Diverse motif ensembles determinate non-redundant DNA binding activities of AP-1 family members in makrofags

Statistical analyses

in Fig. 1c, erot geenien ilmentymisessä testattiin riippumattomalla t-testillä (vapausaste = 1, kaksihäntäinen) kahdella toistokokeella (n = 2). Eri tavoin ilmaistut geenit viikuna. 1b tunnistettiin käyttämällä edger55: tä oletusparametreilla ja käyttämällä katkaisua FDR < 0.05 ja log2-kertainen muutos ≥2. Kuvassa. 2c, kunkin ryhmän välisiä eroja (Veh, jaettu ja KLA 1 h) tarkasteltiin riippumattomalla T-testillä (vapausaste = 1, kaksihäntäinen); lokusten lukumäärä kussakin ryhmässä kullekin monomeerille ovat seuraavat: ATF3 (Veh = 1447, Shared = 7460, KLA = 6997), Jun (2390, 3751, 3401), JunD (1351, 5976, 6422). Merkitys motiiveja Fig. 4a laskettiin käyttämällä todennäköisyystestiä (vapausaste = 1), jossa verrattiin ennusteita, jotka tehtiin täydellä TBA-mallilla ja häiriintyneellä TBA-mallilla kaikilla Loceilla, jotka on sidottu Veh-käsitellyillä makrofageilla atf3: lle (n = 23 160), Jun: lle (n = 15 548) ja JunD: lle (n = 19 653). Merkitys motiiveja täydentävä Kuva. 4C laskettiin todennäköisyystestillä (vapausaste = 1), jossa verrattiin ennusteita, jotka tehtiin täydellä TBA-mallilla ja häiriintyneellä TBA-mallilla kaikilla Lokuksilla, joita JunD sitoi gm12878: ssa (n = 7451), H1-hESC: ssä (n = 12,931), HepG2: ssa (n = 41,318), K562: ssa (n = 47,477) ja SK-N-SH: ssa (38,960). Merkitys motiiveja Fig. 5b, täydentävä Kuva. 5B, ja täydentävä Kuva. 5C laskettiin käyttämällä todennäköisyystestiä (vapausaste = 1), jossa verrattiin ennusteita, jotka tehtiin täydellä TBA-mallilla ja häiriintyneellä TBA-mallilla kaikilla LOKUKSILLA, jotka on sidottu KLA-käsiteltyihin makrofageihin atf3: lle (n = 36,745), Jun: lle (n = 17,481), JunD: lle (n = 31,641), Fos: lle (n = 24,365), Fosl2: lle (n = 10,619) ja JunB: lle (n = 13,376). Merkitsevyysarvot Fig. 6f ja S6F laskettiin F-testin avulla; ajoneuvolla käsiteltyjen makrofagien monomeereille analysoitujen lokusten määrä on ATF3 (n = 4163), Jun (n = 3004) ja JunD (n = 4148); KLA-käsiteltyjen makrofagien monomeereille analysoitujen lokusten määrä on: Atf3 (n = 4577), Jun (n = 3232), JunD (n = 4366), Fos (n = 4477) ja JunB (n = 3616).

muokatun genomin luominen BALB/cJ: lle

mukautetun genomin luominen BALB / cJ: lle korvaamalla mm10-genomin invariantit paikat alleeleilla, jotka on ilmoittanut Mouse Genomes Project (versio 3 VCF-tiedosto)43. C57bl/6J: n kohdalla käytettiin mm10-referenssigenomia UCSC-genomiselaimesta. BALB/CJ: n ja c57bl/6J: n välisen vertailun mahdollistamiseksi analyysin aikana balb/cJ: n mukautetun genomin koordinaatit siirrettiin vastaamaan mm10-referenssigenomin kantoja marge34: n avulla. Emme analysoineet mitään lukemia, jotka kuuluivat poistoihin BALB/cJ: ssä. Reads that limited with an insertion were assigned to the last Limited position in the referenssikanta.

Chip-seq-piikkien analyysi

Chip-seq-kokeista saadut Sekvensointilukemat kartoitettiin hiiren referenssigenomin (tai BALBc / J-mukautetun genomin) mm10-kokoonpanoon käyttäen Bowtie2: n uusinta versiota, jossa on oletusparametrit56. Kartoitettu siru-seq lukee tunnistamaan oletetut TF-sidontapaikat HOMER57 findPeaks-komennolla (parametreilla-koko 200-L 0-C 0-fdr 0.9), käyttäen hoitotilaa vastaavaa syöttösirukoetta. Vähentääksemme väärien positiivisten piikkien määrää laskimme IDR: n jokaisen huipun kohdalla (käyttäen versiota 2.0.Idr-ohjelman 3), jossa Homerin huippupisteet laskettiin kullekin toistokokeelle IDR: n tulona ja sitten suodatettiin kaikki huiput, joiden IDR oli ≥ 0, 0558. De novo-motiivit laskettiin HOMEROKSELLA findMotifsGenome.pl komento oletusparametreilla. Rikastus de novo motiiveja laskettiin käyttämällä findKnownMotifs.pl ohjelma Homerissa oletusparametreilla.

RNA-seq-kokeista saatujen RNA-ekspression lukemien kvantifiointi linjattiin hiiren mm10-referenssigenomin (tai BALBc / J-mukautetun genomin) mukaiseksi käyttäen STAR aligneria oletusparametereillä59. Kvantifioidaksemme kunkin geenin ekspressiotason laskimme RPKM: n eksonin sisällä olevilla lukemilla. Normalisoimattomia sekvensointilukuja käytettiin tunnistamaan eri tavoin ilmentyviä geenejä EdgeR55: llä; pidimme geenejä, joiden FDR < 0, 05 ja kahden kokeellisen olotilan välistä ekspression muutosta kaksi kertaa tai enemmän erilaisina ilmaistuna. Kvantifioida ilmentymä orastava RNAs me annotated meidän ChIP-seq huiput määrä GRO-seq lukee (normalisoitu 10 miljoonaa), jotka olivat 500 bps huippu keskus käyttäen HOMER annotatePeaks.pl komento.

TBA-mallikoulutus

jokaiselle AP-1-monomeerille jokaisessa hoitotilanteessa koulutimme mallin, joka erotti jokaisen monomeerin sitoutumispaikat joukosta satunnaisesti valittuja genomisia lokuksia. Kunkin mallin kouluttamiseen käytetty satunnaisten taustalokusten joukko valittiin seuraavien kriteerien mukaan: (1) taustalokusten SISÄLTÖJAKAUMA vastaa tietyn monomeerin SIDONTAPAIKKOJEN SISÄLTÖJAKAUMAA, (2) ei sisällä epäselviä tai soveltumattomia kantoja ja (3) taustasekvenssien määrä vastaa sidontapaikkojen k määrää. Kunkin sekvenssien yhdistetyn joukon sitovia sivustoja ja tausta loci, laskimme korkein log-kertoimet pisteet (kutsutaan myös motif pisteet) kunkin n motiiveja, jotka sisällytetään model60 Motif ottelut molemmissa suuntauksissa pidettiin. Log-kertoimet pisteet alle 0 asetettiin 0. Per standardi esikäsittely menettelyjä ennen koulutusta lineaarinen malli, me standardoitu log-kertoimet pisteet kunkin motiivi, skaalaamalla joukon pisteet kunkin motiivi niin, että keskiarvo on 0, ja varianssi on 1. Standardointi skaalaa kaikkien kuvioiden pisteet samalle alueelle (pidemmillä kuvioilla on suurempi maksimipistemäärä) ja auttaa myös vähentämään multi-collineaarisuuden vaikutusta malliharjoitteluun. Ja niin, ominaisuuksia käytetään koulutukseen mallimme on n 2K matriisi log-kertoimet tulokset standardoitu jokaisella rivillä. Luoda vastaava joukko tarroja, osoitimme kunkin sitovan sivuston etiketti 1 ja kunkin taustan lokuksen etiketti 0. Käyttämällä tätä ominaisuutta matriisi, ja etiketti array, koulutimme painot kunkin motiivi käyttäen L1 rangaistava logistinen regressiomalli toteuttama scikit-learn Python package61. Analyysissämme esitetyt Motif-painot ovat keskiarvoja viiden ristivalidointikierroksen ajalta, käyttäen 80% tiedoista koulutukseen ja 20% testaukseen jokaisella kierroksella. Malleja koulutettiin tässä tutkimuksessa syntyneisiin Sirusekvensseihin sekä NCBI: n Geeniekspressiosta Omnibus (liittymisnumero GSE46494) ja KOODIDATAPORTAALISTA (https://www.encodeproject.org) ladattuun dataan.

monikollineaarisuuden kvantifiointi

arvioidaksemme monikollineaarisuuden laajuutta Motifin pisteominaisuuksissa, joita käytimme malliemme kouluttamiseen, otimme jokaisen koetta vastaavan ominaisuusmatriisin ja laskimme Vif: n jokaiselle motif38: lle. VIF: n laskemiseksi määritämme ensin kullekin motiiville determinaatiokertoimen R2 palauttamalla yhden motiivin log-odds-pisteet jäljelle jääneiden motiivien log-odds-pisteisiin. Seuraavaksi määrityskertoimen avulla kunkin aiheen toleranssi voidaan laskea 1: n ja määrityskertoimen (1 − R2) välisenä erotuksena. Vif on toleranssin käänteisarvo \(\frac{1}{{1-R^2}}\). Käytimme linear_model-moduulia sklearn Python-paketista määrityskertoimen laskemiseen.

Motifin ryhmittely ja yhdistäminen

pisteytimme kaikkien DNA-sekvenssimotiivien parien samankaltaisuuden laskemalla tiettyä motifs62-paria vastaavien kohdistettujen positiotodennäköisyysmatriisien (PPMs) Pearsonin korrelaation. Pearsonin korrelaatio pituuden I kuvaparille A ja B lasketaan kaavalla:

ppm: t kohdistettiin ensimmäisen kerran Smith–Waterman-yhdenmukaistamisalgoritmilla 63. Lyhyemmät kuviot pehmustetaan taustataajuusarvoilla ennen linjausta. Aukot kohdistuksessa eivät olleet sallittuja, ja jokainen asento kohdistuksessa pisteytettiin Pearsonin korrelaatiolla. Tämän jälkeen Pearsonin korrelaatio laskettiin optimaalisella linjauksella. Seuraavaksi joukko kuvioita, jotka ovat PPMs kanssa Pearson korrelaatio on 0,9 tai suurempi yhdistettiin iteratiivisesti yhdenmukaistaa kunkin PPM sisällä joukko, ja sitten keskimäärin nukleotidin taajuudet kussakin asennossa.

arvioitaessa kuvioiden merkitystä TBA: lle

p-arvot TBA: lle laskettiin log-todennäköisyys-suhdetestillä. Jokainen motiivi poistettiin piirteistä, joita käytettiin häiriintyneen TBA-mallin kouluttamiseen (käyttäen viisinkertaista ristivalvontaa). Sitten käytimme koko malli (sisältää kaikki kuviot) ja häiriintynyt malli laskea todennäköisyys havainnoida sitoo kaikki sitova sivustoja ja tausta sekvenssit tietyn monomeeri ja kaikki tausta-alueet. Kokomallilla ja perturbed-mallilla laskettujen likiarvojen erotusta käytettiin sitten khiin potenssitestin suorittamiseen kullekin kuviolle. Chi-squared testi suoritettiin käyttäen scipy python package64.

vertailu muihin menetelmiin

BaMM motif ja gkm-SVM ajettiin molemmissa oletusparametreilla. Käytimme laajemman mittakaavan uusinta versiota gkm-SVM, LS-GKM (koottu lähdekoodista ladattuna https://github.com/Dongwon-Lee/lsgkm 8/25/16), ja BaMM motif; v1.0 ladattuna https://github.com/soedinglab/BaMMmotif39,65. Molemmat mallit koulutettiin viisinkertaisella ristivalvonnalla. Mallin suorituskyky pisteytettiin sklearnin mittausmoduulin roc_auc_score-ja precision_score-funktioilla.

Ennustaaksemme muutoksia AP-1-sidonnassa yhden tunnin KLA-hoidon jälkeen

ennustaaksemme sitoutumisen muutoksen KLA-hoidon jälkeen hyödynsimme kullekin n-kuviolle (wn) opittuja motiivipainoja TBA-mallilla, joka on koulutettu ajoneuvolla käsiteltyihin tietoihin (Wveh=), ja TBA-mallilla, joka on koulutettu 1-h KLA-käsiteltyihin tietoihin (Wkla = ) kunkin AP-1-monomeerin osalta. Kunkin sekvenssin ennustettu muutos sidonnassa on tällöin k−sitomispaikan (Sk = ) jaksolle laskettujen standardoitujen motif − pisteiden pistetulon ja motif-pisteiden pistetulon ja Veh-motif-painojen (Δkla-veh,k = wkla⋅SK-Wveh⋅SK) välinen erotus. Ennusteita tehtiin kaikille genomisille lokuksille, jotka leikkasivat yhden AP-1-monomeerin piikin kanssa joko ajoneuvon tai KLA: n hoitotilassa.

Kantakohtaisen sitoutumisen ennustaminen TBA: lla

kantakohtaisen sitoutumisen ennustamiseksi käytimme TBA-mallia (W=) jokaiselle AP-1-monomeerille käyttäen c57bl/6J-tietoja, ja motif-pisteet laskettiin jokaiselle k-sidospaikalle käyttäen genomisarjaa c57bl/6j ja BALBc/J (SC57, k=, SBAL , k=). Seuraavaksi laskimme c57bl6/J: n ja BALBc/J: N (DN = ) motif-pisteiden erot ja standardoimme sitten kaikkien K-sidontapaikkojen pisteerot, joilla oli mutaatio verrattaessa BALBc/J: tä c57bl/6J: hen, jolloin saatiin standardoidut motif-pisteerot jokaiselle sidontapaikalle (Zn = standardize(Dn) = ). Lopuksi teimme ennusteen kantakohtaisesta sidonnasta laskemalla motif-painojen pistetulon ja c57bl6/EiJ: n ja BALBc/J: n motif−pisteiden standardoidun eron kth: n mutatoituneelle sidontapaikalle (ΔC57-BAL = W⋅).

TBA-2strain-mallikoulutus

jokaiselle genomiselle lokukselle, joka leikkasi yhden AP-1-monomeerin huipun joko c57bl/6J: ssä tai BALBc / J: ssä, laskimme korkeimman log-kertoimen jokaiselle malliin sisällytettävälle n-kuviolle käyttäen molempien kantojen genomisarjaa, jolloin saatiin kaksi motif-pistesarjaa kullekin K: n sidontapaikalle (SC57, k=, SBAL , k = ). Molemmissa suunnistuksissa katsottiin matseja. Log-kertoimet pisteet alle 0 asetettiin 0. Motif-pisteiden avulla laskemme motif-pisteiden standardoidun eron näiden kahden kannan välillä edellä kuvatulla tavalla (Zn = ). Ja niin, ominaisuuksia käytetään koulutukseen mallimme on n k matriisi log-kertoimet tulokset standardoitu jokaisella rivillä. Seuraavaksi laskimme log2 kertainen suhde määrä siru-seq lukee c57bl / 6J verrattuna BALBc / J edustaa laajuutta kanta-spesifinen sitoutuminen. Käyttämällä tätä ominaisuusmatriisia ja asettamalla log2-kertainen sidontasuhde näiden kahden kannan välillä riippuvaiseksi muuttujaksi koulutimme painot kullekin kuviolle käyttäen lineaarista regressiota, kuten scikit-learn Python-paketti on toteuttanut. Analyysissämme esitetyt Motif-painot ovat keskiarvoja viiden ristivalidointikierroksen ajalta, käyttäen 80% tiedoista koulutukseen ja 20% testaukseen jokaisella kierroksella. Kantakohtaisen sitoutumisen ennustaminen voidaan tehdä käyttämällä laskettuja painoja edellisen jakson menettelyn mukaisesti.

ChIP protocol

proteiini A ja G Dynabeads 50/50 sekoitus Invitrogen haastetaan siru (10001d, 10003d). IP-seos koostuu 20 µL helmistä / 2 µg vasta-aineesta 2 miljoonaa solusirua kohti. AP-1-perheenjäsenten vasta-aineet valittiin kohdistettavaksi ei-spesifisen sitoutumisen mahdollisuuden minimoimiseksi. Vasta-aineet on lueteltu täydentävässä taulukossa 3. Valmistusta varten helmiä pestiin 2× 0, 5% BSA–PBS: llä, minkä jälkeen helmiä–vasta–aineita inkuboitiin 0, 5% BSA-PBS: llä vähintään 1 tunnin ajan rotaattorilla (4 °c). Pese 2× 0: lla.5% BSA–PBS: ää, minkä jälkeen se sekoitetaan uudelleen laimennuspuskuriin (1% Tritonia, 2 mM EDTA, 150 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl (pH 7, 4), 1× Proteaasinestäjät). Kaksoisristikytkentä sirulle: Media dekantoitiin soluista 10 cm: n levyillä, pestään kerran lyhyesti PBS: llä (RT). Disukkinimidyyliglutaraattia (Pierce Cat # 20593) (laimennettuna DMSO: lla 200 mM: n kohdalla) / PBS: ää (RT) käytettiin 10 minuutin ajan. Tämän jälkeen formaldehydiä lisättiin 1%: n lopulliseen pitoisuuteen vielä 10 minuutin ajan. Reaktio sammutettiin 1: 10 1 M Tris pH 7.4 jäällä. Solut kerättiin ja pestiin kahdesti kylmällä PBS: llä, pyörimällä 1000 × g: n lämpötilassa 5 minuutin ajan. Tumien eristäminen ja sonikointi: Solupelletit suspendoidaan uudelleen 1 mL: aan tumien eristyspuskuria (50 mM Tris–pH 8,0, 60 mM KCl, 0,5% NP40) + PI: iin ja inkuboidaan jäällä 10 min. Sentrifugoidaan 2000 × g 3 minuutin ajan 4 °C: ssa.suspendoidaan ytimet uudelleen 200 µL: aan tuoretta hajoamispuskuria (0, 5% SDS, 10 mm EDTA, 0, 5 mM EGTA, 50 mM Tris–HCl (pH 8)) + PI. Sonikointi: tumat sonikoitiin (10 miljoonaa solua) 25 minuutin ajan Biorupterissa (settings = 30 s = On, 30 s = Off, Medium) käyttäen ohutseinäisiä putkia (Diagenode Cat# C30010010). Kun sonication spin maksiminopeus 10 min 4 °C: ssa. siru asetettu: Sonikoitu DNA laimennettiin 5× 800 Laimennuspuskurilla (1% Tritonia, 2 mM EDTA, 150 mM NaCl, 20 mM Tris–HCl (pH 7, 4), 1× proteaasinestäjät). Näytteenottoa varten poistetaan määräosa (5%). Näytteet otetaan 4 °C: ssa pyörimisen aikana. Pesu: siru pestään 1× TSE I: llä (20 mM Tris–HCl pH 7,4, 150 mM NaCl, 0,1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA), 2× TSE III: lla (10 mM Tris–HCl pH 7,4, 250 mM LiCl, 1% IGEPAL, 1% deoksikolaatti, 1 mM EDTA), 1× TE + 0,1% Triton X-100, siirretään uuteen putkeen ja sitten pese toinen kerta te + 0,1% Triton X-100: lla. Elution: Eluoidaan 200 µL: n eluutiopuskurilla (1% SDS, 10 mM Tris pH 7.5) 20 minuutin ajan RT: ssä ravistamalla pyörrettä tai nutaattoria tai rotaattoria. Ristisitoutuminen: lisätään 10 µL 5 M NaCl: ää ja inkuboidaan 65 °C: ssa (tai vähintään 8 h: ssa). Siivoa näytteet Zymo-sirun DNA: lla puhtaaksi ja keskittimellä. Eluoituu 100 µL: ssa. Ota 40 µL ja siirry kirjaston valmisteluprotokollaan.

PolyA-RNA: n eristäminen ja pirstoutuminen

RNA: n eristäminen: RNA eristettiin TRIZOLIREAGENSSILLA (Ambion cat# 15596018) ja SUORASELKÄISELLÄ RNA mini-prep kitillä (cat# 11-330mb). Poly-a RNA: n eristäminen: käytä 0.2 total RNA lähtöaineena ihanteellinen kartoitus tehokkuutta ja minimaalinen klonaalisuus. Kerätään 10 µL oligo (DT) (NEB cat# s1419s) – helmiä RNA-näytettä kohti. Helmet pestiin kahdesti 1× DTBB: llä (20 mM Tris–HCl pH 7,5, 1 M LiCl, 2 mM EDTA, 1% LDS, 0,1% Triton X-100). Helmet suspendoitiin uudelleen 50 µL: aan 2× DTBB: tä. 50 µL helmiä sekoitettiin 50 µL RNA: han ja kuumennettiin 65 °C: n lämpötilaan 2 min. RNA-helmiä inkuboitiin sitten 10 min RT: llä pyörimisen aikana. Tämän jälkeen RNA–Helmet kerättiin magneettiin ja pestiin 1× kukin RNA WB1: llä (10 mM Tris-HCl pH 7,5, 0,12 M LiCl, 1 mM EDTA, 0,1% LDS, 0.1% Triton X-100) ja WB3 (10 mM Tris–HCl pH 7, 5, 0, 5 m LiCl, 1 mM EDTA). Lisätään 50 µL Tris-HCl pH 7.5 ja kuumennetaan 80 °C: seen 2 minuutin ajan eluoitumiseen. Kerää RNA ja suorittaa toinen Oligo-dT helmi kokoelma. Toisen kokoelman pesun jälkeen elutoinnin sijaan oli 1× 1× ensimmäinen nauhapuskuri; 250 mM Tris-HCl (pH 8.3), 375 mM KCl, 15 mM MgCL2 (Lämpökalastaja SSIII kit Cat# 18080093). Sirpaloituminen: lisätään sitten 10 µL 2× ensimmäisen juosteen puskuria sekä 10 mM: n DTT ja DNA: n fragmentti 94 °C: n lämpötilassa 9 minuutin ajan. Kerää Helmet magneettiin ja siirrä sirpaloitunutta mRNA: ta sisältävä eluaatti uuteen PCR-nauhaan. Pitäisi palauttaa 10 µL pirstaloitunutta RNA: ta. Ensimmäinen juostesynteesi: sekoitimme sirpaloitunutta RNA: ta 0,5 µL: n random primer (3 µg/µL) Life Tech #48190-011: een, 0,5 µL oligo-dT: hen (50 µM ssiii kit: stä), 1 µL Dntps: ää (10 mM Life Tech, cat 18427088) ja 0,5 µL Superaasi-In: ää (ThermoFisher Cat#AM2696) ja lämmitämme 50 °C: ssa 1 min. Laita heti jäihin. Tämän jälkeen lisättiin 5,8 µL ddH2O: ta, 0,1 µL aktinomysiiniä (2 µg/µL Sigma cat#A1410), 1 µL DTT: tä (100 mM Life Tech cat# P2325), 0,2 µL 1% Tween: ia ja 0,5 µL Yläindeksiä III ja inkuboidaan 25 °C: ssa 10 min, sitten 50 °C: ssa 50 min. Helmi puhdistaa: Lisäsimme 36 µL rnaclean XP: tä (Ampure XP) ja sekoitimme, inkuboimme 15 min jäällä. Helmet kerättiin magneettiin ja pestiin 2× 75-prosenttisella etanolilla. Helmiä ilmakuivattiin 10 minuutin ajan ja eluoitiin 10 µL nukleaasittomalla H2O: lla. toinen juostesynteesi. 10 µL cDNA/RNA: ta sekoitettiin 1, 5 µL: n 10× sinisen puskurin (entsymaattinen kissa# B0110L), 1 µL dutp/dNTP-seoksen (10 mM Affymetrix kissa# 77330), 0, 1 µL dutp: n (100 mM Affymetrix kissa# 77206), 0, 2 µL RNaasi H: N (5 U/µL entsymaattinen kissa# Y9220L), 1 µL DNA-polymeraasi I: n (10 U/µl entsymaattiset Cat#P7050L), 0, 15 µl 1% Tween-20 ja 1.05 µL nukleaasitonta vettä. Reaktiota inkuboitiin 16 °C: ssa 2,5 tunnin ajan. Helmipuhdistus: DNA puhdistettiin lisäämällä 1 µL Seradyn 3 EDAC SpeedBeads (Thermo 6515-2105-050250) reaktiota kohti 28 µL 20% PEG8000/2,5 M NaCl (13% lopullinen pitoisuus) ja inkuboimalla RT: ssä 10 min. Helmet kerättiin magneettiin ja pestiin 2× 80-prosenttisella etanolilla. Helmiä ilmakuivattiin 10 minuutin ajan ja eluoitiin 40 µL nukleaasittomassa vedessä. DNA on valmis kirjastoon.

kirjaston prep-protokolla

dsDNA: n loppukorjaus: sekoitimme 40 µL DNA: ta siru-tai RNA-protokollista 2,9 µL: aan H2O, 0: ta.5 µL 1% Tween-20, 5 µL 10× T4-ligaasipuskuri (Entsymaatikot cat# L6030-HC-L), 1 µL dntp-seos (10 mM Affymetrix 77119), 0, 3 µL T4 DNA pol (Entsymaatikot P7080L), 0, 3 µL T4 PNK (Entsymaatikot Y9040L), 0, 06 µL Klenow (Entsymaatikot P7060L) ja inkuboitu 30 minuutin ajan 20 °C: ssa lisättiin 1 µl seradyn 3 EDAC-nopeuslevyä (Thermo 6515-2105-050250) 93 µl: ssa 20% Peg8000/2, 5 m NaCl (13% lopullinen) ja inkuboitiin 10 min. Helmenpuhdistus: Helmet kerättiin magneettiin ja pestiin 2× 80% etanolilla. Helmiä ilmakuivattiin 10 min ja eluoitiin sitten 15 µL ddH2O. dA-Tailing. DNA sekoittui 10.8 µL ddH2O, 0, 3 µL 1% Tween-20, 3 µL sinistä puskuria (entsymaattiset cat# B0110L), 0, 6 µL dATP (10 mM Tech 10216-018), 0, 3 µL Klenow 3-5 Exo (entsymaattiset P7010-LC-L) ja inkuboidaan 30 min 37 °C: ssa.55, 8 µL 20% PEG8000/2, 5 M NaCl (13% lopullinen) lisättiin inkuboitu 10 min. Sitten tehtiin helmien puhdistus. Helmet eluoitiin 14 µL: ssa. Y-muotoinen adapteri ligaatio. Näytteeseen sekoitettiin 0,5 µL BIOO-viivakoodisovitinta (BIOO Scientific cat# 514104), 15 µL Rapid Ligation Bufferia (Enzymatics cat@ L603-LC-L), 0,33 µL 1% Tween-20 ja 0.5 µL T4-DNA-ligaasi HC (Entsymaatiikka L6030-HC-L) ja inkuboitiin 15 minuutin ajan RT: ssä. 7 µL 20% PEG8000/2,5 M NaCl lisättiin ja inkuboitiin 10 min RT: ssä. helmien puhdistus suoritettiin ja helmet eluoitiin 21 µL: ssa. 10 µL: aa käytettiin sitten PCR-vahvistukseen (14 sykliä) IGA-ja IGB-alukkeilla (AATGATACGGCACCGA, CAAGCAGAAGGGCATACGA).

GRO-seq

orastava transkriptio kuvattiin global nuclear run-on sequencing (GRO-seq) – menetelmällä. Tumakkeet eristettiin TGEMs: stä hypotonisen lyysin avulla (10 mM Tris–HCl (pH 7,5), 2 mM MgCl2, 3 mM CaCl2; 0.1% IGEPAL CA-630) ja flash jäätyneenä GRO-jäätymispuskurissa (50 mM Tris–HCl (pH 7, 8), 5 mM MgCL2, 40% glyserolia). Juostaan. 3-5 × 106 BMDM-ydintä käytettiin BrUTP-merkityillä NTP: llä, jossa oli 3× nro–puskuria (15 mM Tris-Cl (pH 8, 0), 7, 5 mM MgCl2, 1, 5 mM DTT, 450 mM KCl, 0, 3 U/µL Superaasia, 1, 5% Sarkosyyliä, 366 µM ATP: tä, GTP (Roche), Br-UTP (Sigma 40 Aldrich) ja 1, 2 µM CTP: tä (Roche, to rajoita ajonpituus ~40 NUKLEOTIDIIN)). Reaktiot lopetettiin 5 minuutin kuluttua lisäämällä 500 µL Trizol LS-reagenssia (Invitrogeeni), jota vorteksoitiin 5 minuutin ajan ja RNA erotettiin ja saostettiin valmistajan ohjeiden mukaisesti. RNA-pelletit suspendoitiin uudelleen 18 µL ddH2O + 0, 05%: iin (dH2O + T) ja 2 µL: n fragmentaatioseokseen (100 mMZnCL2, 10 mM Tris–HCl (pH 7, 5)), minkä jälkeen niitä inkuboitiin 70 °C: ssa 15 minuutin ajan. Pirstoutuminen lopetettiin lisäämällä 2, 5 µL 100 mM EDTA: ta. Brdu rikastus. Brdu-rikastuksessa käytettiin BrdU-vasta-ainetta (IIB5) ja AC-helmiä (Santa Cruz, SC-32323 AC, erä #A0215 ja #C1716). Helmet pestiin kerran GRO-sidontapuskurilla (0,25× suolaliuos-natrium-fosfaatti-EDTA-puskuri (SSPE), 0,05% (vol/vol) Tween, 37,5 mM NaCl, 1 mM EDTA) + 300 mM NaCl, minkä jälkeen kolme pesua Gro-sidontapuskurissa ja suspendoitiin uudelleen 25-prosenttiseksi (vol/vol) lietteeksi, jossa oli 0,1 U/µL Superaasia. Fragmentoituneeseen RNA: han lisättiin 50 µL kylmää GRO: ta sitovaa puskuria ja 40 µL tasapainotettuja BrdU-vasta-ainehelmiä, ja näytteitä pyöritettiin hitaasti 4 °C: ssa 80 minuutin ajan. Helmet kehrättiin 1000 × g: n tarkkuudella 15 s: n ajan, supernatantti poistettiin ja helmet siirrettiin Millipore Ultrafree MC-kolonniin (UFC30HVNB; Millipore) 2 × 200 µL GRO: ta sitovana puskurina. IP-reaktio pestiin kahdesti 400 µL GRO: ta sitovalla puskurilla, ennen kuin RNA eluoitiin inkuboimalla 200 µL Trizol LS: ssä (Lämpökalastaja) varovasti sekoittaen 3 minuutin ajan. Eluointi toistettiin toisen kerran, jolloin 120 µL dH2O + T: tä lisättiin supernatantin lisäämiseksi ja uutettiin valmistajan kuvaamalla tavalla. Päätykorjaus ja katkaisu: päätykorjausta ja katkaisua varten RNA-pelletit liuotettiin 8 µL TET: iin (10 mM Tris–HCl (pH 7,5), 1 mM EDTA, 0,05% Tween 20) voimakkaalla pyörteellä, kuumennettiin 70 °C: n lämpötilaan 2 minuutiksi ja laitettiin jäihin. Nopean linkouksen jälkeen lisättiin 22 µL Korjausmestariseosta (3 µL 10× pnk-puskuri, 15,5 µL dH2O + T, 0,5 µL Superaasi-in RNaasi-inhibiittori (10 U), 2 µL PNK (20 U), 1 µL RppH (5 U)), sekoitettiin ja inkuboitiin 37 °C: ssa 1 tunnin ajan. tämän jälkeen 5 ’ Endin fosforyloimiseksi lisättiin 0,5 µL 100 mM ATP: tä ja reaktioita inkuboitiin vielä 45 min 37 °C (korkea ATP-pitoisuus sammuttaa rpph-aktiivisuuden). Loppukorjauksen jälkeen lisättiin 2,5 µL 50 mM EDTA, reaktiot sekoitettiin ja sen jälkeen kuumennettiin 70 °C: seen 2 minuutin ajan ennen kuin se laitettiin jäihin. Toinen brdu-rikastus tehtiin edellä kuvatulla tavalla. RNA-pelletit liuotettiin 2,75 µL Tet + 0,25 µL Illumina TruSeq 3 ’ adapteriin (10 µM), kuumennettiin 2 minuutin ajan 70 °C: n lämpötilaan ja laitettiin jäälle. 7 3 ’ master mixiä (4,75 µL 50% PEG8000, 1 µL 10× T4-RNA-ligaasipuskuria, 0,25 µL Superaasia, 1 µL T4-RNA-ligaasi 2 typistettyä (200 U; NEB)) lisättiin, sekoitettiin hyvin ja reaktioita inkuboitiin 20 °C: ssa 1 tunnin ajan. reaktioita laimennettiin lisäämällä 10 µL TET + 2 µL 50 mM EDTA: ta, kuumennettiin 70 °C: seen 2 minuutin ajan, laitettiin jäälle ja kolmas kierros brutp-rikastus suoritettiin. RNA-pelletit siirrettiin PCR-nauhoihin 75-prosenttisen etanolipesun aikana ja kuivattiin. Näytteet liuotettiin 4 µL TET (10 mM Tris–HCl (pH 7, 5), 0, 1 mM EDTA, 0, 05% Tween 20) + 1 µL 10 µM reverse transkription (RT) alukkeeseen. Rtprimerin hehkuttamiseksi seosta inkuboitiin 75 °C: ssa 5 min, 37 °C: ssa 15 min ja 25 °C: ssa 10 min. 5’ Illumina TruSeq-adapterin ligoimiseksi, 10 µL 5 ’Master mix (1, 5 µL dH2O + 0, 2% Tween 20, 0, 25 µL denaturoitua 5’ Truseq-adapteria (10 µM), 1, 5 µL 10× T4-RNA-ligaasipuskuria, 0, 25 µL Superaasia, 0, 2 µL 10 mM ATP: tä, 5, 8 µL 50% PEG8000, 0, 5 µL T4-RNA-ligaasia 1 (5U; Neb)) lisättiin ja reaktioita inkuboitiin 25 °C: ssa 1 tunnin ajan. Käänteistranskriptio suoritettiin käyttäen Protoscript II: ta (NEB) (4 µL 5× Neb FirstStrand-puskuria (NEB; E7421AA), 0, 25 µL Superaasi-Iniä, 0, 75 µL Protoscript II: ta (150U; NEB)) 50 °C: ssa 1 tunnin ajan. 30 µL: n PCR-master mix (25 µL 2× LongAmp Taq 2× Master Mix (NEB), 0, 2 µL 100 µM forward primer, 2, 8 µl 5 m betaiinia ja 2 µl 10 µm yksittäistä viivakoodialustaa), seoksia monistettiin (95 °C 3 min, (95 °C 60 S, 62 °C 30 s, 72 °C 15 s) X13, 72 °C 3 min). PCR-reaktiot puhdistettiin käyttämällä 1, 5 volyymia SpeedBeads (GE Healthcare) – valmistetta 2, 5 M NaCl: ssä/20% PEG8000: ssa. Kirjastojen kooksi valittiin PAGE / TBE-geeleillä 160-225 emäsparia. Geeliviipaleet silputtiin pyöräyttämällä läpi 0, 5 mL: n rei ’ itetty PCR-putki, joka asetettiin 1, 5 mL: n putken päälle. Lisätään 150 µL geeliä EB (0, 1% LDS, 1 M LiCl, 10 mM Tris–HCl (pH 7, 8)), ja lietettä inkuboidaan ravistettuna yön yli. Elutoidun DNA: n puhdistamiseksi 1, 5 mL: n putkeen lisättiin 700 µL Zymogen-sirun DNA: ta sitovaa puskuria, joka sisälsi silputun geeliviipaleen ja EB: n, sekoitettiin pipetoimalla ja liete siirrettiin ZymoMiniElute-kolonniin. Näytteitä kehrättiin ensin 1000 × g 3 minuutin ajan, sitten 10 000×g 30 sekunnin ajan. Läpivirtaus poistettiin ja näytteet pestiin 200 µl Zymo Washbufferilla (EtOH: lla). Geelijäännökset poistettiin sipaisemalla ja pylväät pestiin lisäämällä toinen 200 µL Zymo-pesuaine (etoh: n kanssa). Läpivirtaus poistettiin, kolonnit kehrättiin kuiviksi sentrifugoimalla 14 000 × g 1 minuutin ajan ja DNA eluoitiin lisäämällä 20 µL esilämmitettyä sekvensointia Tet (10 mm Tris-HCl (pH 8,0), 0,1 mM EDTA, 0,05% Tween 20). Kirjastot jaksotettiin.

Western blotting

solut lysoitiin Igepaalilyysipuskurilla (50 mM Tris pH 8, 0, 150 mM NaCl, 0.5% Igepal) ja proteiinipitoisuudet määritettiin Bioradiproteiinimääritysreagenssilla käyttäen standardina BSA: ta. Proteiinit erotettiin NuPage 4-12% bis-Tris gradienttigeeleillä (Invitrogen) ja siirrettiin nitroselluloosakalvolle (Amersham). Kalvot tukkeutuivat TBS: ssä 0, 1% Tween-20: llä ja 5% BSA: lla. Kalvot blottattiin merkityllä primaarilla yön yli 4 °C: ssa.Piparjuuriperoksidaasikonjugoituneet sekundaariset vasta-aineet havaittiin käyttämällä ECL plus western blotting detection system-järjestelmää (Amersham).

eläimet ja soluviljelmä

Tgem-solut kerättiin 3 päivän kuluttua injektiosta 8 viikon c57bl/6j–uroshiiriltä tai BALB / cJ-hiiriltä, ja ne pinnoitettiin 20 × 106 solua 15 cm: n petrimaljaa kohti dmem: ssä ja 10%: ssa FBS: ää ja 1× penisilliini-streptomysiiniä. Päivän kuluttua pinnoituksesta soluja täydennettiin tuoreilla väliaineilla ja käsiteltiin PBS: llä (Veh) tai 100 ng/mL KLA: lla 1 tunnin ajan, minkä jälkeen niitä käytettiin suoraan jatkotutkimuksiin. iBMDM: t tuotetaan BMDM: n infektion kautta retroviruksella, joka sisältää myc: tä ja Braf V600E66: ta. Tämän jälkeen ikuistetut solut kasvavat ulos useiden viikkojen aikana. Kaikki eläinkokeet tehtiin Kalifornian yliopiston, San Diegon Institutional Annual Care and Use Committeen (Iucac) asettamien eettisten standardien mukaisesti.

Lentivirus production

pLentiguide muutettiin siten, että se sisälsi U6-bsmbi-spgRNA-telineen ja CMV-promoottorin, joka ajoi tagBFP2: ta. Jokaiseen kohteeseen lisättiin 2 CRISPR-ohjainta PCR-vahvistuksella H1-promoottorilla (bsmbi site/guide1/scaffold/H1 promoter/guide 2/bsmb1 site) yhteensä 2 ohjainta virusta kohti (U6-ja H1-ohjatut) (täydentävä Taulukko 4). Virus tehtiin pVSVg / ppAX2-järjestelmällä. Kaksi päivää verensiirron jälkeen kerättiin elatusaineita ja sentrifugoitiin 4 °C: ssa 2 tunnin ajan 20 000 × g: n lämpötilassa. solupelletti ennallistettiin yön yli 4 °C: ssa OPTI-MEM: ssä ja säilytettiin -80 °C: ssa.

CRISPR KO iBMDMs: n

ko iBMDMs: n tuotanto saatiin lentivirusinfektion avulla. iBMDM-CAS9-IRES-EGFP: llä oli MOI 100-tartunta 293T-soluista mitattuna Linssiblastilla (oz biosciences) (5 µL kutakin reagenssia) OPTI-MEM: ssä. Tämän jälkeen sitä sentrifugoitiin 1300 grammassa 1 tunnin ajan huoneenlämmössä. Tämän jälkeen poistettiin elatusaineet ja soluja täydennettiin luuytimen elatusaineissa (30% L-solua, 20% FBS: ää, 1% penisilliiniä/streptomysiiniä dmem: ssä) 2 päivän ajan. Solut lajiteltiin sitten infektiota varten ilmentämällä transgeeni virussekvenssissä (tagBFP2).

raportointikokonaisuus

lisätietoja koesuunnittelusta on tämän artikkelin yhteydessä olevassa Nature Research Reporting Summary-julkaisussa.

koodin saatavuus