Introduction
Co-immunoprecipitation, lyhyesti sanottuna Co-IP, on laajalti käytetty menetelmä fysiologisesti merkittävien proteiinien ja proteiinien vuorovaikutusten tunnistamiseksi käyttämällä kohdeproteiinispesifisiä vasta-aineita tähän spesifiseen kohdeproteiiniin sitoutuneiden proteiinien epäsuoraan vangitsemiseen. IP: n jatkeena Co-IP voi kaapata ja puhdistaa ensisijaisen kohteen lisäksi myös muita makromolekyylejä, jotka sitoutuvat kohteeseen native interaktioilla. Ero IP: n ja co-IP: n välillä on kokeen painopiste. IP keskittyy ensisijaiseen kohteeseen, joka sitoo vasta-ainetta. Kun taas Co-IP kohdistuu sekundaarisiin kohteisiin, jotka vuorovaikuttavat primaaristen proteiinien kanssa vasta-aineen sijaan. Immunopresipitaation jälkeen helmiin jääneet proteiinit pestään ja eluoidaan puhdistettujen primaaristen ja sekundaaristen kohdeproteiinien saamiseksi. Näitä kohdeproteiineja voidaan luonnehtia erilaisilla menetelmillä, kuten Westernblotilla ja massaspektrianalyysillä shotgun-strategian mukaisesti, kumppaniproteiinitunnusten, sitoutumisaffiniteettien, sitoutumisen kinetiikan ja primaariproteiinin havaitsemattomien toimintojen tunnistamiseksi.
kriittiset tekijät Co-IP: stä:
tehokkaana tekniikkana biokemistit käyttävät Co-IP: tä säännöllisesti tutkiakseen proteiinin ja proteiinin välisiä vuorovaikutuksia. Vaikka Co-IP-menetelmä on suoraviivainen, fysiologisten proteiini-proteiini-vuorovaikutusten tunnistaminen Co-IP-reaktiolla ei ole helppoa, koska vuorovaikutus on epävakaata, epäspesifinen sitoutuminen IP-reagensseihin ja vasta-ainekontaminaatio. Kaikki edellä mainitut ongelmat voivat vaikuttaa negatiivisesti proteiini-proteiini-vuorovaikutusten havaitsemiseen.
proteiinikompleksien Ko-IP
koska ko-IP riippuu proteiinien ja proteiinien yhteisvaikutuksista sitoutuneiden proteiinien havaitsemiseksi, fysiologisten interaktioiden sitoutumisaffiniteetti ja stabiilisuus koko Ko-IP-prosessin aikana on erittäin tärkeää. Riittämätön sitoutumisaika ja laajat pesuvaiheet voivat heikentää sitoutumistehoa ja aiheuttaa proteiiniyhteyksien havaitsemisen epäonnistumisen. Tämän vuoksi proteiineille, joilla ennustetaan olevan viikon sitoutumisaffiniteetti tai dynaamisia interaktioita, proteiini-proteiini-interaktioiden ennakoiva stabilointi on välttämätöntä, esimerkiksi ristisidontaprosessit voidaan suorittaa ennen Co-IP: tä.
epäspesifiset yhteisvaikutukset
solukalvon ja organellien katkeaminen aiheuttavat sen, että suuri määrä rajan erottamia proteiineja pääsee kosketuksiin. Siksi on väistämätöntä, että voi esiintyä epäspesifisiä vuorovaikutuksia, toisin sanoen vääriä positiivisia vuorovaikutuksia, jotka häiritsevät tietojen analysointia. Tämä on erityisen yleistä valkuaisaineille, joilla on avautumattomia tai joustavia alueita, jotka ovat suhteellisen tahmeita ja sitoutumattomia muita proteiineja. Tapoja kokea tällaisia ongelmia voidaan preclearance lysate käyttäen ensisijainen vasta poistaa epäspesifisiä proteiineja, ja muuttamalla ionivahvuus puskurin vähentää epäspesifinen sitoutuminen.
Creative Proteomics voi tarjota mukautetun kokeellisen suunnittelun ja jalostaa Co-IP-parametreja asiakkaiden tarpeiden mukaan. Lupaamme luotettavan Co-IP-analyysin proteiinin ja proteiinin vuorovaikutuksesta kokeneiden tutkijoidemme ja teknikkojemme kanssa.
Co-IP-palvelun ominaisuudet:
- tutki proteiinien ja proteiinikompleksin välisiä vuorovaikutuksia
- seuraa proteiinien vuorovaikutuksen dynamiikkaa
- tutki proteiini-proteiini-vuorovaikutusta ei-denaturoivassa tilassa, joka on lähes fysiologinen
- kartoittaa proteiinien vuorovaikutusalueita
Co-IP-palvelumme sisältää:
- Kokeilusuunnitelma, joka perustuu projektin erityistarpeisiin: Puskurit, Helmet, vasta-aineet, jne.
- parametrien optimointi, kuten Sidonta-aika
- Solulyysi, IP, pesu & eluutio
- WesternBlot/ massaspektrometria, riippuen projektin tarpeista
- Data-analyysi & raportin toimittaminen
Tilausmenettely:
