astrosyyttien sopiva merkkiaine: vertaamalla kolmen Astrosyyttimerkin jakautumista ja ilmentymistä hiiren eri aivoalueilla

Abstrakti

Astrosyyteillä on erilaisia morfologisia ominaisuuksia riippuen siitä, mistä aivoalueesta ne löytyvät. Mikään nykyisistä astrosyyttisistä markkereista ei kuitenkaan pysty merkitsemään kaikkia osapopulaatioita onnistuneesti. Näin ollen on ratkaisevan tärkeää määrittää sopiva merkkiaine tiettyä tieteellistä tutkimusta varten. Tässä vertasimme kolmen astrosyyttimerkkiaineen jakautumista ja proteiinin ilmentymistä: Ndrg2, GFAP ja s100ß, aivokuoressa, hippokampuksessa ja talamuksessa. NDRG2-ja S100ß-positiiviset astrosyytit jakautuivat tasaisemmin kuin GFAP-positiiviset astrosyytit koko aivoihin. NDRG2-ja S100ß-immunoreaktiivisuus oli voimakkainta dorsaalisessa aivokuoressa ja talamuksessa, kun taas GFAP-immunoreaktiivisuus oli voimakkainta hippokampuksessa. Lisäksi ndrg2: n, GFAP: n ja s100ß: n proteiini-ilmentymistasot aikuisilla hiirillä olivat korkeimmat aivokuoressa, hippokampuksessa ja talamuksessa. Havaitsimme myös astrosyyttien morfologian ja havaitsimme, että aivokurkiaisesta ja aivopuoliskosta löytyi GFAP-positiivisia astrosyyttejä, joilla oli enemmän ja pidempiä prosesseja kuin NDRG2 – ja S100ß-positiivisilla astrosyyteillä. Nämä tulokset osoittavat, että NDRG2: ta ja S100ß: ää käytetään sopivammin hahmottamaan astrosyyttien yleistä jakautumista ja määrän muutoksia sekä merkitsemään astrosyyttejä aivokuoressa ja talamuksessa. GFAP, kuitenkin, on sopivampi käyttää merkitsemään astrosyyttien corpus callosum, aivojen kantalaji, ja hippokampus. Nämä tulokset auttavat tutkijoita valitsemaan sopivan astrosyyttimarkkerin ja viittaavat astrosyyttien immunologisten ominaisuuksien eroihin sen perusteella, missä kudoksessa niitä on.

1. Johdanto

astrosyyttejä on pitkään pidetty apusoluina, jotka tarjoavat neuroneille vain trofista, metabolista ja rakenteellista tukea . Viime vuosina laaja tutkimus on kuitenkin osoittanut, että niillä on ratkaiseva rooli aivojen fysiologisissa ja patologisissa toiminnoissa. Astrosyytit auttavat ylläpitämään ionien homeostaasia ja veren aivoesteitä, synapsien muodostumista ja poistamista sekä ohjaamaan aivojen verenkiertoa ja säätelemään välittäjäaineiden kierrätystä, glutamaatti-eksitotoksisuutta ja antioksidanttista stressiä . Tärkeää on, että astrosyyteillä on morfologisia, populaatioita ja toiminnallisia eroja eri aivoalueilla . Siksi sopivimman merkkiaineen tunnistaminen astrosyyttien polymorfisille ja useille alaryhmille on ratkaisevan tärkeää astrosyyttisen monitoimintoisuuden tutkimukselle.

Glial fibrillary acid protein (GFAP) on yleisimmin käytetty astrosyyttinen markkeri, mutta pääasiallisena välihehkulangan muodostavana sytoskeletonina GFAP-immunolabeloitui vain noin 15% astrosyyttien kokonaismäärästä ja yli 40% astrosyyteistä todettiin GFAP-negatiivisiksi aikuisen rotan hippokampuksessa . Lisäksi GFAP leimasi protoplasmaisia ihmisen astrosyyttejä huonosti ja ilmeni kuituisten astrosyyttien kehityksen loppuvaiheessa .

toinen yleisesti käytetty astrosyyttimarkkeri on s100ß, Ca2+ – sitova peptidi, joka on runsaasti sytoplasmassa, ja astrosyyttien Tuma, joka osallistuu solusyklin säätelyyn ja sytoskeletonin muokkaukseen . S100ß ilmenee kuitenkin myös kypsien oligodendrosyyttien alapopulaationa, suonikalvon pleksin epiteelisoluissa ja muutamissa neuroneissa . GFAP: n ja S100ß: n puutteet astrosyyttien merkinnöissä voivat johtaa epätarkkuuksiin tai jopa virheisiin astrosyyttien toimintojen tutkimisessa.

n-Myc downstream-säännelty geeni 2 (NDRG2) löydettiin ensimmäisen kerran normaalista ihmisen aivojen cDNA-kirjastosta PCR-pohjaisella subtraktiivisella hybridisaatiomenetelmällä . Se on tuumorisuppressori ja solujen stressiin liittyvä geeni, joka liittyy solujen proliferaatioon ja erilaistumiseen . NDRG2 esiintyy laajalti aivokuoressa, hajulampussa, keskibraalissa, hippokampuksessa ja talamuksessa . Tärkeintä on, että NDRG2 ilmaistaan nimenomaan aivojen astrosyyteinä . Ndrg2: ta pidetäänkin uutena astrosyyttimerkkinä erityisesti kypsille, reagoimattomille ja proliferoitumattomille astrosyyteille . Sitä, onko NDRG2 luotettavampi kuin GFAP ja S100ß astrosyyttisenä merkkiaineena, sekä niiden jakautumisen ja ilmentymisen eroja eri aivoalueilla, ei kuitenkaan ole raportoitu.

tässä tutkimuksessa vertailimme astrosyyttisten merkkiaineiden ndrg2, GFAP ja s100ß jakautumista, proteiinin ilmentymistä ja keskinäistä kolokalisoitumista hiirten koko aivoissa. Pyrimme tunnistamaan sopivimman merkkiaineen astrosyyteille eri aivoalueilla.

2. Materiaalit ja menetelmät

2.1. Eläimet

nuoret, aikuiset ja vanhat c57bl / 6 1 kuukauden, 3 kuukauden, 6 kuukauden, 9 kuukauden ja 12 kuukauden ikäiset uroshiiret saatiin Central South Universityn Koe-Eläinkeskuksesta. Eläimet saivat vapaasti syödä ja juoda, niitä pidettiin 25 ± 1°C:n lämpötilassa ja niissä oli 12: 12 tunnin pituinen vaalea-tumma ympyrä, joka simuloi eläimen vuorokausirytmiä. Eläinten kärsimyksiä pyrittiin kaikin keinoin minimoimaan ja eläinten määrää vähentämään. Kaikissa eläinkokeissa noudatettiin protokollaa, jonka on hyväksynyt Central South University Animal Care and Use Committee, Kiina.

2, 2. Soluviljelmät

HT22-soluja (hermosolulinja) ja MA1800-57-soluja (astrosyyttisolulinja) viljeltiin dulbeccon modifioidussa Eagle-elatusaineessa (Dmem, Hykloni), joka sisälsi 10% sikiön naudan seerumia (FBS, Gibco), 50 U/mL penisilliiniä ja 50 µg/mL streptomysiiniä. OLN-93-solut (oligodendrogliaalinen solulinja) säilytettiin dmem: ssä täydennettynä 10-prosenttisella FBS: llä, 2 mM glutamiinilla, 50 U/mL penisilliinillä ja 50 µg/mL streptomysiinillä. Kaikki kennot säilyivät 37°C: ssa seoksessa, jossa oli 95% ilmakehän ilmaa ja 5% CO2: ta. HT22-solut, OLN-93-solut ja MA1800-57-solut kylvettiin dioihin ja värjättiin vasta-aineilla mikrotubulukseen liittyvää proteiinia 2 (MAP2), α-tubuliinia ja GFAP: tä vastaan.

2, 3. Immunofluoresenssivärjäystesti

sen jälkeen, kun hiiret oli nukutettu natriumpentobarbitaalilla (50 mg / kg), niiden aivot erotettiin ja kiinnitettiin 0, 9% kylmällä heparinisoidulla suolaliuoksella ja 4% paraformaldehydillä. Sekoittamisen jälkeen aivot kuivuivat peräkkäin 20% sakkaroosiliuoksessa ja 30% sakkaroosiliuoksessa. 10 µm: n paksuiset osat valmistettiin Leica CM1900-pakastesiivuleikkurilla. Aivo-osia inkuboitiin 1% H2O2: ssa 15 minuutin ajan ja 0, 3% Triton X-100: ssa 15 minuutin ajan, 3×pesua PBS: ssä jälkikutomisen jälkeen jokaisen käsittelyn välillä. Osat tukittiin 5% normaalilla vuohiseerumilla 1 tunnin ajan huoneenlämmössä ja inkuboitiin yön yli 4°C: ssa kostutuslaatikossa primaarisilla vasta-aineilla seuraavasti:hiiren anti-GFAP-vasta-aine (#3670, 1:500, solujen Signalointitekniikka); kanin anti-ndrg2-vasta-aine (#5667, 1:200, solujen Signalointitekniikka); hiiren anti-NDRG2-vasta-aine (#DA281-6A5, 1:100, Sigma); kanin anti-S100ß-vasta-aine (#2017-1, 1:500, epitomiikka); hiiren Anti-glutamiinisyntetaasi (GS) – vasta-aine (#mab302, 1:200, Millipore); kanin anti-map2-vasta-aine (#ab32454, 1: 500, abcam); ja hiiren anti-α-Tubuliinivasta-aine (#t6199, 1:500, Sigma). Sitten osiot inkuboitiin Alexa-488: n (vihreä, Invitrogen) ja Alexa-647: n (punainen, Invitrogen)-konjugoitujen aasi-Anti-kani-tai Aasi-anti-hiiri-sekundaaristen vasta-aineiden seoksilla 2 tunnin ajan pimeässä huoneenlämmössä. 4,6-Diamidino-2-fenyyli-indolia (Dapi) (ZLI-9557, Zsbio) käytettiin tumajyvästen värjäämiseen. Osat asennettiin 50-prosenttisella glyserolilla. Lopuksi osat tarkasteltiin ja valokuvattiin Olympus Bx51-fluoresenssimikroskoopilla (Japani). Tutkimuksessamme käytettyjä vasta-aineita käytettiin laajalti aiemmissa tutkimuksissamme ja muiden tutkijoiden toimesta , ja näiden vasta-aineiden herkkyys ja spesifisyys on varmistettu.

2, 4. Western Blot

aivokuori, hippokampus ja talamus kerättiin c57bl / 6-hiiriltä, jotka olivat 1 kuukauden, 3 kuukauden, 6 kuukauden, 9 kuukauden ja 12 kuukauden ikäisiä. Näytteet homogenoitiin RIPA-puskurissa, ja proteiininäytteiden pitoisuus mitattiin BCA Protein Assay Kit-testillä (Pierce Biotechnology, US). Proteiininäytteet erotettiin 10-prosenttisella SDS-Pagella (SDS-PAGE Gel kit, Cw0022s, Kiina) ja siirrettiin sähköisesti polyvinylideenidifluoridikalvoille (PVDF). SDS-PAGE-Geelisarjan komponentteihin kuului 30% Acr-Bis, SDS-PAGE-erottava Geelipuskuri, SDS-PAGE-pinoava Geelipuskuri, APS (ammoniumpersulfaatti) ja TEMED (N, N, N’, N’ – tetrametyylietyleenidiamiini). Tämän jälkeen kalvot tukittiin 5-prosenttisessa rasittamattomassa kuivassa maidossa, joka oli laimennettu tbst: llä (TBS, jossa 0, 05% Tween 20) 1 tunnin ajan huoneenlämmössä, minkä jälkeen niitä inkuboitiin spesifisillä primaarisilla vasta-aineilla: hiiren anti-GFAP-vasta-aine (#3670, 1:1000, Cell Signaling Technology); rabbit anti-ndrg2-vasta-aine (#5667, 1:1000, Cell Signaling Technology); rabbit anti-S100ß-vasta-aine (#2017-1, 1:1000, Epitomics); ja rabbit anti-Gapdh-vasta-aine (#5174, 1:1000, Cell Signaling Technology) yön yli 4°C: ssa. kalvoja inkuboitiin HRP-konjugoidulla toissijaisella kanin tai hiiren vasta-aineella (Thermo Scientific, USA) 2 h. kemiluminesenssisignaalit kehitettiin käyttäen Western Lightning chemiluminesenssi reagenssi plus (PerkinElmer life sciences; Wellesley, MA) ja havaittu kuva-analysaattorilla LI-COR Odyssey System (LI-Cor Biotechnology, USA). Proteiininauhojen immunoreaktiivisuus analysoitiin kvantitatiivisesti Bio-Rad® Image Lab™ – ohjelmistolla. Taajuusalueen tiheysarvot normalisoitiin gapdh: ksi.

2, 5. Kvantitatiivinen (reaaliaikainen) polymeraasiketjureaktio (reaaliaikainen PCR)

aivokuori, hippokampus ja talamus kerättiin c57bl / 6-hiiriltä, jotka olivat 1 kuukauden, 3 kuukauden, 6 kuukauden, 9 kuukauden ja 12 kuukauden ikäisiä. Kokonais-RNA eristettiin käyttäen TransZol Up Plus RNA-pakkausta (koodi nro. ER501-01, Transgen, Kiina) ja kvantifioitu NanoDrop 2000-menetelmällä. Sitten 1000 ng kokonais-RNA: ta transpriboitiin käänteisesti 20 µL: n reaktiossa 42°C: ssa 15 minuutin ajan, minkä jälkeen 85°C: ssa 5 sekunnin ajan käyttäen TransScript®-All-In-One-Alkujuosteista cDNA-synteesin Supermixiä qPCR: lle (koodi No. AT341, Transgen, Kiina). Pakkauksen komponentteihin kuului 5×TransScript® All-In-One SuperMix qPCR: lle (TransScript® RT, RNase Inhibitor, Anchored Oligo(DT)18 Primer, Random Primer(N9), dNTPs, buffer), 5×TransScript® All-in-One no-RT Control SuperMix qPCR: lle, gDNA Remover ja rnaasivapaa vesi. Negatiivisena kontrollina käytettiin 5×TransScript® All-In-One No-RT Control SuperMix for qPCR. Reaaliaikainen PCR suoritettiin 20 µL: n reaktiolla valmistajan transstart Tip Green qRNA SuperMix-käyttöohjeen mukaisesti (koodi No. AQ141, Transgen, Kiina). Käytetyt mRNA-pohjusjaksot löytyvät taulukosta 1. Reaktio suoritettiin 94°C: ssa 30 sekunnin ajan ja sen jälkeen 40 sykliä 94°C: ssa 5 sekunnin ajan, 60°C: ssa 15 sekunnin ajan ja 72°C: ssa 19 sekunnin ajan ViiA7-reaaliaikaisella PCR-tunnistusjärjestelmällä (2720 Thermal Cycler, Applied Biosystems). Suhteellisesta mRNA-lausekkeesta johdetut alukkeet ja sekvenssit analysoitiin kaavan avulla .

2, 6. Tilastollinen analyysi

tilastolliset testit tehtiin käyttäen PRISM v7.0-ohjelmistoa (GraphPad). Kahden ryhmän väliset vertailut tehtiin opiskelijoiden t-testeillä. Vertailut eri ryhmien välillä tehtiin yksisuuntaisella Anovalla Tukeyn posttestilla. Kaikki arvot esitettiin keskiarvona ± SD. Arvoja p<0, 05 pidettiin tilastollisesti merkitsevinä.

3. Tulokset

3.1. Ndrg2: lla, GFAP: lla ja S100ß: llä merkittyjen astrosyyttien jakautuminen eri aivoalueilla

hiirten cerebra-alueet tunnistettiin merkitsemällä solujen tumat. Lisäksi käytettiin vastaavaa hiiren aivoatlaksea analysoitujen alueiden todentamiseen (Kuva 1). Käytimme sitten immunofluoresenssivärjäystä ndrg2: n, GFAP: n ja S100ß: n merkitsemien astrosyyttien jakautumisen havaitsemiseen 6 kuukauden ikäisten aikuisten uroshiirien eri aivoalueilla. NDRG2-ja S100ß-positiivisia astrosyyttejä oli runsaammin ja tasaisemmin kuin GFAP-positiivisia astrosyyttejä koko aivoissa (kuva 2). NDRG2-positiiviset astrosyytit keskittyivät dorsaaliseen aivokuoreen (Alue 1) ja talamukseen (alue 5), mutta vähemmän hippokampukseen (Alue 4), corpus callosumiin (Alue 3) ja ventraaliseen aivokuoreen (Alue 2) ja vähiten aivopuoliskoon (alue 6) (Kuvat 2(a) ja 2 (b)). GFAP-positiiviset astrosyytit keskittyivät eniten hippokampukseen; vähemmän havaittiin corpus callosum ja aivojen kannan ja lähes huomaamaton dorsal cortex, ventral cortex, ja talamus(Kuvat 2(a) ja 2 (c)). S100ß-positiivisia astrosyyttejä oli eniten dorsaalisessa aivokuoressa ja talamuksessa, vähemmän hippokampuksessa ja ventraalisessa aivokuoressa, ja vähiten aivojen kantaosassa ja corpus kallosumissa (Kuvat 2(b) ja 2(c)). Ndrg2-positiivisten astrosyyttien jakauma oli samanlainen kuin S100ß-positiivisten astrosyyttien.

(a)

(b)

(a)
(b)

(a)

(b)

(c)

(a)
(b)
(c)

Figure 2

The distribution of astrocytes labeled by NDRG2, GFAP and S100β throughout the cerebrum. Edustavat immunofluoresenssikuvat astrosyyteistä, jotka on merkitty GFAP: llä ja NDRG2 (a): llä, S100ß: llä ja NDRG2 (b): llä, GFAP: lla ja S100ß (c): llä aikuisten uroshiirien aivoissa (6 kk) pienellä suurennuksella. Alue 1: dorsaalinen aivokuori; Alue 2: ventraalinen aivokuori; Alue 3: corpus callosum; Alue 4: hippokampus; alue 5: talamus; alue 6: aivokanta. n = 6. Skaalatangot = 500 µm.

astrosyytit eri aivoalueilla osoittivat ndrg2: lle, GFAP: lle ja S100ß: lle vertaansa vailla olevia immunoreaktioita (kuva 2). Dorsaalisen aivokuoren ja talamuksen astrosyytit reagoivat voimakkaasti NDRG2: een ja S100ß: ään, mutta heikosti GFAP: hen. Hippokampuksen astrosyytit reagoivat voimakkaasti GFAP: iin ja kohtalaisesti NDRG2: een ja S100ß: iin. Astrosyytit ventraalisessa aivokuoressa, corpus callosumissa ja aivopuoliskossa reagoivat heikosti kohtalaisen ndrg2: een, GFAP: iin ja S100ß: iin (Taulukko 2).

ndrg2: lla, GFAP: lla ja S100ß: llä merkittyjen astrosyyttien jakauma uroshiirien eri aivoalueilla oli samanlainen kuin vanhoilla uroshiirillä (12 kk) (kuva 3).

3, 2. Astrosyyttien Morfologiat, joita merkitään Ndrg2: lla, GFAP: lla ja S100ß: llä eri aivoalueilla

astrosyytit jakautuvat pääasiassa kahteen tyyppiin: kuitumaiset astrosyytit valkoisessa aineessa ja protoplasmaiset astrosyytit harmaassa aineessa. Siksi vertasimme morfologioita kahden tyypin merkitty eri markkereita korpus callosum (valkoinen aine, Alue 3) ja hippokampus (harmaa aine, Alue 4) (kuva 4). Aikuisten uroshiirien (6 kk) tulokset osoittivat NDRG2 – ja S100ß-positiivisten astrosyyttien esittävän stellaattimuotoa, jolle on ominaista suuri ja Pyöreä soma sekä lyhyet ja karkeat sytoplasmaprosessit, joilla oli vähän haaroja. GFAP-positiiviset astrosyytit, jotka on esitetty säteittäisellä muodolla, jolle on ominaista pieni soma, pitkät prosessit ja multibranches (Kuva 4). Lisäksi corpus callosum – ja CP-kantaluvuissa GFAP: llä merkityt astrosyytit esitetään runsaammin pidemmillä prosesseilla kuin ndrg2: lla ja S100ß: llä merkityt (kuvat 5 ja 7).

3, 3. Ndrg2: n, GFAP: n ja S100ß: n Kolokalisaatio astrosyyttien sisällä eri aivoalueilla

NDRG2 kolokalisoitui lähes GFAP: lla ventraalisen aivokuoren astrosyyteissä, korpuksen kallosumissa ja aivojen kantasoluissa, ja useimmiten kolokalisoitui GFAP: llä hippokampuksen astrosyyteissä (kuvat 5 ja 8(a)). Ndrg2: lla ei ollut juuri lainkaan kolokalisaatiota GFAP: n kanssa dorsaalisen aivokuoren ja talamuksen astrosyyteissä (kuva 5). NDRG2 ja S100ß esittivät lähes täydellisen kolokalisaation kuuden aivoalueen astrosyyteissä(kuvat 6 ja 8 (b)). GFAP ja S100ß esittivät merkittävän kolokalisaation ventraalisen aivokuoren astrosyyteissä, corpus callosumissa ja aivojen kantasoluissa ja lähes täydellisen kolokalisaation hippokampuksen astrosyyteissä (Kuva 7). GFAP: lla ja S100ß: llä ei ollut juuri lainkaan kolokalisaatiota dorsaalisen aivokuoren ja talamuksen astrosyyteissä (Kuva 7).

(a)

(b)

(c)

(d)

(e)

(a)
(b)
(c)
(d)
(e)

Figure 8

The colocalization and protein expression of NDRG2, GFAP, ja S100ß eri aivojen alueilla. (a)-(b) ndrg2+/GFAP+ astrosyyttien ja NDRG2+/S100ß+ astrosyyttien kvantitatiivinen analyysi. Tulokset esitettiin keskiarvona ± SD. Viiden kentän soluja laskettiin. (C) – (e) Ndrg2 -, GFAP-ja s100ß-proteiinien ilmentymistasot aikuisten uroshiirien aivokuoressa, hippokampuksessa ja talamuksessa (6 kk) määritettiin Western blot-analyysillä. Representatiiviset blotit ja kvantitatiivinen analyysi osoitettiin. Tulokset esitettiin keskiarvona ± SD ja analysoitiin yksisuuntaisella ANOVALLA Tukeyn jälkitesteillä. n = 6. p<0.05, p<0, 01, ja p<0, 001.

hiirten aivojen astrosyyteissä havaittiin myös ndrg2: n ja toisen astrosyyttisen tekijän, glutamiinisyntetaasin (GS), kolokalisoitumista. NDRG2: lla ja GS: llä oli merkittävä kolokalisaatio astrosyyteissä (Kuva S1A). NDRG2 ja GS esittivät perusteellisen kolokalisaation keltarauhasen kuituisissa astrosyyteissä ja hippokampuksen protoplasmaisissa astrosyyteissä (Kuva S1B). Ndrg2-proteiinin ilmentymistä havaittiin myös hermosolulinjan HT22-soluissa, oligodendrogliaalisissa SOLULINJASSA OLN-93-soluissa ja astrosyyttisessä solulinjassa MA1800-57-soluissa (Kuva S2). NDRG2-proteiinia havaittiin MA1800-57-soluissa ja sitä havaittiin hädin tuskin HT22-soluissa ja OLN-93-soluissa (kuvat s2a ja s2b).

3, 4. Ndrg2 -, GFAP-ja S100ß-proteiinien ilmentyminen eri aivoalueilla

käytimme western blottingia ndrg2 -, GFAP-ja S100ß-proteiinien ilmentymistasojen havaitsemiseen kolmella aikuisen uroshiiren aivoalueella (6 kk): aivokuori, hippokampus ja talamus (Kuva 8 (c)). Analysoimme näiden merkkiaineiden ilmentymistasot samalla aivoalueella(Kuva 8 (d)). Aivokuorella ndrg2-ilmentymän taso oli selvästi korkeampi kuin GFAP-ja S100ß-ilmentymistasot (p<0, 001, p<0, 05). Myös s100ß: n ilmaisutaso oli huomattavasti korkeampi kuin GFAP: n (p<0,05). Hippokampuksessa GFAP-ilmaisun taso oli korkeampi kuin NDRG2 ja S100ß (p<0.01), ja ndrg2-lausekkeen taso oli hieman pienempi kuin s100ß-lausekkeen taso, vaikka ero ei ollut tilastollisesti merkitsevä. Talamuksessa s100ß: n lauseketaso oli huomattavasti korkeampi kuin GFAP: n ja NDRG2: n lauseketasot (p<0,01), kun taas NDRG2: n lauseketaso oli samanlainen kuin GFAP: n.

seuraavaksi analysoimme saman merkkiaineen ilmentymistasot eri aivoalueilla (Kuva 8(e)). Ndrg2-ilmentymän taso aivokuoressa oli paljon korkeampi kuin hippokampuksella ja talamuksella (p<0, 01), eikä hippokampuksen ja talamuksen välillä havaittu merkittävää eroa. GFAP-ilmentymän taso hippokampuksessa oli korkein kolmesta alueesta (p<0, 001, p<0, 01); aivokuoren ja talamuksen välillä ei havaittu merkittävää eroa. S100ß-ilmentymän taso talamuksessa oli huomattavasti korkeampi kuin aivokuorella ja hippokampuksessa (p<0.01), mutta kahden viimeksi mainitun välillä ei havaittu merkittävää eroa.

havaitsimme myös ndrg2: n, GFAP: n ja S100ß: n proteiinipitoisuudet aivokuoressa, hippokampuksessa ja talamuksessa 1 kuukauden, 3 kuukauden, 6 kuukauden, 9 kuukauden ja 12 kuukauden ikäisillä uroshiirillä (kuvat 9(a)-9(f)). Ndrg2: n ja GFAP: n proteiinipitoisuudet aivokuoressa, hippokampuksessa ja talamuksessa kasvoivat vähitellen iän myötä (p<0, 05, p<0, 01). S100ß: n proteiinipitoisuudet aivokuoressa ja talamuksessa, mutta ei hippokampuksessa, nousivat vähitellen iän myötä (p<0.05, p<0, 01, p<0, 001). Ndrg2: n, GFAP: n ja s100ß: n mRNA-tasot aivokuoressa, hippokampuksessa ja talamuksessa olivat 1 kuukauden, 3 kuukauden, 6 kuukauden, 9 kuukauden ja 12 kuukauden ikäisillä uroshiirillä yhdenmukaiset proteiinipitoisuuksien kanssa (p<0, 05, p<0, 01, luvut 9(g) – 9(i)).

(a)

(b)

(c)

(d)

(e)

(f)

(g)

(h)

(i)

(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)
(h)
(i)

Figure 9

The expression of NDRG2, GFAP, and S100β in different cerebral regions of different aged male mice. (a)-(f). 1 kuukauden, 3 kuukauden, 6 kuukauden, 9 kuukauden ja 12 kuukauden ikäisten uroshiirien ndrg2 -, GFAP-ja s100ß-proteiinin tasot aivokuoressa, hippokampuksessa ja talamuksessa määritettiin Western blot-analyysillä. Representatiiviset blotit ja kvantitatiivinen analyysi osoitettiin. (g) – (i) 1 kuukauden, 3 kuukauden, 6 kuukauden, 9 kuukauden ja 12 kuukauden ikäisten uroshiirien ndrg2 -, GFAP-ja s100ß mRNA-pitoisuudet aivokuoressa, hippokampuksessa ja talamuksessa määritettiin qPCR-analyysillä. Kvantitatiivinen analyysi kävi ilmi. 1 kuukauden keskiarvo standardoitiin 1: een. Tulokset esitettiin keskiarvona ± SD ja analysoitiin opiskelijan t-testeillä. n=6. p<0, 05, p<0, 01, ja p<0, 001. 1 m = 1 kk; 3 m = 3 kk; 6 m = 6 kk; 9 m = 9 kk; 12 m = 12 kk.

4. Keskustelu

tässä tutkimuksessa havaittiin, että ndrg2: lla ja S100ß: llä merkityt astrosyytit jakautuivat laajemmin ja yhdenmukaisemmin kuin GFAP: llä merkityt nuorten, kypsien ja vanhojen hiirten koko aivoissa. Tämä viittaa siihen, että NDGR2 ja S100ß ovat sopivampia merkkiaineita astrosyyttien kokonaisjakauman ja lukumäärämuutosten havainnointiin. Lisäksi tuloksemme osoittivat, että astrosyytit eri aivoalueilla esittivät erilaisia immunoreaktiivisuuden tasoja ndrg2: lle, GFAP: lle ja S100ß: lle, mikä viittaa siihen, että aivokuoressa ja talamuksessa NDRG2 ja S100ß ovat sopivampia astrosyyttimerkkejä kuin GFAP. Astrosyyttien epäyhtenäinen immunoreaktiivisuus NDRG2: een, GFAP: iin ja S100ß: iin saattaa johtua myös käyttämiemme vasta-aineiden herkkyydestä ja spesifisyydestä. Lisäksi ndrg2: lla ja S100ß: llä merkittyjen astrosyyttien morfologiat olivat samankaltaisia keskenään, mutta selvästi erillisiä GFAP: llä merkityistä astrosyyttien morfologioista, koska nämä markkerit merkitsivät erilaisia sytoskeletaalisia rakenteita. NDRG2 tahraa sytoplasman ja solukalvot ja tahraa heikosti tuman . GFAP tahraa pääasiassa Soman ja prosessit, mutta ei tumaa, kun taas S100ß tahraa tuman ja osan sytoplasmasta ja prosesseista . Vertaamalla ndrg2: lla, GFAP: lla ja S100ß: llä merkittyjen astrosyyttien morfologioita havaitsimme, että GFAP oli sopivampi merkkiaine astrosyyteille aivokurkiaisessa, aivojen kantasolussa ja erityisesti hippokampuksessa. Proteiineja NDRG2 ja S100ß ilmaistiin eniten aivokuoressa ja talamuksessa. Voimme päätellä, että NDRG2 sopii paremmin astrosyyteille aivokuoressa, kun taas S100ß sopii paremmin astrosyyteille talamuksessa mitattaessa astrosyyttistä tiheyttä. Ndrg2: n, GFAP: n ja S100ß: n erilaiset proteiinin ilmentymäkuviot aivokuoressa, hippokampuksessa ja talamuksessa vahvistivat astrosyyttisen funktionaalisen heterogeenisuuden.

Astrosyyteillä on todettu olevan tärkeä rooli homeostaasin ylläpitämisessä, ja ne osallistuvat aktiivisesti lähes kaikkiin neurologisiin häiriöihin, kuten iskeemisiin aivohalvauksiin, traumaattisiin aivovammoihin, Alzheimerin tautiin ja Parkinsonin tautiin . On osoitettu, että astrosyyttinen morfologia, geenien ilmentyminen ja toiminta erosivat eri alueilla aivoissa . Kuitumaiset astrosyytit ja protoplasmiset astrosyytit ovat kaksi morfologialtaan tunnistettua pääalapopulaatiota . Kuitumaisilla astrosyyteillä on pitkät, ohuet prosessit ja tähtimäinen ulkonäkö, kun taas protoplasmaisilla on lukuisia hienoja prosesseja, jotka koskettavat ja tuppaavat synapseja . On kiinnostavaa, että astrosyyttien osajoukot ilmaisevat monia geenejä heterogeenisesti. Nämä geenit koodaavat proteiineja , kuten glutamaattikuljettajia ja ionikanavia sekä glutamaatti -, dopamiini-ja opioidireseptoreita .

geeniekspression heterogeenisuus viittasi astrosyyttien funktionaaliseen monimuotoisuuteen. Esimerkiksi glutamaatin kertymä vaihtelee eri osajoukkojen välillä . Lisäksi spontaanit kalsiumin värähtelyt vaihtelevat somatosensorisen aivokuoren eri kerrosten välillä. Aivokuoren kerroksen 1 astrosyytit osoittivat usein asynkronista Ca2+ – aktiivisuutta, kun taas kerroksen 2/3 astrosyytit osoittivat harvoin synkronista Ca2+ – aktiivisuutta . Aivokuoressa astrosyytit reagoivat glutamaattiin ja noradrenaliiniin lisäämällä kalsiumia, kun taas hippokampaalisissa astrosyyteissä esiintyy kalsiumvasteita ATP: lle, GABA: lle, glutamaatille, asetyylikoliinille, prostaglandiineille ja endokannabinoideille . Tutkimukset ovat myös osoittaneet, että eri aivoalueilta viljellyillä astrosyyteillä on erilainen kyky stimuloida neuriittien kasvua ja haarautumista . Koska astrosyyteillä eri aivoalueilla on erilaiset morfologian ja toiminnan ominaisuudet, astrosyyttien sopivimman merkkiaineen tunnistaminen eri aivoalueilla on ratkaisevan tärkeää astrosyyttitutkijoille.

vaikka useita proteiineja on raportoitu selektiivisesti astrosyyttien avulla ilmaistuina, minkään niistä ei ole osoitettu rajoittuvan täysin kaikkiin astrosyyttisiin alatyyppeihin. GFAP, yleisimmin käytetty astrosyyttimarkkeri, ilmaistaan mieluiten valkoisen aineen astrosyyteinä harmaan aineen sijaan, eikä siinä merkitä kaikkia astrosyyttien prosesseja . Vielä tärkeämpää on, että on olemassa osajoukkoja GFAP-negatiivisia astrosyyttejä, jotka esittävät jänniteriippuvaisia K+-virtoja, kun taas GFAP-positiiviset astrosyytit esittävät ajasta ja jännitteestä riippumattomien virtojen klassisen kaavan .

aiemmissa tutkimuksissa havaittiin, että S100ß kykeni merkitsemään astrosyyttejä sekä harmaaseen että valkoiseen aineeseen, mutta se ilmeni myös muutamissa oligodendrosyyteissä ja neuroneissa . S100ß havaittiin ilmentyvän eniten talamuksen astrosyyteissä, alatyypissä, joka osallistuu Parkinsonin taudin Daergisten terminaalien rappeutumisen tuottamien Daergisten roskien puhdistamiseen helpottamalla lysosomien esiintymistä ja autofagosomien muodostumista . Astrosyyttien transkriptomianalyysi tunnisti aldehydidehydrogenaasi 1-perheen, jäsenen L1 (ALDH1L1), astrosyyttiseksi markkeriksi . ALDH1L1 merkitsi kuitenkin myös oligodendrosyyttejä . Samoin eksitatorisilla aminohappojen transportereilla glutamaatti/aspartaattikuljettaja (GLAST), glutamiinisyntetaasilla (GS), glutamaatin transporter-1(GLT-1), vimentin, connexin 43, akvaporin 4 ja solun pinnan glykoproteiini CD44: llä oli myös rajoituksia merkittäessä astrosyyttejä .

NDRG2 ilmaistaan erityisesti sekä rottien että hiirien astrosyyteinä ja se liittyy kehittyvien alkioaivojen kasvuun ja kypsymiseen . Solujen proliferaation, erilaistumisen ja transmembraanikuljetusten lisäksi NDRG2 osallistuu myös stressireaktioihin, masennukseen, iskeemisiin sairauksiin ja neurodegeneratiivisiin häiriöihin . Hiirillä ja ihmisillä NDRG2 osallistuu attention-deficit/hyperactivity disorder (ADHD) – taudin kehittymiseen, joka liittyy aivokuoren liikuntakeskukseen . Flugge ym. havaittu ilmentymistä NDRG2 ihmisen, marmosets, puu päästäiset, rotat, ja hiiret, ja ehdotti NDRG2 oli uusi astrosyyttinen markkeri, erityisesti kypsä, nonreactive, ja nonproliferating astrosyytit . Tässä tutkimuksessa havaitsimme ensin ndrg2-positiivisten astrosyyttien jakautumisen eri aivoalueilla ja erot klassisilla merkkiaineilla GFAP ja S100ß merkittyjen astrosyyttien kanssa.

astrosyytit ja astrosyyttiset merkkiaineet muuttuivat normaalin aivojen vanhenemisen aikana. Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että astrosyytit aktivoituvat varhain vanhetessaan, ja GFAP-positiivisten astrosyyttien merkittävä lisääntyminen havaittiin ikääntyneiden hiirten hippokampusalueilla . Sekä GFAP-proteiinin että GFAP-mRNA: n tasot kohosivat ikääntyvien aivojen eri osissa, kuten aivokuoressa, hippokampuksessa ja pikkuaivoissa . Poikkeavuudet ovat edelleen eri raporteissa s100ß ikääntyvissä aivoissa . Yhä useammin tutkimukset ovat osoittaneet, että NDRG2 on yhteydessä ikään liittyviin häiriöihin, kuten Alzheimerin tautiin. Tutkimuksessamme GFAP: n ja NDRG2: n mRNA: n tasot aivokuoressa, hippokampuksessa ja talamuksessa kasvoivat vähitellen iän myötä, kun taas s100ß mRNA: n tasot hippokampuksessa ja talamuksessa kasvoivat iän myötä, mutta eivät aivokuoressa.

on huomattava, että tällä hetkellä astrosyyttien merkitsemiseen käytetään testaamiemme merkkien lisäksi monia merkkejä, kuten ALDH1L1, GLAST, GLT-1, CD44 ja vimentin. Tutkimuksessamme vertasimme vain klassisen aivojen astrosyyttejä, jotka on merkitty uudella ehdotetulla merkkiaineella NDRG2, ja yleisimmin käytettyjä merkkiaineita: GFAP, S100ß ja GS aivoissa.

johtopäätöksenä tutkimuksemme osoittaa, että NDRG2 ja S100ß ovat sopivampia merkkiaineita aivokuoren astrosyyteille ja talamukselle, kuten myös astrosyyttien yleisen jakautumisen ja määrän muutosten havainnointiin kaikkialla aivoissa. Samaan aikaan GFAP on ndrg2: ta ja S100ß: ää parempi merkittäessä astrosyyttien prosesseja ja haaroja korpuksen kallosumassa, aivojen kantasolussa ja erityisesti hippokampuksessa. Tutkimuksemme osoittaa, miten tärkeää on valita sopivin merkki astrosyyteille eri hiiren aivoalueilla, mikä antaa ohjeita neurotieteen tutkijoille tutkiessaan astrosyyttisiä toimintoja.

tietojen saatavuus

tämän tutkimuksen tulosten tueksi käytetyt tiedot on sisällytetty artikkeliin.

Disclosure

Zengli Zhang ja Zhi Ma ovat ensimmäiset kirjoittajat.

eturistiriidat

kirjoittajat ilmoittavat, ettei heillä ole eturistiriitoja.

tekijöiden osuus

Zengli Zhang ja Zhi Ma osallistuivat yhtä lailla tähän tutkimukseen.

kiitokset

tätä työtä tukivat Beijing Natural Science Foundation (nro 7194321 Lixia Zhangille), Kiinan kansallinen Luonnontieteellinen säätiö (nro 81801138 Yulong Ma: lle, nro 81771206 Wangyuan Zoulle), Kiinan Anestesiologiyhdistyksen Young Scholar-tutkimusapuraha (nro 21700001 Yulong Ma: lle), Kiinan Miaopu-säätiö pla General Hospital (ENT. 18kmm47 Lixia Zhangille), ja Pekingin Kuntatiedettä & Teknologiakomissio (nro 1811000017180022 Hang Guolle).

lisämateriaalit

täydentävä Kuva 1. Ndrg2: n ja GS: n kolokalisaatio astrosyyttien sisällä. Täydentävä Kuva 2. Ndrg2-proteiinin ilmentyminen solulinjoissa. (Lisämateriaalit)