetelmät

bakteeri-isolaatit ja reagenssi

tässä tutkimuksessa käytetty E. coli-kanta (E. coli 15743) eristettiin potilaan ulostenäytteestä sairaalassa Suixianissa Henanin maakunnassa Kiinassa vuonna 2015. Tämän kannan karakterisointi Kirby Bauerin (K-B) paperidiffuusiomenetelmällä osoitti, että kanta oli herkkä kahdeksalle 20 antibiootin luokalle. E. coli ATCC 25922 käytettiin verrokkina tutkimuksessamme.

m-H liemiväliaine ja M-H solid medium (Oxoid company, Iso-Britannia), Pharmaceutical sensitive paper (Hangzhou Binhe microbial company, Hangzhou, Kiina), AMP standard products (Chinese drug identification Institute, Peking, Kiina), DNA extraction kit (Shanghai Laifeng Biotech company, Shanghai, Kiina). Illumina Hiseq tehtiin Shanghai Lingen Biotechnology Co., Ltd.

kokeessa käytetty kolibakteeri eristettiin nimenomaan tätä tutkimusta varten. Zhengzhoun yliopiston biotieteiden eettinen komitea hyväksyi tutkimuksen, ja potilas allekirjoitti myös kirjallisen tietoon perustuvan suostumuksen.

Induktioprosessi

pienin estopitoisuus (MIC) määritettiin mikrobrottilaimennusmenetelmällä.7-9 kanta E. coli (eristetty kliinisestä ja on MIC-arvo), joka on herkkä AMP viljeltiin MH kiinteässä väliaineessa, 37°C viljelmä jälkeen 18-24 tuntia, valitse yksi pesäke 8 mL MH nestemäisessä väliaineessa bakteerien vahvistamista. Edellä mainittu bakteeriliuos viljeltiin M-H nestemäisessä väliaineessa, joka sisältää 1/2mic AMP, vastaavasti, ja AMP: n pitoisuus kasvoi jatkuvasti alakulttuuriprosessin aikana. Kun antibioottien pitoisuus oli 16 µg / mL, 8 µg/mL nostettiin joka kerta, Ja jokainen pitoisuus kasvatettiin kahdesti. Kun lääkkeen MIC-muutoksen arvo oli suurempi tai yhtä suuri kuin neljä kertaa MIC ennen induktiota ja sen jälkeen, katsottiin, että MIC-muutoksella induktion jälkeen oli merkittävä merkitys.10 kontrollina käytettiin M-H-liemen viljelyainetta ilman antibiootteja koko prosessin ajan.

Multilocus sequence typing (MLST) of E. coli-bakteerikannat luokiteltiin seitsemällä huonekasvigeeniparilla, jotka sisälsivät adk: n, fumC: n, gyrB: n, icd: n, mdh: n, purA: n ja recA: n.

herkkyyskoe

Kirby Bauerin paperidiffuusiomenetelmällä seulottiin kolibakteeri, joka oli herkkä kahdeksalle eri antibiootille, mukaan lukien aminoglykosidit, penisilliinit, kefalosporiinit, tetrasykliini, β-laktamaasin estäjät, karbamaatit, sulfonamidit ja kinolonit. Indusoidut kannat toistettiin huumeherkkyystestillä. Tietojen tulkinta tehtiin Clinical and Laboratory Standards Institute 2016-ohjeiden mukaisesti.11

ensin aiheutimme E. coli-resistenssin AMP: lle viljelemällä E. coli-bakteeria ja lisäämällä asteittain AMP: n pitoisuutta.(2, 4, 8, 16, 32, 64, 128, ja 256 µg / mL). Kun saimme resistenssikannan, vertasimme 20 antibiootin resistenssispektriä indusoidun kannan (E. coli 15743-256, indusoitu 256 µg/mL) ja alkuperäisen kannan (E. coli 15743) välillä tekemällä huumeherkkyystestejä. Bakteerisuspensio levitettiin agar-levylle, jossa oli pieni pyöreä, eri antibiootteja sisältävä paperi, ja sitä viljeltiin 37°C: n lämpötilassa 16-20 tunnin ajan. Mikrobilääkekehänhalkaisija mitattiin.

WGS ja resequencing analysis

mic-arvoilla 32 ja 256 olevat kannat nimettiin E. coli 15743-32: ksi ja E. coli 15743-256: ksi. Primaariherkille kannoille tehtiin koko genomianalyysi ja indusoiduille resistenteille kannoille tehtiin resekvenssi. Uudelleenmittauksen tuloksia verrattiin alkuperäisen kartan tuloksiin. Proteiinien toimintaan mahdollisesti vaikuttavien muiden kuin SNP: iden seulonta.

sekvensoinnin suoritti Shanghai ling ’ En Biotechnology Co. Ltd. Shanghai, Kiina). Illumina Hiseq yhdistettynä kolmannen sukupolven sekvensointiteknologiaan käytettiin tässä projektissa kantojen genomiseen sekvensointiin.

RT-PCR

Poista käänteiskopioitunut DNA 4°C: n pakastimesta ja valmista reagenssista haluttu pitoisuus ohjeiden mukaan. Kytketään ABI Fast7500-laite päälle, asetetaan 95°C 30 sekunnin ajan, reagoidaan 40 syklin ajan, 95°C 3 sekunnin ajan, 60°C 30 sekunnin ajan ja liuotetaan käyrä 95°C: ssa 15 sekunnin ajan, 60°C: ssa 60 sekunnin ajan ja 95°C: ssa 15 sekunnin ajan. Lisätään näyte 8-riviseen EP-putkeen, kolme toistokaivoa näytettä kohti ja poistetaan kuplat sentrifugoimalla. Kunkin näytteen keskimääräinen CT-arvo kirjattiin reaktion päätyttyä. Kiinnostavan geenin suhteellinen ilmentymistaso laskettiin 2−ΔΔCT: n avulla. (ΔCT = kohdegeenin CT – sisäisen referenssigeenin CT-arvo. ΔΔCT = kokeellinen näyte ΔCT – kontrolliryhmä ΔCT.)

bioinformatiikka-analyysi

SVEITSILÄISMALLIN ohjelmistoa käytettiin analysoimaan ennen ja jälkeen geenimutaation koodatun proteiinin aminohappojärjestystä ja ennustamaan proteiinin tertiäärirakennetta.12,13

tilastollista analyysiä

SPSS17.0 käytettiin yksinkertaiseen lineaariseen regressioanalyysiin ja regressioyhtälöä testattiin. Testin koko oli 0, 05 (α=0, 05).

tulokset

lääkeherkkyystestitulokset

aineistomme osoitti, että E. coli 15743 oli herkkä 20 eri antibiootille. Induktion jälkeen E. coli 15743-256 oli resistentti AMP: lle, piperasilliinille, kefuroksiimille, kefatsoliinille, kefoksitiinille, amp/sulbaktaamille, amoksisilliinille/klavulaanihapolle, piperasilliinille/tatsobaktaamille ja atstreonaamille, mutta silti herkkä jäljellä oleville 11 antibiootille (Taulukko 1, Huomaa, että välittäjät määriteltiin myös lääkeresistenssiksi). Tuloksemme osoittivat, että alkuperäinen herkkä kolibakteeri ei ollut ainoastaan indusoitu resistentti AMP: lle, vaan myös vastustuskykyinen useille muille antibiooteille ja siitä tuli induktion aikana monilääkeresistentti.

Taulukko 1 Escherichia colin Bakteerirenkaan halkaisija

lääkeresistenssin esiintyminen induktion aikana

lääkeresistenssin kinetiikan tutkimiseksi viljeltiin E. coli-bakteereita, joiden amp-pitoisuus kasvoi eri ajanjaksoina, ja mitattiin mic kullakin pitoisuudella taulukon 2 mukaisesti. Regressioanalyysi tehtiin MIC-arvolla ja induktioajalla käyttäen SPSS 17.0: aa. Regressioyhtälö oli y=1,0435 lnx-0,7316. Yhtälön osuva vaikutus arvioitiin, R2=0, 9605, P<0, 05. MIC-arvo 32 µg/mL on kriittinen arvo, ja MIC-arvo kasvoi nopeammin ennen 32 µg/mL: n saavuttamista kuin sen jälkeen (Taulukko 2).

Taulukko 2 E: n MIC-arvo. coli 15743 ajan ja indusoidun pitoisuuden

sillä välin regressioanalyysiin valittiin se osa, jonka MIC-arvo oli enintään 32 µg / mL, ja regressioyhtälö oli y=0, 0358 x+1, 2812. Yhtälön osuva vaikutus arvioitiin, R2=0,991, P<0,05. E. coli 15743: n MIC-arvo suureni induktiokonsentraation ja induktioajan kasvaessa (Kuva 1).

kuva 1 MIC-arvon muutos ajan myötä.Lyhenne: MIC, minimum inhibitiveconcentration.

mlst-tulokset

osoittaaksemme, että indusoitu kanta (E. coli 15743-256) oli todellakin peräisin alkuperäisestä kannasta (E. coli 15743), suoritimme mlst: n yli kahdesta kannasta. Genominen DNA uutettiin bakteerien DNA extraction kit, PCR monistettu, ja sekvensoitu Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. NCBI: n tietokannan räjähdys osoitti, että nämä kaksi kantaa ovat identtisiä, mlst-tyyppi, adk-13, fumC-363, gyrB-302, icd-97, mdh-17, purA-94 ja recA-93. Tietojemme mukaan induktioprosessi ei ollut saastunut, ja resistentti kanta E. coli 15743-256 oli peräisin herkästä kannasta E. coli 15743.

koko genomianalyysi

E. coli 15743 sisälsi 4408 geeniä, 22 rRNA: ta ja 85 tRNA: ta. Geenitiheys oli 0,945 kb, GC-pitoisuus 51.7%, geeniprosentti oli 88,3%, intergeenisen alueen pituus oli 545,151, intergeenisen alueen GC-pitoisuus oli 42,6% ja intergeenisen alueen osuus oli 11,7% genomista. E. coli 15743-genomien ominaisuudet on koottu kuvioon 2. E. coli 15743 ei sisältänyt plasmideja.

kuva 2 E. colin genomikartta 15743.Huom: ympyräkartan uloin ympyrä on genomin kokoinen logo, jokainen asteikko on 0,1 Mp. Toinen ja kolmas kehä ovat CD-levyjä positiivisissa ja negatiivisissa ketjuissa, ja eri värit kertovat CD-levyjen eri RATASLUOKITUKSISTA. Neljäs ympyrä on rRNA tai tRNA. Viides ympyrä on GC-pitoisuus, ja ulospäin punainen osa osoittaa, että GC-pitoisuus alueella on suurempi kuin koko genomin keskimääräinen GC-pitoisuus. Mitä korkeampi huippuarvo osoittaa, sitä suurempi ero on keskimääräisestä GC-pitoisuudesta, ja sisäänpäin suuntautuva sininen osa osoittaa, että alueen GC-pitoisuus on alhainen. Koko genomin keskimääräisessä GC-pitoisuudessa korkeampi huippu osoittaa suurempaa eroa keskimääräisestä GC-pitoisuudesta. Sisin ympyrä on GC skew-arvo. Spesifinen algoritmi on G-C tai G+C. kun arvo on biologisessa mielessä positiivinen, positiivisella ketjulla on taipumus litteroida CD-levyjä. Kun se on negatiivinen, negatiivinen ketju pyrkii litteroimaan CD-levyjä.Lyhenne: COG, proteiinien Ortologisten ryhmien klusterit.

kannan genomikartta sisältää geenien jakautumisen oikeus-ja antisensiteettiketjuihin, Ortologisten proteiiniryhmien (COG) klusterien funktionaalisen luokittelun, GC-sisällön, genomisaaren ja homologisten geenien muodostaman kokonaisuuden, joka voi täysin näyttää genomin ominaisuudet.

COG

COG: n funktionaalinen luokitus E. coli 15743 osoitti, että useimmat geenit liittyivät aminohappojen kuljetukseen ja aineenvaihduntaan, hiilihydraattien kuljetukseen ja aineenvaihduntaan, energiantuotantoon ja-muuntumiseen, vain yleisen toiminnan ennustamiseen, epäorgaanisten ionien kuljetukseen ja aineenvaihduntaan sekä solujen kirjekuoren biogeneesiin (kuva 3).

kuva 3 COG: n funktionaalinen luokitus E. coli 15743.Lyhenne: COG, Ortologisten proteiiniryhmien klusterit.

ei-SNPs

selvittääksemme, onko E. colin genomissa tapahtunut muutos alkuperäisen kannan induktion jälkeen, suoritimme indusoitujen resistenttien kantojen (E. coli 15743-32 ja E. coli) genominlaajuisen sekvensoinnin.15743-256) ja analysoivat mutaatioiden määrää ja mutaation tapahtumapaikkaa.

verrattuna alkuperäiseen E. coli-kantaan (E. coli 15743), kahdessa indusoidussa lääkkeille resistentissä kannassa oli yhdeksän Ei-SNP: tä, mukaan lukien kolme yhteistä ei-SNP: tä, jotka olivat geeneissä orf00819, orf01200 ja orf02235. Muita ei-SNP: tä oli geeneissä orf01916, orf00490, orf03479, orf04094. Orf03479-geenissä tapahtui kolme ei-SNPs-mutaatiota, ja vain yksi SNP-mutaatio esiintyi jokaisessa jäljellä olevassa geenissä. Kolme Ei-SNP: tä oli geeneissä, jotka koodaavat solukalvon proteiineja. Kolme niistä oli geeneissä, joiden toimintoja ei tunneta. Yksi liittyi epäorgaanisen ionin kuljetukseen ja aineenvaihduntaan, yksi transkriptioon ja yksi signaalinsiirtomekanismeihin (Taulukko 3).

Taulukko 3 E. coli 15743-32 ja E. coli 15743-256

aineistomme osoitti, että E. coli 15743-32: ssa oli neljä ei-SNP: tä, jotka olivat neljässä geenissä. E. coli 15743-256: ssa oli kahdeksan Ei-SNP: tä, jotka jakautuivat kuuteen geeniin. COG: n funktionaaliluokitus osoitti, että useimmat geenit liittyivät aminohappojen kuljetukseen ja aineenvaihduntaan, hiilihydraattien kuljetukseen ja aineenvaihduntaan, energiantuotantoon ja-muuntumiseen, vain yleiseen funktioiden ennustamiseen, epäorgaanisten ionien kuljetukseen ja aineenvaihduntaan sekä solujen kirjekuoren biogeneesiin.

RT-PCR

koko genomin uudelleen sekvensoiva E. coli 15743-32 ja E. coli 15743-256, fluoresoiva reaaliaikainen kvantitatiivinen PCR-detektio konsensusgeeneistä. Seulottiin geenit, joissa ei esiinny SNP: tä, ja E. coli 15743-32 ja E. coli 15743-256: lla oli kolme identtistä geeniä (orf00819, orf01200, orf02235), ja näiden geenien ilmentymistasot kussakin sukupolvikannassa on esitetty kuvassa 4A–C.

kuva 4 mRNA-ilmaisun tulokset eri sukupolvissa kantoja.

RT-PCR osoitti, että orf01200, orf00819, orf02235-geenit ilmentyivät voimakkaasti resistenteissä kannoissa (E. coli 15743-32, E. coli 15743-64, E. coli 15743-128, E. coli 15743-256).

proteiinirakenteen ennustaminen

tertiäärirakenne muuttuu vain geenien orf01200 ja orf04094 koodaamissa proteiineissa, ja ennustetut tulokset on esitetty kuvioissa 5 ja 6.

kuva 5 koodatun proteiinin tertiäärirakenne orf01200 geeni.Huomautuksia: A) ennen mutaatiota; B) mutaation jälkeen.

kuva 6 orf04094-geenin koodaaman proteiinin tertiäärirakenne.Huom. A) ennen mutaatiota; B) mutaation jälkeen.

ennen orf01200, 2hrt: n mutaatiota.1.A valittiin vertailumalliproteiiniksi (Kuva 5A). Jäljelle jääneen infrastruktuurin mallivalikoima oli 2-1033, sekvenssin samankaltaisuus oli 0.59, ja mallin kattavuus oli 1.00. Orf01200: n mutaation jälkeen 1iwg.1.A valittiin viitemalliproteiiniksi (Kuva 5B). Jäljelle jääneen infrastruktuurin mallivalikoima oli 7-1036, sekvenssin samankaltaisuus oli 0,59 ja mallin kattavuus oli 1,00.

ennen orf04094, 4cti: n mutaatiota.1.B valittiin viitemalliproteiiniksi (Kuva 6A). Jäännösinfrastruktuurin mallivalikoima oli 184-436, sekvenssin samankaltaisuus oli 0,56 ja mallin kattavuus oli 0,59. Orf04094: n mutaation jälkeen 3ib7.1.A valittiin vertailumalliproteiiniksi (Kuva 6B). Jäännösinfrastruktuurin mallivalikoima oli 10-262, sekvenssin samankaltaisuus oli 0,33 ja mallin kattavuus oli 0,91.

Keskustelu

MIC: n ja induktioajan regressioanalyysi osoitti, että kannan MIC-arvo suureni eksogeenisen antibioottipaineen ja induktioajan kasvaessa. Liu ym. osoittivat, että kun imipeneemi indusoi E. coli-resistenssin, MIC-arvo suureni ajan myötä.14 silloinkin, kun indusoitu pitoisuus saavutti 128 kertaa ensisijaisen kannan MIC-arvon, induktiota jatkettiin, ja MIC-arvo jatkoi kasvamistaan induktion myötä. Tämän tutkimuksen tulosten mukaisesti E. coli-bakteerin MIC-arvo suureni ajan ja indusoidun pitoisuuden myötä. Se osoittaa, että jos annosta ei ole rajoitettu, kannan resistenssi muuttuu yhä vakavammaksi.

AMP indusoitiin E. coli 15743-bakteeriin 63 tunnin ajan (MIC-arvo oli 32 µg / mL), ja MIC-arvo oli kahdeksankertainen herkkään kantaan verrattuna. Tätä ennen MIC-arvo kasvoi nopeasti, kun taas indusoitaessa MIC-arvoon 32 µg / mL induktio jatkui ja MIC-arvon kasvunopeus pieneni. Bakteeriresistenssin harkitseminen voi tapahtua hieman ennen lääkeresistenssin kynnysarvon (MIC-arvo 32 µg / mL) saavuttamista. Kriittisen arvon saavuttamisen jälkeen bakteeri voi olla laiska ja kasvaa hitaasti, mutta MIC-arvo kasvaa edelleen. Tämän kannan uskotaan myös aktivoivan tiettyjä resistenssimekanismeja ja muuttavan bakteerien lääkeresistenssitilaa.

Zhang ym.osoittivat, että kloramfenikoli indusoi herkän Shigellan lääkkeille vastustuskykyiseen tilaan, ja sen lääkeresistenssispektri muuttuisi.10 Tämän seurauksena Shigella oli paitsi vastustuskykyinen kloramfenikolille, myös vastustuskykyinen muuntyyppisille antibiooteille. Tämän tutkimuksen tulosten mukaisesti E. coli-bakteerin lääkeresistenssispektri monistui induktion jälkeen. Tulokset osoittivat, että E. coli 15743-256 oli resistentti AMP: lle, mutta myös piperasilliini, kefuroksiimi, kefatsoliini, kefoksitiini, amp/sulbaktaami, amoksisilliini/klavulaanihappo, piperasilliini/tatsobaktaami ja atstreonaami olivat resistenttejä. Katsotaan, että AMP: n aiheuttaman E. coli-bakteerin induktion aikana AcrAB-TolC: n ekspressiojärjestelmä aktivoituu tai useampi kuin yksi useista efflux-pumppujärjestelmistä aktivoituu ja on olemassa muita resistenssimekanismeja kuin efflux-mekanismi.

bakteeriresistenssin molekyylimekanismi on vielä epäselvä. Tutkiakseen E: n spesifistä molekyylimekanismia. coli resistenssi AMP, bakteeri WGS analyysi tehtiin. Sekvensoinnin tuloksia verrattiin vertailujaksoon, ja 20 SNP seulottiin E. coli 15743-32-sekvenssistä, joista 4 oli ei-synonyymejä SNP: Itä. E. coli 15743-256-kannasta seulottiin 26 SNP: tä, joista kahdeksan oli ei-synonyymejä SNP: Itä. Xiang et al osoitti, että mutanttikantojen resistenssitaso oli korkeampi kuin ei-mutanttikantojen, ja pistemutaatioiden ja bakteerien resistenssitasojen välillä oli kvantitatiivinen reaktio, ja useat geenimutaatiot voivat parantaa bakteerien vastustuskykyä antibiooteille.15 yhdenmukaisesti tämän tutkimuksen tulosten kanssa Mutanttigeenien määrä E. coli 15743-32: ssa oli pienempi kuin E. coli 15743-256: ssa, mikä osoittaa, että mutaatioiden määrä voi olla yhteydessä lääkeresistenssin asteeseen, ja mitä enemmän mutaatiopaikkoja, sitä suurempi on lääkeresistenssi.

sekvensoinnin jälkeen tässä kokeessa seulotut Ei-SNP: t jakautuivat orf00490, orf00819, orf01916, orf01200, orf02235, orf03479 ja orf04094-geeneihin. Niistä geenit orf00490, orf00819 ja orf01916 osallistuvat soluseinän synteesiin. Kegg: n merkinnät ovat fumaraattireduktaasin alayksikkö D (frdD), solunjakautumisproteiini ftsI (penisilliiniä sitova proteiini 3) ja poriinin ulompi kalvoproteiini OmpD. Tutkimukset ovat osoittaneet, että frd-geeni koodaa FRD-entsyymiä, joka katalysoi fumaraattireduktaasin ja sukkinaattidehydrogenaasin välistä konversiota.16 on myös havaittu, että frdd-geenin monistaminen plasmidivektorilla voi lisätä meripihkahapon saantoa.17,18 yhdessä tämän tutkimuksen kanssa katsotaan, että frdD-geeni osallistuu tiettyihin metaboliareitteihin, jotka saattavat liittyä AMP-resistenssiin. E. coli-bakteereissa β-laktaamiantibioottien pääkohteet ovat pbp1 (solujen morfologian ylläpitäminen), PBP2 (E. coli-jännityksen ja sauvan muodon ylläpitäminen) ja pbp3 (bakteerien jakautumiseen liittyvä). PBP3 on solunjakautumisproteiinien ydinkomponentti, joka katalysoi soluseinän peptidoglykaanien ristisidontaa solunjakautumisen aikana.19-22 tutkimukset ovat osoittaneet, että OmpD-proteiinin ja OmpD-geenin ekspression down-säätely bakteerien biofilmeissä johtaa solukalvon läpäisevyyden vähenemiseen ja antibioottiresistenssin lisääntymiseen.23,24 tämän tutkimuksen tulosten mukaisesti OmpD-geenimutaatio käynnistää bakteeriresistenssin mekanismin β-laktaamiantibiooteille, ja E. coli-solukalvon läpäisevyyden väheneminen on yksi syy lisääntyneeseen AMP-resistenssiin. Näiden soluseinän synteesissä mukana olevien geenien koodaamien proteiinien toiminnan muutosten katsotaan vaikuttavan bakteerien vastustuskykyyn AMP: lle.

geenit orf04094, orf01200, orf02235 merkitään Kegg: ssä osmoottisena paineanturina histidiinikinaasi (envZ), multi-drug efflux pump geeni (acrB) ja multi-drug resistance protein involving in transkriptional regulation (marR). Viime vuosina aktiivinen efflux-mekanismi on pääsyy bakteerien moninaiselle lääkeaineresistenssille.25-27 koska suurin osa jätevesijärjestelmästä kuljettaa substraatteja laajalti, ja monet aktiiviset jätevesijärjestelmät voivat olla olemassa samoissa bakteereissa, tämä järjestelmä voi johtaa bakteerien vastustuskykyyn erilaisille antibakteerisille lääkkeille, joilla on täysin erilaiset rakenteet, eli moninkertaiselle resistenssille. Marlen Adlerin tutkimuksessa pelkästään ftsi-geenin mutaatiot eivät lisänneet antibioottiresistenssiä, kun taas ftsI-ja envZ-geenimutaatiot lisäsivät antibioottien MIC-arvoa moninkertaisesti. Cohen ym. osoittivat, että mutatoituneen MarR-geenin koodaaman inhiboivan proteiinin toiminta heikkenisi ja bakteerien vaikutus antibioottien moninkertaiseen vastustuskykyyn oli pieni, kun MarR-mutaatio vasta havaittiin.28 Merric ym., havaitsivat, että kolibakteeri osoitti vain vähäistä monilääkeresistenssiä, kun MarR-geeni mutatoitui.Tämän tutkimuksen tulokset osoittivat, että useita geenejä mutatoitui samanaikaisesti ja E. coli resistenssi AMP: lle lisääntyi.

geeni orf03479 merkitään valiiniglysiiniksi, joka toistaa G (VgrG) – proteiinia KEGG: ssä. Tyypin VI eritysjärjestelmä (T6ss) on faageihin liittyvä järjestelmä, jota esiintyy monilla bakteeripatogeeneillä, kuten Kolibakteerilla, Pseudomonas aeruginosalla ja Burkholderia cenocepacialla. Efektoritekijät voivat erittyä bakteerien solunulkoisiin, ja proteiinin eritysjärjestelmä liittyy läheisesti patogeenisten bakteerien virulenssiin. Wang Jianfeng ym. osoittivat, että vgrg-geenimutaatio vaikuttaa bakteerien myrkyllisyyteen ja lääkeresistenssiin, mutta glutamaattivaliinin toistoproteiinin toiminta on vielä epäselvää.30 tässä tutkimuksessa katsotaan, että vgrg-geeni saattaa liittyä AMP-resistenssiin, ja sen mekanismia on tutkittava tarkemmin.

yhteenvetona voidaan todeta, että näiden mutanttigeenien COG-toiminta liittyy solukalvojen syntyyn, epäorgaanisten ionien kuljetukseen ja aineenvaihduntaan sekä transkriptio-ja signaalinsiirtomekanismeihin. Tutkimukset ovat osoittaneet, että antibioottistressissä bakteerit voivat ottaa sekä aktiivisen puolustuksen että passiivisen puolustuksen varmistaakseen selviytymisensä.31 passiivisessa puolustuksessa bakteerit tekevät itsestään lepotilan, vähentävät elämän elinvoimaa ja estävät antibioottien yhdistelmän ja pyrkivät vähentämään antibioottien tappavaa vaikutusta. Aktiivisessa puolustuksessa ne lisäävät efflux-pumpun aktiivisuutta antibioottien poistumisen lisäämiseksi ja vähentävät antibioottien kertymistä bakteereihin, jolloin antibioottien tappava vaikutus bakteereihin vähenee. Tämä tutkimus viittaa siihen, että E. coli-bakteerin resistenssi AMP: lle on yhdistelmä aktiivisia puolustusjärjestelmiä ja passiivisia puolustusjärjestelmiä. Lääkeresistenssi voi syntyä vähän ennen kuin bakteerin MIC-arvo saavuttaa lääkeresistenssikynnyksen. Geenit frdD, ftsI, acrB, OmpD, marR, VgrG ja envZ liittyvät AMP-resistenssiin. Nämä tutkimukset auttavat parantamaan β-laktaamiantibiooteille vastustuskykyisen E. coli-bakteerin molekyylimekanismia ja tarjoavat tutkimusperustan monilääkeresistenttien bakteerien ehkäisylle ja torjunnalle sekä uusien antibioottien kohteille.