Jos olisi riittävästi aikaa ja tärinätön ympäristö, voisi kärsivällisesti odottaa ja painovoima toisi useimmat suspendoituneet hiukkaset sentrifugiputken pohjalle. Pienimmät hiukkaset pysyisivät suspensiossa luultavasti Brownin liikkeen vuoksi, ja useimmat makromolekyylit jakautuisivat tasaisesti, koska ne olisivat liuoksessa eikä suspensiossa. En tiedä sinusta, mutta minulla ei ole tarvittavaa kärsivällisyyttä-luottaakseni pelkästään painovoimaan kiinteiden aineiden erottamisessa nesteistä. Sitä paitsi käytännön syistä saamasi pelletti häiriintyisi aivan liian helposti kiinteän aineen erottamiseksi tehokkaasti supernatantista. Painovoima ei olisi hirveän tehokas tapa erottaa riippuvia materiaaleja koon tai muiden ominaisuuksien perusteella.
kuvataan sentrifugointiolosuhteita
kun sentrifugointi suoritetaan materiaaleissa ja menetelmissä, on harvoin tarpeen ilmoittaa enemmän kuin sentrifugoinnin voima, aika ja lämpötila. Tarvittava nopeus (rpm) riippuu käytetystä sentrifugista ja roottorista, joka vaihtelee laboratoriosta toiseen. Sentrifugin merkki, roottorin tyyppi tai nopeus on siksi harvoin relevantti.
sentrifugointiprosessi
sentrifugointi tuottaa keskihakuvoiman, joka voi olla monta sataa tai tuhatta kertaa painovoima, mikä nopeuttaa prosessia huomattavasti. Mitä suurempi kierroslukumäärä minuutissa (RPM), sitä suurempi on painovoima. Sentrifugoinnin hyödyllisyys solujen fraktioinnissa olisi rajallinen, jos voisimme vain ajaa riippuvia hiukkasia putken pohjaan. Tutkijat pystyvät kuitenkin säätelemään alas tuotavien hiukkasten kokoa suspensiossa olevien hiukkasten fysiikan ansiosta.
pyöröhiukkasten suspensiossa, jonka tiheys on yhtä suuri mutta läpimitta erilainen, tietyn hiukkasen pohjaan ajava voima on yhtä suuri kuin sen massa kertaa kohdistettu kiihtyvyys. Hiukkasen tilavuus on sen säteen funktio, ja sen massa on yhtä suuri kuin sen tilavuus kertaa sen tiheyskerroin, joka on vakio. Pallon tilavuus on yhtä suuri kuin 4/3 kertaa pi (vakio) kertaa säteen kuutio. Tasatiheyksisten pallomaisten hiukkasten suspensiossa tietyissä olosuhteissa ainoa muuttuja, joka määrittää tiettyyn hiukkaseen kohdistuvan voiman, on sen säde.
liikevastus liuoksen läpi on verrannollinen siihen pinta-alan osaan, joka työntyy väliaineen läpi. Samanmuotoisille hiukkasille pienemmät hiukkaset kohtaavat vähemmän vastusta kuin suuremmat. Koska pallon pinta-ala on 4 kertaa pi kertaa säteen neliö ja 4 kertaa pi on vakio, niin koostumukseltaan samansuuruisille pallohiukkasille ainoa muuttuja, joka määrittää resistanssin määrätyissä olosuhteissa, on hiukkasen säde.
Käyttövoima kasvaa suhteessa säteen kuutioon. Liikkeen vastustus kasvaa suhteessa säteen neliöön. Ei ole vaikea nähdä, että kun hiukkasen säde kasvaa, myös sen taipumus lähestyä pohjaa kasvaa. Kun tähän lisätään vielä huomattava määrä ’vastusta’, Galileon johtamaksi väitetty painovoimakoe ei loppujen lopuksi toimi kovin hyvin. Koska suuret hiukkaset sedimentoituvat nopeammin kuin pienet hiukkaset, tutkija voi erottaa suuret pienistä organelleista, soluista jne. yksinkertaisesti säätelemällä sentrifugin ajonaikaa ja kierroslukua.
fraktiointi differentiaalisella sentrifugoinnilla
tyypilliselle soluhomogenaatille 10 min. spin alhaisella nopeudella (400-500 x g) tuottaa sakkaa, joka koostuu katkeamattomasta kudoksesta, kokonaisista soluista, solujen ytimistä ja suurista roskista. Pieninopeuksista pellettiä kutsutaan perinteisesti ydinpelletiksi. 10 min. spin kohtalaisen nopea nopeus, tuottaa voimia 10,000 – 20,000 x g tuo alas mitokondriot sekä lysosomit ja peroksisomit. Siksi toista pellettiä perinteisessä solujen fraktiointijärjestelmässä kutsutaan mitokondrio-pelletiksi.
solujen fraktioinnin jatkaminen differentiaalisella sentrifugoinnilla edellyttää ultracentrifugin käyttöä. Tällainen laite on suunniteltu pyörittämään roottoreita suurilla kulmanopeuksilla, jolloin saadaan aikaan erittäin suuria g-voimia. Ilma on pumpattava ulos kammiosta, jotta vältetään ilman kitkan aiheuttama lämmön kertyminen. Itse asiassa monia ultrasentrifugiin suunniteltuja roottoreita ei ole edes rakennettu aerodynaamisesti, koska ne kehrätään tyhjiössä. Yksi tunti nopea ultracentrifuge ajaa, joka tuottaa voimaa noin 80000 x g tuottaa mikrosomaalinen pelletti. Mikrosomeja ovat kalvon palaset, muun muassa solukalvo ja endoplasmainen verkkokalvo. Kalvonpalaset muodostavat vesitiiviissä väliaineessa häiriintyessään vesikkeleitä, joten tutkimus paljastaisi lukuisia erikokoisia kalvorakkuloita. Itse vesikkelit voidaan erottaa tiheyden perusteella vaihtelevan proteiinipitoisuuden vuoksi. Mutta se on toisen dokumentin aihe.
pyöräytä useita tunteja noin 150 000 x g: n painolla, ja voit kaataa ribosomeja ja jopa suurimman makromolekyyleistä. Jäljelle jäävä supernatantti koostuu sytoplasman liukoisista komponenteista, kuten suoloista, pienistä makromolekyyleistä ja prekursorimolekyyleistä sekä liuenneista kaasuista.