Cd47: n Kaksoissalpaus ja HER2 eliminoi radiovastustavat rintasyöpäsolut

solulinjat

ihmisen rintasyöpä MCF-7, MDA-MB-231, BT474, BT549, SKBR3-solulinjat, glioblastooma U251 ja paksusuolen syöpä HCT116-solulinjat ostettiin ATCC: ltä. MCF-7 -, MDA-MB-231 -, bt474 -, BT549-ja U251-kennoja säilytettiin dmem-keskuksessa täydennettynä 10% FBS: llä ja SKBR3-kennoja säilytettiin rpmi-1640-keskuksessa 10% FBS: llä. HCT116-solut säilyivät McCoyn 5a-Mediumissa 10% FBS: llä. Radioaktiivisesti kestävät MCF7/C6-ja MDA-MB-231/C5-solulinjat, jotka kloonattiin mcf7-ja MDA−MB-231-solujen eloonjääneistä fraktioista toistuvan säteilytyksen jälkeen; HER2-yliekspressoivat rintasyövän kantasolut (HER2+/CD44+/CD24 – /low BCSCs) eristettiin MCF7 / C626: sta. Hiiren kolmoisnegatiivinen rintasyöpä 4T1-solut säilyivät dmem-Mediumissa 10%: lla FBS: stä. Ihmisen monosyytti THP-1 viljeltiin ATCC-formuloidussa rpmi-1640-väliaineessa, jota täydennettiin 10% FBS: llä, 15 mM HEPES: llä, 4, 5 g/l glukoosilla ja 2-merkaptoetanolilla lopulliseksi pitoisuudeksi 0, 05 mM. hiiren Mφ raaka 264.7 solua viljeltiin dmem-elatusaineella 10 prosentin FBS: n jälkeen ATCC-viljelmämenetelmällä. Kaikki solulinjat testattiin negatiivisella mykoplasma-kontaminaatiolla MycoSensor PCR Assay kit-testisarjalla (Agilent Technologies, luettelo # 302108).

plasmidit ja reagenssit

CD47-promoottoriohjattu lusiferaasivektori rakennettiin kloonaamalla ihmisen CD47-promoottorialue (-1554 nt) pgl2-emäksiseksi plasmidiksi KpnI / Hind III-sivustoilta. Putatiivisten NF-kB-sidontapaikkojen (TGGAAGCT-764-757) poistaminen suoritettiin nopealla mutaatiopaketilla (Stratagene, La Jolla, CA). Primer sekvenssit käytetään: 5 ′-GTGGTCGGGTACCTGCCCGCTCGCCCCTCGCGGGCTCTGCG-3′ (sense) and 5 ′-CGCAGAGCCCGCGAGGGGCGAGCGGGCAGGTACCCGACCAC-3′ (antisense).

pGL2-NF-κB-luc plasmid was constructed with the 3 NF-κB-binding sites: GTGGGTTCCC, TCGCCACTCCCC, and TGGAAAGTCCCC by blunt-end ligation. IMD-0354 (Catalog # I3159) and TNF-α (Catalog # T0157) were purchased from Sigma. The lentiCRISPR v2 vector was purchased from the Addgene plasmid repository (Catalog # 52961). Herceptin was obtained from the UC Davis Comprehensive Cancer Center Pharmacy as left-over medicine (Genentech, NDC 50242-132-01). Lapatinib (luettelo # S1028) ostettiin Selleckchemiltä. Anti-CD47 (B6H12)-vasta-aine IHC: lle, ICC: lle ja western blotille ostettiin Santa Cruzista (luettelo # sc-12730). Anti-CD47-FITC virtaussytometriaan ostettiin BD Biosciencesiltä (luettelo # 556045). Anti-human CD47 (B6H12)-vasta-aine fagosytoosimääritystä varten uutettiin b6h12.2 hybridoomasta (ATCC® HB-9771™). Tri William Frazierin (Washington University School of Medicine)toimittama miap301 hybridoomasta uuttama anti-hiiri-CD47-vasta-aine tuumorin in vivo estoon. Anti-CD11b-vasta-aine IHC-värjäykseen ostettiin Invitrogenista (luettelo # MA5-17857). Hiiren monoklonaalinen Anti-α-tubuliini-vasta-aine western blotille ostettiin Sigma-Aldrichilta (luettelo # T6074). Hiiren monoklonaalinen Anti-β-aktiinivasta-aine western blotille ostettiin Sigma-Aldrichilta (luettelo # A5441). Anti-HER2 / ERBB2 (luettelo # 29d8) vasta-aine IHC värjäystä ja western blot ostettiin Cell Signaling Technology (luettelo # 2165). Anti-HER2-APC-vasta-aine virtaussytometriaan ostettiin BD Biosciencesiltä (luettelo # 340554).

immunoblottaus

soluista tai kasvainkudoksista peräisin olevat proteiinit uutettiin RIPA lysis-puskurissa (Pierce), jota täydennettiin proteaasi-ja fosfataasinestäjäcocktaililla (Solusignalointi). Proteiinipitoisuus määritettiin BCA-määrityksellä (Pierce). Tämän jälkeen lysaatit denaturoitiin ja 30 µg proteiineja sisältäville näytteille tehtiin elektroforeesi 10-prosenttisessa SDS-polyakryyliamidigeelissä, minkä jälkeen ne siirrettiin polyvinylideenidifluoridikalvoille (Bio-Rad). Kun kalvo oli estetty 5-prosenttisella rasvattomalla kuivalla maidolla, se altistettiin primaariselle vasta-aineelle ja inkuboitiin 4 °C: ssa yön yli. Blotit visualisoitiin merkitsemällä ne HRP-kytketyillä sekundaarisilla vasta-aineilla (Sigma-Aldrich) ja inkuboimalla Amersham ECL western blotting detection-reagenssilla (luettelo # rpn2106). Blotit kehitettiin Konica SRX101A-kehittimellä ja kvantifioitiin ImageJ: llä.

Virtaussytometriaanalyysi

kerätyt solut huuhdeltiin PBS: llä, joka sisälsi 0, 5% PSA: ta PBS: ssä, ja solupellettejä inkuboitiin fluoresenssilla merkityillä primaarisilla vasta-aineilla 37 °C: ssa 30 minuutin ajan, minkä jälkeen ne pestiin kolme kertaa 0, 5%: lla BSA / PBS: ää. Kaikki vasta-aineet titrattiin tilan optimoimiseksi ennen kokeiluun hakemista. Flow Canto II-sytometrin (BD) avulla suoritettiin virtaussytometrian analyysi ja sen jälkeen flowjo (Tree Star, Ashland, or, USA) – ohjelmiston avulla. Gating-strategiat perustuivat FSC: n ja SSC: n ominaisuuksiin, ja ne suunniteltiin positiivisille solupopulaatioille FITC: ssä, APC-kanavissa.

ihmisen rintasyöpäkudokset

tuoreet pakastetut HER2-positiiviset ja negatiiviset rintasyöpäkudokset toimitti UC Davis Comprehensive Cancer Center Biorepository (IRB # 283665, ja IRB # 218204), jota rahoitti UC Davis Comprehensive Cancer Center Support Grant (CCSG), jonka myönsi Kansallinen syöpäinstituutti (NCI P30CA093373), ja kaikki potilastiedot oli estetty diagnostisia tuloksia lukuun ottamatta. Ohion osavaltionyliopiston patologian laitokselta saatiin tutkimuksen IRB-hyväksynnällä (#2002h0089) lisää patologisia ihmisen rintasyöpänäytteitä, mukaan lukien tilastoimattomat 4-µm: n paksuiset formaliinin kiinteään parafiiniin upotetut osat (FFPE), jotka on yhdistetty primaariseen rintasyöpään ja uusiutuviin rintasyöpiin.

immunohistokemia (IHC)

immunohistokemiallisesti värjättiin 4-µm: n paksuisilla FFPE-kudososuuksilla. Diat poistettiin hetkeksi ja nesteytettiin, ja antigeenejä haettiin 40 minuutin ajan sitraattipuskurissa (pH 6,1) 95 °C: ssa. Endogeeninen peroksidaasiaktiivisuus estettiin 3% H2O2-liuoksella. Ensisijainen vasta-aineiden inkubaatio suoritettiin 4 °C: ssa yön yli, minkä jälkeen Vectastain ABC Kit (Vector Laboratories) RT: ssä 30 minuutin ajan valmistajan ohjeiden mukaisesti. Reaktiotuotteet havaittiin Peroksidaasisubstraattisarjalla ja vastattiin hematoksyliinilla (Vektorilaboratoriot). Kaksi vanhempaa patologia vastasi klinikkaisten rintasyöpien diagnosoinnista ja kokeellisten kasvainten arvioinnista. CD47: n ilmentymistä arvioitiin käyttämällä sekä värjäytymisvoimakkuutta että värjäytyneiden solujen prosenttiosuutta. Värjäyksen voimakkuus luokiteltiin seuraavasti: 0: negatiivinen; 1: heikko; 2: kohtalainen; 3: vahva. Korkea ekspressio määriteltiin vahvaksi värjäysintensiteetiksi yli 25%: ssa kasvainsoluista; keskimääräinen ilmentymä oli kohtalainen värjäysintensiteetti yli 25%: ssa kasvainsoluista; Alhainen ilmentymä oli heikko värjäytymisvoimakkuus yli 25%: ssa kasvainsoluista tai kohtalainen värjäytyminen <25% kasvainsoluista käyttäen ASCO-CAP guidelines63 käytettiin HER2-immunohistokemian (IHC) tulkintaan, ja HER2-proteiiniekspressio pisteytettiin negatiiviseksi IHC 0: ksi (ei värjäytymistä tai kalvovärjäystä, joka on epätäydellinen ja heikko/tuskin havaittavissa ja ≤10%: n sisällä invasiivisista kasvainsoluista) tai negatiiviseksi IHC 1+ (epätäydellinen kalvovärjäys, joka on heikko/tuskin havaittavissa ja >10% invasiivisista kasvainsoluista); monitulkintainen IHC 2+ (kehän kalvovärjäys, joka on epätäydellinen ja/tai heikko/kohtalainen ja >10% invasiivisista kasvainsoluista; tai täydellinen ja kehän kalvovärjäys, joka on voimakasta ja enintään ≤10% invasiivisista kasvainsoluista); positiivinen IHC 3+ (kehän kalvovärjäys, joka on täydellinen, voimakas yli 10%: ssa invasiivisista kasvainsoluista). Jos tulokset olivat epäselvät (2+), refleksitestaus suoritettiin in situ-hybridisaatiolla (ISH). Tutkittaessa in vivo säteilytettyjen kasvainten cd47-ilmentymistä hoidetut hiirikasvaimet poistettiin ja kiinnitettiin 4% paraformaldehydiin PBS: ssä 24 tunnin ajan. näytteet dehydratoitiin sarjaetanolilla (70%, 95% ja 100%) 48 tunnin ajan, ennen kuin ne upotettiin parafiiniliuokseen (Polysciences).

Immunosytokemia (ICC)

solut kylvettiin pyöreisiin peitteisiin ja kasvatettiin 60-80-prosenttiseen yhtymäkohtaan, minkä jälkeen ne huuhdeltiin PBS: llä, kiinnitettiin 4% paraformaldehydiin (pH 7,2) ja permeabiloitiin 0,1% Triton X-100: lla PBS: ssä. Tämän jälkeen soluja inkuboitiin estoliuoksessa 15 minuutin ajan, ennen kuin ne inkuboitiin primaarisella vasta-aineella yön yli 4 °C:ssa 1: 250 laimennoksella. Soluja inkuboitiin TR-tai FITC-konjugoiduilla sekundaarisilla vasta-aineilla laimennettuna 1:1000 estoliuoksessa 1 tunnin ajan huoneenlämmössä pimeässä ja analysoitiin konfokaalimikroskopialla.

säteilyyn liittyvien antigeenisten proteiinien tunnistamista

C57/B6 hiirtä käytettiin immunisointi-isäntänä 5 × 106 MCF7 / C6-solua 0: ssa.1 ml ruiskutettuna hännän tai jalkapannan tyveen hiirtä kohti, minkä jälkeen tehostetaan samalla solumäärällä 14. päivänä. 5. -7. päivänä toisen haasteen jälkeen hiiret lopetettiin ja seerumi kerättiin antigeenisten molekyylien havaitsemiseksi RADIRESISTENTEISSÄ BC-soluissa. Raakaseerumilla tehtiin esipuhdistus seuraavien vaiheiden avulla, jotta voitiin erottaa Raakapselit normaaleissa rintojen epiteelisoluissa ja villityypin MCF7 soluissa ilmaistuista epäspesifisistä molekyyleistä. Kaksi miljoonaa ihmisen normaalia rintaepiteeli MCF10A-solua valmistettiin liuoksessa, joka sisälsi 1 mm EDTA / PBS ilman trypsiiniä, jotta vältettäisiin herkkien proteiinien pilkkominen, minkä jälkeen ne huuhdeltiin PBS: llä kahdesti. Kennot pelletoitiin, minkä jälkeen ne löystyivät napauttamalla putken pohjaa, lisäämällä 1 ml hiiren antiseerumia ja pyörittämällä sitä 4 °C: ssa 2 tunnin ajan. tämän jälkeen seosta sentrifugoitiin 9391 × g: n lämpötilassa 5 minuutin ajan 4 °C: ssa ja supernatantit kerättiin, mikä toistettiin kerran. Ensimmäinen puhdistettu antiseerumi puhdistettiin edelleen inkuboimalla villityyppisillä MCF7-soluilla samoja menetelmiä käyttäen ja toistettiin kuusi kertaa. Lopuksi puhdistettua antiseerumia testattiin western blotilla MCF10A-solujen, MCF7− solujen, MCF7/C6-solujen ja Rd-BCSC-solujen proteiinilysaattia vastaan, jotka lajiteltiin rintasyövän kantasolujen merkkiaineilla HER2+/CD44+/ CD24-sekä aldehydidehydrogenaasi (ALDH)64. CD47 ja HER2 yhdessä muiden radioaktiivisesti resistenttien BC-solujen Rappien kanssa tunnistettiin länsimaisilla bloteilla tai IMMUNOPRESIPITAATIOLLA RD-BCSC-soluista puhdistetuista kalvoproteiineista ja eluoidut fraktiot analysoitiin LC/MS-menetelmällä.tuloksena saadut kalvorappeumat ryhmiteltiin useilla proteiineilla ja proteiinifunktionaalisilla kategorioilla.

HER2: n ja CD47: n CRISPR-editointi

Sgrnat suunniteltiin tohtori Zhang Labin CRISPR-suunnitteluohjelman (http://crispr.mit.edu) julkaiseman ohjeen ja aiemmassa julkaisussa65 kuvatun vakiintuneen protokollan mukaan. Neljä Oligoa suunniteltiin vastaamaan ihmisen sgrnoja syntetisoitiin ja kloonattiin lentiCRISPR v2-vektoriksi Zhang Lab GeCKO – yhdistetyn kirjaston vahvistusprotokollan mukaisesti. Epäspesifisen kohdentamisen mahdollisuuden minimoimiseksi syntetisoitiin ja testattiin kolme sgrna-oligoa jokaisesta kohdistusgeenistä. Myöhempiin kokeisiin valittiin sgRNA, jolla oli paras Western blottingin määrittelemä tyrmäystehokkuus. Sgrna-sekvenssejä käytettiin ihmisen ja hiiren soluille seuraavasti:

hHer2gRNA_F: CACCGGGCACAGTGCGCGTC

hHer2gRNA_R: AAACGACGCGCACTGT CTGTGCCGC

hCD47gRNA_F: CACCGTAAATATAGATCCGGTGGTA

hCD47gRNA_R: AAACTACCAC CGGATCTATATTTAC

mHer2gRNA_ F: CACCGTGATGGCCCTCGCCCCTCGG

mHer2gRNA_ R: AAACCCGAGGGGCGAGGGCCATCAC

mCD47gRNA_F: CACCGCCCTTGCATCGTCCGTAATG

mCD47gRNA_R: AAACCATTACGGACGATGCAAGGGC

The lentiviral particles were generated using 293T cells following the protocol from Addgene. For gene editing, the isolated BCSC sphere cells or MCF7/C6 cells were trypsinized into single cells and plated 1. 2.5 × 105 cells/0.5 ml per well in the 12-well plates. 12 tunnin inkuboinnin jälkeen soluihin lisättiin 1 ml virusta sisältävää supernatanttia, jossa oli 8 ng polybreeniä, minkä jälkeen inkubaatiota jatkettiin 6 tunnin ajan. tämän jälkeen lisättiin 0, 5 ml tavallista elatusainetta, joka sisältää 10% lämpö inaktivoitua FBS: ää, ja sitä viljeltiin edelleen yön yli. Tartuntaviljelyaine korvattiin 2 ml: lla tuoretta viljelyainetta, jossa oli 10% FBS: ää, ja sitä viljeltiin 72 tunnin ajan. solut siirrettiin 60 mm: n kudosviljelyastioihin ja valittiin viljelemällä 0, 3 µg/ml Puromysiiniä 1 viikon ajan ja kohdennetun geenin tyrmäys varmistettiin immunoblottauksella.

Luciferaasimääritys

solut transfektoitiin pgl2-basic-CD47-tai pGL2-basic-CD47-ΔNF-kB-tai pGL2-NF-kB-luciferaasireportaaseilla, ja luciferaasin aktiivisuus mitattiin Luminometrillä (Promega, Madison, WI). Reporter-transfektiotehokkuuden normalisoimiseksi lysaattien kokonaisproteiinipitoisuus mitattiin BCA-Proteiinimäärityspaketilla (Pierce, Rockford, IL), jossa standardina oli BSA.

kromatiinin immunoprecipitation (ChIP)-määritys

solut ristisidottiin formaldehydiin (1% lopullinen) 10 minuutin ajan, pestiin jääkylmällä PBS: llä ja kerättiin SDS lysis-puskuriin (1% SDS, 10 mM EDTA, 50 mM Tris, pH 8. 1). Kromatiini kerittiin sonikoimalla, se esipuhdistettiin konjugoiduilla agaroosiproteiini G: llä ja inkuboitiin anti-p65: llä, anti-C-Rel: llä tai normaalilla IgG: llä 4 C: ssä yön yli. Kun proteiini G: tä oli lisätty 2 tunnin ajan 4 °C: n lämpötilassa, kompleksi pestiin peräkkäin vähäsuolaisilla ja runsassuolaisilla immuunikompleksi-pesupuskureilla (0. 1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris-HCl pH 8.1 + 150 mM NaCl vähäsuolaisille ja 500 mM NaCl runsassuolaisille puskureille) ja sen jälkeen TE-puskuri (kahdesti). DNA: n ja transkription välinen vuorovaikutus korjaantui, kun NaCl lisättiin ja inkuboitiin 65 °C: ssa yön yli. RNaasi A: n ja proteinaasi K: n digestion jälkeen DNA-fragmentit puhdistettiin fenoli/kloroformi-uuttamalla ja etanolisaostamalla. Dnat puhdistettiin ja niitä käytettiin PCR: ään, jonka primerit ovat spesifisiä geenien promoottorialueelle, joka käsittää NF-kB-sidontapaikat. CD47-alukkeet olivat:

5′-CGTGGACCAGGACACCTAGG-3′ (sense)

5′-AGGGAAGAGAACCGCATAGG-3′ (antisense)

The PCR amplification of the IκB promoter region (1134/902) was also included as positive. The primers for NF-κB-binding site in the IκB promoter were:

5′-TGTAGCACCCATTAGAAACACTTC-3′ (sense)

5′-TTCTTGTTCACTGACTTCCCAAT-3′ (antisense).

Preparation of anti-human and anti-mouse CD47 antibodies

Hybridoma for monoclonal mouse anti-human CD47 antibody (B6H12.2), IgG2b were obtained from ATCC. Monoklonaalinen rotan anti-hiiri CD47 IgG2a-vasta-aine (MIAP301) ja hybridooma saatiin tohtori William Frazierilta (Washington University School of Medicine). Molemmat hybridoomasolulinjat säilyivät imdm-Mediumissa 20%: lla FBS: stä. Vasta-aineet puhdistettiin hybridoma-supernatantista käyttäen genscript-proteiinihartsia (luettelo # L00209) valmistuksen vakiomenetelmien mukaisesti. Tämän jälkeen näytteitä tiivistettiin edelleen 10-20-kertaisesti Pall Life Sciencesin Mikrosep-keskipakoislaitteilla. Puhdistetun IgG: n pitoisuudet määritettiin mittaamalla absorbanssi od280: ssä.

Fagosytoosimääritys

sekä ihmisen monosyyttien THP1-solut että hiiren Mφ RAW 264, 7-solut (ATCC, TIB-71) säilyivät 5-prosenttisessa CO2-inkubaattorissa 37 °C66: ssa noin tiheyden ollessa 1 × 106 / ml. Noin 0,8 × 106 solua/ml raakaa 264,5 solua tai 1 × 106 THP1-solua kylvettiin 6-kuoppalevylle. 24 tunnin inkubaation jälkeen raakoja 264, 7-soluja aktivoitiin käsittelemällä 0, 1 µg/ml lipopolysakkaridia (LPS) 24 tunnin ajan. monosyyttien THP1-solut erilaistuivat Forbol 12-myristaatti-13-asetaatilla (PMA) (40 nM) 48 tunnin ajan. Aktivoidut makrofagit värjättiin Diolla loppukonsertossa 40 nM väliaineessa 20 minuutin ajan, minkä jälkeen ne huuhdeltiin kolme kertaa väliaineella. Syöpäsolut merkittiin 1 µM DDAO: lla (5 mM: n kantaliuos DMSO: ssa varastoituna -20 °C: ssa) PBS: ssä 37 °C: ssa 15 minuutin ajan ja pestiin PBS: llä, joka sisälsi 1% FBS: ää. DDAO-merkityt kohdesolut (1 × 106) lisättiin DIO-värjättyihin Mφ-soluihin, ja niitä inkuboitiin 2 ml: n lopullisessa tilavuudessa 37 °C: ssa 2 tunnin ajan. inkubaation jälkeen mφ-ja kohdesolut kerättiin kolminkertaisella EDTA-PBS-pesulla, jonka jälkeen trypsiini tehtiin 0,25-prosenttisesti. Fagosytoosia arvioitiin arvioimalla kaksoismerkittyjä rintasyöpäsoluja (Dio+/DDAO+), jotka edustavat fagosytoituneita rintasyöpäsoluja kypsien Mφ-solujen avulla virtaussytometrialla. Analyysiin käytettiin FlowJo-ohjelmistoa.

Klonogeeninen eloonjäämismääritys

klonogeeninen eloonjäämismääritys tehtiin sädehoidon jälkeen tai ilman hoitoa (lapatinibi 10 µM 72 tunnin ajan; anti-CD47-vasta-aine 10 µg / ml yön yli). Käsiteltyjä soluja viljeltiin 10-14 päivää ja pesäkkeitä kiinnitettiin, värjättiin Coomassien sinisellä tahralla. Pesäkkeet, joissa oli yli 50 solua, laskettiin elossa oleviksi klooneiksi ja normalisoitiin kunkin valekäsitellyn kasvainsolulinjan pinnoitustehokkuuteen.

Aukkotäyttönopeusmääritys

aukon täyttökapasiteetti mitattiin 1 × 106 solulla, jotka kasvatettiin kussakin 6-kuoppalevyssä 100-prosenttiseen yhtymäkohtaan, jota seurasi 24 tunnin solujen nälkiintyminen. Sitten aukko luotiin kaapimalla astia vinottain steriilillä pipetin kärjellä. Solut joko jätettiin hoitamatta tai käsiteltiin 10 µg/ml IgG-tai anti-CD47-vasta-aineella kokeen aikana. Täyttökapasiteettia seurattiin 72 tunnin ajan ja edustavat kuvat otettiin päivänä 0 (kaavintapäivä) ja päivänä 3.

Tumorsphere-muodostuminen

solut seulottiin 40 µm: n solusiivilöillä (luettelo # 352340. Corning) ja yksisoluiset suspensiot kylvettiin vähän kiinnitettyihin 60 mm petrimaljoihin, joiden tiheys oli 1000 solua/ml. Solut kasvatettiin seerumittomassa nisäkäsepiteelissä (mebm), jota täydennettiin B27: llä (luettelo # 17504-044. Life Technology), 20 ng/ml EGF (luettelo # 4022-500. Bionäkö), 20 ng/ml basic-FGF (luettelo # 13256-029. Invitrogen) ja 4 µg/ml hepariinia (luettelo # 80603-686 EMD MILLIPORE). Soluja viljeltiin 10 päivän ajan, ja kasvainpallot laskettiin valomikroskoopilla.

Transwell invasion assay

Aliquots (0. 4 ml) Matrigeliä (luettelo # 356231. BD Biosciences) laimennettiin päällystyspuskurilla: 0,01 M Tris (pH 8,0), 0,7% NaCl lopulliseksi pitoisuudeksi 200-300 µg/ml. Noin 100 µl lastattiin 24-kaivon transwellin (luettelo # 3422. Costar) ja inkuboidaan 37 °C: ssa hyytelöimiseksi noin 1 h. Poista jäljellä oleva pinnoitepuskuri varovasti läpäisevästä tukikalvosta kerrosta häiritsemättä ja lisää sitten soluja (2,5 × 104/ml). Alakammiossa oli 800 µl MEM-väliainetta, joka sisälsi 5 µg/ml fibronektiinia (luettelo # SC-29011. Santa Cruz). Eri tavoin käsiteltyjä soluja sisältävä transwell inkuboitiin 48 tunnin ajan ja värjättiin Diff-Quick Stain kitillä (luettelo # K7128. IMEB INC).

F (ab’)2 fragmentin valmistus

CD47 F (ab’)2 fragmentin valmistus IgG: n Papaiinihartsin pilkkoutumisella käyttäen F (ab’)2-valmistuspakkausta (luettelo # 786272. G-Bioscience) valmistajan suositusten ja raportoidun menettelyn67 mukaan. Papaiinin digestion jälkeen Fab-fragmentti erotettiin sulamattomasta IgG: stä ja Fc-alue Fab-Fragmentaatiosarjan proteiini A: n Spinout GT-600: n suolanpoistopylväät toimitettiin sen varmistamiseksi, että alkuperäinen vasta-ainenäyte on optimaalinen Fab-pirstoutumisen kannalta, ja puhdistettu anti-hiiri CD47 IgG kerättiin hiiren in vivo tuumorihoitoa varten.

BC-solujen säteily CRISPR-KO CD47: llä ja/tai HER2: lla

in vivo kasvaimen inhibitiotestissä cd47: n puutteellisella säteilyllä ja HER2− statuksella 5 × 105 4T1/C2− solua, joiden CRISPR− knockout of CD47 (CD47−/−), HER2 (HER2−/−) tai double (CD47−/ – /HER2 -/ -) istutettiin balb/c: n maitorasvapatoihin (n = 6 ryhmää kohti). Kasvaimen kasvua arvioitiin mittaamalla kasvaimen tilavuus joka 2. päivä alkaen päivästä 7 kunnes kasvaimen tilavuudet saavuttivat rajoituksen. Jotta voitaisiin arvioida cd47: n ja HER2: n eri statuksen omaavien kasvainten radiosensitiivisyyttä, paikallinen tuumorisäteily toimitettiin 5 Gy: llä jokaiseen kasvaimeen 9.päivänä ja kasvaimen kasvua mitattiin joka toinen päivä, kunnes kontrollikasvaimet saavuttivat maksimirajoituksen.

RT hiiren BC anti-CD47-ja/tai HER2-hoidoilla

in vivo-tutkimuksissa, joissa tutkittiin kasvaimen inhibitiota yhdellä CD47-vasta-aineella sädehoidon yhteydessä tai ilman sitä, anti-CD47-hoito noudatti Willinghamin ja al20: n protokollaa tietyin muutoksin. Kahdeksan viikon ikäiset immuuni-pätevät (BALB/c) naarashiiret (Charles River Laboratories, Sacramento, USA) ruiskutettiin 1 × 105 hiiren rintojen 4T1-soluilla 4.maitorauhasiin. Viisikymmentä mikrolitraa PBS, jotka sisälsivät 100 µg kontrolli-IgG: tä tai anti-CD47 F (ab’) – fragmentteja, ruiskutettiin kasvainkohtaan (päivä 1) tai kasvainkudoksiin (päivä 15) ja toistettiin joka toinen päivä kokeiden loppuun saakka. Kasvainmääriä seurattiin 5 päivän välein. Sädehoidossa anti-CD47 eli säteily yhdistettynä anti-CD47: ään 4T1-kasvaimia kantaneet eläimet jaettiin satunnaisesti eri hoitoryhmiin ja kontrolliryhmään (5-10 hiirtä ryhmää kohti). Kasvaimen paikallinen säteily alkoi, kun kasvaimen tilavuus saavuttaa 200 mm3 kuusen (5 Gy/päivä/kasvain neljä fraktiota käyttäen micro-beam IR lähde; kokonaisannos = 20 Gy) yhdistettynä kolme kertaa kasvain injektiot anti-CD47 F (ab’). In vivo säteilytettyjen kasvainten radiosensitiivisyyttä anti-CD47 F: n (ab’) kanssa tai ilman sitä arvioitiin mittaamalla kasvaimen tilavuus kokeiden lopussa. Eläimet lopetettiin, kun kasvaimet olivat ~1400 mm3 tai kun Eläimet näyttivät olevan epämiellyttävä, vaikka kasvain oli pienempi kuin 1400 mm3 noudattaa UCD IACUC määräyksiä käyttöä selkärankaisten eläinten tutkimuksessa. Kalifornian yliopiston Davisin Institutional Animal Use and Care Committee (Iacuc 15315) on hyväksynyt in vivo-sädehoidon eläinten käyttöä ja hoitoa koskevan protokollan.

sädehoidon yhteydessä tai ilman sädehoitoa suoritetuissa in vivo-testeissä, joissa tutkittiin kasvaimen inhibitiota CD47: n ja HER2: n kaksois-vasta-aineilla, kahdeksan viikon ikäisille immuunikykyisille (BALB / c) naarashiirille (Charles River Laboratories, Sacramento, USA) ruiskutettiin 1 × 105 hiiren 4T1-solua neljänteen maitorauhaseen. Kun kasvaimen tilavuus oli noin 200 mm3, hiiret jaettiin satunnaisesti neljään ryhmään (6 hiirtä ryhmää kohti). PBS, IgG, anti-CD47 F (ab’) – fragmentteja (100 µg) tai Herceptiniä (5 mg/kg) ruiskutettiin kasvainkudoksiin 4 tuntia ennen paikallista sädehoitoa (5 Gy päivässä 2 päivän ajan). Pistoksia tehtiin ja kasvaimen kokoa seurattiin joka toinen päivä kokeiden loppuun asti. Hiiret lopetettiin, kun kasvaimet olivat ~1400 mm3 tai kun Eläimet näyttivät olevan epämiellyttäviä, vaikka kasvain oli pienempi kuin 1400 mm3 noudattaa UCD IACUC määräyksiä käyttöä selkärankaisten eläinten tutkimuksessa. Kalifornian yliopiston Davisin Institutional Animal Use and Care Committee (Iacuc 15315) on hyväksynyt in vivo-sädehoidon eläinten käyttöä ja hoitoa koskevan protokollan.

kasvaimiin infiltroituneet makrofagit ja makrofagifagosytoosi

GFP: tä ilmentävät hiiren rintasyöpä 4T1-solut istutettiin BALB / c-hiirten neljänteen maitorasvatyynyyn ja hoito aloitettiin, kun kasvaimet saavuttivat noin 200 mm3 pistämällä kasvaimeen 50 µl PBS, joka sisälsi 100 µg kontrolli-IgG: tä, anti-CD47 F (ab’) – fragmentteja, Herceptiniä tai molempia vasta-aineita joka toinen päivä kolme kertaa. Kasvaimen paikallinen RT toimitettiin päivinä 10 ja 11 kanssa 5 Gy/vrk/kasvain kaksi fraktiota, kokonaisannos = 10 Gy, ja kokeet lopetettiin 2 päivää päättymisen jälkeen vasta-ainehoitojen. Kasvaimet uutettiin ja FFPE-osiot valmistettiin immunofluoresenssivärjäykseen standardimenettelyn mukaisesti: diat poikkesivat ja nesteytettiin, ja antigeenejä haettiin 40 min sitraattipuskurissa (pH 6.1) 95 °C:ssa.autofluoresenssin poistamiseksi dioja sockattiin de-autofluoresenssiliuoksessa (0.5 M CuSO4, 0.05 M NH4COOH in H2O) RT: ssä 48 tunnin ajan, huuhdeltiin vedellä 5 min 3times, sitten estetty 1: 100 hevosen seerumilla. Ensisijainen vasta-aineiden inkubaatio tehtiin 4 °C: ssa yön yli:anti-GFP (1: 100; Dako), anti-CD11b (1: 100; Millipore); Pesun jälkeen dioja inkuboitiin 1:250 laimennetulla fluoresoivalla konjugoidulla sekundaarisella vasta-aineella (Rhodamiini CD11b: lle, Alexa Fluor 488 GFP: lle) RT: llä 1 tunnin ajan ja asennettiin sitten Dapi: tä sisältävällä vectashield Antifade-liuoksella (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA). Makrofagivälitteinen fagosytoosi havaittiin Aksiovisio-ohjelmiston avulla tehdyllä fluoresoivalla mikroskopialla (Zeiss, Saksa) ja mikrofotografit kvantifioitiin ImageJ: n avulla.

tilastollinen analyysi

kaikki in vitro-solututkimuksista ja eläinkokeista saadut kokeelliset tiedot esitetään keskiarvona ± se, ja ne analysoidaan käyttäen Kaksihäntäisen opiskelijan t-testiä kahdelle ryhmälle tai ANOVA-testiä useille ryhmille. Kaplan–Meier–eloonjäämiskäyrien tilastollista merkitsevyyttä arvioitiin Mann-Whitney-testillä. Itsenäisten kokeiden määrä ja toistot merkittiin kuviolegendoihin. P-arvoja < 0, 05 pidettiin merkittävinä ja ne on merkitty tähdillä seuraavasti: *P < 0.05, * * P < 0, 01, ***p < 0, 001, ***p < 0, 0001.

raportointikooste

lisätietoja tutkimuksen suunnittelusta on tämän artikkelin yhteydessä olevassa Nature Research Reporting Summary-julkaisussa.