DNA triple helix formation: a potential tool for genetic repair

*vastaava tekijä: D. V. Kohli
Department of Pharmaceutical Sciences, tohtori Hari Singh Gour Vishwavidyalaya, Sagar-470 003, Intia
E-Mail:

Abstract

DNA triple helices offer new perspectives towards oligonucleotide-directed gene regulation. Kolmikierteiset oligonukleotidit, jotka sitoutuvat kaksijuosteiseen DNA: han, ovat erityisen kiinnostavia, koska ne on suunnattu pikemminkin geeniin itseensä kuin sen mRNA-tuotteeseen (kuten antisensistrategiassa). Joidenkin rakenteiden heikko vakaus saattaa kuitenkin rajoittaa niiden käyttöä fysiologisissa olosuhteissa. Tietyt ligandit voivat interkaloitua DNA: n kolmoiskierteiksi ja vakauttaa ne. Tässä katsauksessa esitetään yhteenveto viimeaikaisista edistysaskelista tällä alalla ja korostetaan myös suuria esteitä, jotka on vielä voitettava, ennen kuin triplex-teknologian soveltaminen terapeuttiseen geenien korjaukseen voidaan saavuttaa.

Kolmoiskierteen muodostuminen (kuva. 1) viime aikoina on ollut huomattavan kiinnostuksen kohteena, koska sitä voidaan soveltaa uusien molekyylibiologian työkalujen sekä terapeuttisten aineiden kehittämiseen ja koska H-DNA: n rakenteet ovat mahdollisesti merkityksellisiä biologisissa järjestelmissä . Intermolekulaarisissa rakenteissa DNA-dupleksin oligopyrimidiini-oligopuriinisekvenssiin sitoutuu pääurassa kolmijuosteinen oligonukleotidi .

on kuvattu kaksi kolmoiskierteen päätyyppiä, riippuen kolmannen juosteen suunnasta . Ensimmäinen raportoitu kolmikierteinen komplekseja mukana pyrimidinen kolmas juoste, jonka sitoutuminen perustuu Hoogsteen vetysidokset välillä T-a emäsparin ja tymiini, ja välillä C-G emäsparin ja protonoitu sytosiini . (T, C)-sisälteinen oligonukleotidi sitoutuu samansuuntaisesti oligopuriinijuosteeseen niin sanotussa pyrimidiinimotiivissa. Toinen kolmoiskierteen luokka sisältää puriinit kolmannessa säikeessä, joka on suuntautunut oligopuriinijuosteen vastaiseksi. C * G×G ja T·A×A emäskolmoset muodostuvat käänteisen Hoogsteenin vetysidoksen jälkeen . T: n ja G: n sisältävät oligonukleotidit voivat myös muodostaa kolmoiskierteitä, joiden suunta riippuu emäsjärjestyksestä .

Kolmoiskierteen muodostus tarjoaa suoran keinon manipuloida selektiivisesti geeniekspressiota soluissa, joissa DNA: n kolmoiskierteet tarjoavat uusia näkökulmia oligonukleotidien ohjaamaan geenien säätelyyn (kuva. 2). Synteettiset kolmoiskierteet muodostavat oligonukleotidit (TFOs) sitoutuvat suurella affiniteetilla ja spesifisyydellä puriinijuosteeseen homopuriini – homopyrimidiinijakson pääurassa kaksijuosteisessa DNA: ssa .

Tfot ovat hyviä ehdokkaita käytettäväksi paikkasidonnaisina DNA: ta sitovina aineina, ja niiden käyttöä mahdollisina terapeuttisina aineina tutkitaan. Niitä on tutkittu antisensiteettisovelluksissa, joissa ne on suunniteltu kohdistamaan mRNAs: iin, antigeenisovelluksissa, joissa ne ohjaavat geenien ilmentymistä kolmikierteisen muodostumisen kautta, ja sovelluksissa, jotka kohdistavat proteiineja, joissa niitä käytetään aptameereina .

TFOs: ia voidaan käyttää myös geeniterapiassa, jossa ne kohdistavat mutatoituneen geenin DNA-sekvenssiä estääkseen sen transkription. Puriinipitoisia traktaatteja esiintyy usein geenien promoottorialueilla, ja näille säätelyalueille suunnattujen TFOs: ien on osoitettu vähentävän selektiivisesti kohdegeenien transkriptiota, todennäköisesti estämällä transkriptioaktivaattoreiden sitoutumista ja/tai initiaatiokompleksien muodostumista. Transkription triplex-välitteistä modulaatiota voidaan käyttää terapiassa, koska sitä voidaan käyttää esimerkiksi vähentämään sairauksien prosesseissa tärkeinä pidettyjen proteiinien määrää. TFOs: ia voidaan käyttää myös molekyylivälineinä geeniekspression tutkimisessa, ja niiden on osoitettu olevan tehokkaita erilaisissa geenien kohdentamisstrategioissa elävissä soluissa. TFOs voi sitoutua DNA: n polypuriini/polypyrimidiinialueisiin sekvenssispesifisesti. Tämän sitoutumisen spesifisyys nostaa esiin mahdollisuuden käyttää triplexin muodostusta suunnattuun genomin muokkaukseen, jonka lopullisena tavoitteena on korjata ihmisen solujen geenivirheitä. Useat tutkimukset ovat osoittaneet, että nisäkässolujen käsittely TFOs: llä voi aiheuttaa DNA: n korjaantumista ja rekombinaatiota tavalla, jota voidaan hyödyntää toivottujen sekvenssimuutosten aikaansaamiseksi. On raportoitu useista tutkimuksista, joissa oligonukleotideja hyödynnettiin antigeeniyhdisteinä soluissa .

kolmoiskierteisen DNA: n muodostuminen

Kolmoiskierteisen DNA: n muodostuminen on seurausta oligoinukleotidien sitoutumisesta kaksoiskierteisen DNA: n pääuraan suurella spesifisyydellä muodostamalla Hoogsteen-tyyppisiä sidoksia Watson-Crick-emäsparien puriiniemästen kanssa, yhdiste, joka on rationaalisesti suunniteltu geeniekspression keinotekoiseen säätelyyn . Triplexin muodostuminen vaatii Mg2+ – ioneja, kun taas K + – ionit estävät sitä.

kolmoiskierre-eli antigeenistrategiassa oligonukleotidi sitoutuu kaksijuosteisen DNA: n pääuraan Hoogsteenin vetysidoksen kautta muodostaen kolmoiskierteen . TFOs sitoo homopuriini-homopyrimidiinisekvenssejä kaksijuosteisessa DNA: ssa. Triplexin muodostumiselle on neljä rakenteellista motiivia, jotka on kuvattu kolmannen juosteen koostumuksen ja sen suuntautumisen perusteella suhteessa dupleksin puriinirikkaaseen juosteeseen. Puriini motif TFOs (ne, jotka koostuvat G:stä ja A:sta) muodostavat G*G: C ja A*A: T kolmoset ja sitoutuvat vastakkaiseen suuntaan dupleksin puriinisäikeeseen nähden. Toisaalta pyrimidiinimoottorin tfos (C/T) muodostaa triplexejä rinnakkain ja yleensä vain alhaisessa pH:ssa, koska sytosiiniemäkset on protonoitava Hoogsteen-sidosten muodostamiseksi; ne muodostavat C+*G:C ja T*A: T-kolmosia. Lopuksi sekoitettu puriini ja pyrimidiini tfos sitoutuvat joko samansuuntaisesti tai vastakkaissuuntaisesti ja muodostavat G*G:C-ja T*A:T-kolmoset. Suunta, jossa sekoitettu motiivi tfos sitoutuvat, riippuu GPA: n ja ApG: n vaiheiden määrästä homopuriinikanavassa . Antiparallel-suuntausta suosii suurempi määrä vaiheita, kun taas pieni määrä askelia suosii rinnakkaista suuntausta .

kun paras motiivi tietyn kohdesarjan sitomiseen on selvitetty, luonnon fosfodiesterioligonukleotidien ongelmat rajoittavat antigeenimenetelmän onnistumista ja oligonukleotidien terapeuttisia sovelluksia yleensä. Oligonukleotidit, joilla on luonnollinen fosfodiesteriverkko, ovat alttiita endo-ja eksonukleaaseille. Vallitseva oligonukleotideja hajottava aktiivisuus on 3 ’ – eksonukleaasiaktiivisuus, mutta myös endonukleaasiaktiivisuutta on havaittu joissakin yhteyksissä . Siten käytettäväksi terapeuttisina lääkkeinä in vivo TFOs: n on pystyttävä vastustamaan sekä eksonukleaasi-että endonukleaasiaktiivisuutta saavuttaakseen tavoitteensa. Tfos: n in vivo-sovellutuksissa tarvitaan selkärangan muunnos, joka antaa nukleaasiresistenssin mutta mahdollistaa sitoutumisen kaksoissidonnaiseen DNA: han, jolla on suuri affiniteetti.

Fosforodiamidaattimorfolinoligomeerit ovat modifioituja runkooligonukleotideja, joita on aiemmin tutkittu antisensiteettiaineina . Morfolinoligonukleotideilla on varaukseton selkäranka, jossa DNA: n deoksiriboosisokeri korvataan kuusijäsenisellä renkaalla ja fosfodiesterisidos korvataan fosforodiamidaattisidoksella (kuva. 3). Morfolinoligonukleotidit ovat resistenttejä entsymaattiselle hajoamiselle, ja ne näyttävät toimivan antisensiteettiaineina pysäyttämällä translaation tai häiritsemällä mRNA: ta edeltävää kiertymistä RNaasi H: n aktivoinnin sijaan . Ne on onnistuneesti toimitettu kudosviljelysoluihin menetelmillä, jotka fyysisesti häiritsevät solukalvoa, ja eräässä tutkimuksessa, jossa verrattiin useita näistä menetelmistä, todettiin, että kaapiminen oli tehokkain toimitustapa; koska morfolinon selkäranka on lataamaton, kationiset lipidit eivät ole tehokkaita morfolinoligonukleotidin soluunoton välittäjiä . Tuore raportti osoitti triplexin muodostumisen morfolinoligonukleotidilla, ja koska selkäranka ei ole ioninen, nämä tutkimukset osoittivat, että morfolinoligonukleotidi kykeni triplexin muodostumiseen magnesiumin puuttuessa .

kationeilla on osoitettu olevan tärkeä rooli kolmoiskierteen muodostumisessa. Kun Fosfodiesterioligonukleotideja käytetään tfos: na, tarvitaan magnesiumia yleensä triplexin muodostumiseen puriini-ja sekamotiivien TFOs: ien kanssa; se myös nopeuttaa reaktiota ja stabiloi pyrimidiinimotiivien tfos: ien kanssa muodostuneen triplexin . Muiden kaksiarvoisten kationien on osoitettu toimivan triplexin muodostumisen osalta samassa ominaisuudessa kuin magnesium . Magnesiumia esiintyy ~0,8 mM: n pitoisuutena solussa ja ~1,5 mM: n pitoisuutena veressä , mutta useimmat in vitro triplex-reaktiot suoritetaan 5-10 mM MgCl2: ssa. Kaliumia esiintyy solussa ~140 mM: n pitoisuutena ja 4 mM: n pitoisuutena veressä. Suuret kaliumpitoisuudet voivat estää triplexin muodostumista tfos: iksi suunnitelluilla guaniinipitoisilla oligonukleotideilla suosimalla muita sekundaarisia DNA-rakenteita, kuten dimeerejä ja kvadruplekseja . On tarpeen voittaa fosfodiester TFOs: n rajallinen kyky muodostaa triplex alhaisessa magnesiumissa ja korkeassa kaliumissa, jotta ne olisivat tehokkaita fysiologisissa olosuhteissa. Tuoreessa morfolino TFOs-tutkimuksessa triplexin muodostuminen osoitettiin magnesiumin puuttuessa ja kaliumin läsnä ollessa. Nämä ominaisuudet tekevät morfolino Tfosista hyviä kandidaatteja jatkotutkimuksiin antigeeniterapeutteina.

Molekyylimallinnus

DNA: n triplex-rakenne voidaan konstruoida molekyylimallinnustekniikoilla käyttämällä koordinaatteja,jotka ottavat oikein huomioon (T, C) – motifisten kolmoiskierteiden sokerikonformaation . Tämä rakenne on lähempänä NMR-tutkimusten raportoimaa B-muotoista DNA: ta verrattuna ehdotettuun rakenteeseen , joka perustuu kuidun Röntgendiffraktioon. JUMNA-ohjelma mahdollistaa DNA-rakenteiden rakentamisen niiden kierteisten parametrien mukaan . Intercalation site voidaan helposti luoda triplexiin kaksinkertaistamalla nousuparametri kahdelle vierekkäiselle T * A×T-peruskolmoselle (rise = 6,8 Å) ja vähentämällä tämän jälkeen näiden kahden kolmosen välistä kiertoparametria 34°: sta 16°: een sidosetäisyysrajoitusten vähentämiseksi.

Molekyylimallinnuksen avulla voidaan osoittaa mahdollisuus muodostaa rinnakkainen kolmoiskierre, jossa yksittäinen säie vuorovaikuttaa ehjän dupleksin kanssa molliurassa uusien emäsvuorovaikutusten kautta .

JUMNA käyttää nukleiinihappojen joustavuuden kuvaamiseen kierteisten ja sisäisten koordinaattien (valenssi-ja dihedraalikulmien) seosta. Kierteiset parametrit sijoittavat jokaisen 3 ’ monofosfaattinukleotidin kiinteäakseliseen systeemiin nähden. Peräkkäisten nukleotidien väliset liitokset säilyvät kvadraattisilla rajoituksilla O5’ – C5 ’ – etäisyyksillä. Karteesisiin koordinaattiohjelmiin liittyvien muuttujien määrän vähentämisen lisäksi fysikaalisesti mielekkäiden muuttujien valinta mahdollistaa suuret, yhtenäiset konformaatioliikkeet minimoinnin aikana sekä rakenteen tehokkaan hallinnan ja rajoitteiden tai rajoitusten helpon käyttöönoton. Käytettävissä oleviin työkaluihin kuuluvat sekä adiabaattinen kartoitus että kombinatoriset haut valittujen rakenteellisten parametrien osalta. Flex-voimakentän erityispiirteisiin kuuluu erityinen termi , jolla otetaan huomioon vetysidoksen kulmariippuvuus, ja mahdollisuus sähköstaattisen energian seulontaan sigmoidisella dielektrisellä funktiolla ε (R) =D-(D-D0)/2 exp (-RS), jossa R on kahden varauksen välinen etäisyys. Funktion kaltevuus s, tasannearvo pitkällä etäisyydellä D ja alkuarvo d0 ovat säädettävissä, ja oletusarvot ovat 0.16, 80 ja 1, vastaavasti käyttäen kahta oletusta,joita on jo käytetty minor-groove-kolmoiskierteen rakentamiseen . Ensinnäkin kantakolmoset on sidottu koplanaarisiksi mahdollisten interbase-kolmosten välttämiseksi. Tällaisia vuorovaikutuksia syntyy helposti venytettyjen kierteiden rakentamisen aikana, mutta niillä ei voi olla merkitystä tunnistuksessa tai säikeiden vaihdossa, koska nämä prosessit ovat riippumattomia kokonaisuudesta. On tarkistettu, että molli-ura triplex optimoitu rakenne on riippumaton näistä rajoituksista. Toinen oletus, joka noudattaa RecA / DNA-kompleksien stoikiometriaa, jossa on kolme nukleotidia per RecA-monomeeri, on trinukleotidien kierteisen symmetrian käyttö. Tästä syystä alustavat tutkimukset on rajattu kolminukleotidisekvensseihin.

triplexin rakentamiseen ja käsittelyyn tarvitaan erityisiä rajoituksia tai rajoituksia. Näitä ovat aiemmin kuvatut” plateau ” – rajoitukset ja kolminukleotidiset symmetriarajoitukset . ”Plateau” -turvalaite ylläpitää kolmikon muodostavien emästen myötäsuuntaisuutta ja mahdollistaa samalla emäsparin vaihtamiseen tarvittavat pyörimiset ja siirtymät. Kolminukleotidisymmetriarajoite tarkoittaa kutakin kolmen nukleotidin peräkkäistä ryhmää kuvaavien muuttujien vastaavuutta. Venyttämällä dsDNA: ta niin, että kierre pienenee ja pieni ura aukeaa, on aiemmin saavutettu rajoittamalla kolminukleotidisymmetriayksikön terminaalisten O3′ – atomien välinen etäisyys. Tätä turvalaitetta on hieman muutettu, koska O3′-O3′ – etäisyyttä voidaan muuttaa tukiluiden sivusuuntaisella siirrolla nauhan vaihdon aikana. Tuoreessa teoksessa vain helix-akselin suuntaisen O3′ – O3′ – vektorin komponentti oli hillitty. Uran leveyden rajoituksia, jotka on kalibroitu numeeristen Poisson-Boltzmann-sähköstaattisten laskelmien avulla, käytettiin uran kaventumisen välttämiseksi eksplisiittisten liuotinmolekyylien puuttumisen vuoksi .

emäsparin vaihtumista tutkitaan emäsparin kiertoliikkeellä käyttäen bernetin ym .määrittelemää lähestymistapaa. Tähän liittyy sidoksen (puriini: C1′-N9 tai pyrimidiini: C1′-N1) ja emäsparin kahta C1′ – atomia yhdistävän vektorin välinen kulma θ, joka projisoidaan tasoon, joka on kohtisuorassa paikalliseen kierteisakseliin nähden. θ: n arvo on kanonisessa B-DNA: ssa 55°. Emäsparin vaihdon mallintaminen valitulle emäsparille edellyttää θ: n adiabaattista vaihtelua 65°: sta 10°: seen 2°: n portailla säilyttäen samalla sekä ”plateau” – että venytysrajoitukset.

kolmoiskierteen muodostumisessa kohtaamat esteet ja rajoitukset

TFOs: n biologiset Sovellukset vaarantuvat biofysikaalisten perusnäkökohtien sekä fysiologisten olosuhteiden asettamien rajoitusten vuoksi. Triplexin muodostukseen liittyy negatiivisesti varautuneen kolmannen juosteen lähestyminen ja sitominen kaksois-negatiivisesti varautuneeseen dupleksiin. Neutralisointi varauksen hylkimisreaktio tarjotaan tyypillisesti kokeellisesti tasot mg++ (5-10 mM), jotka ovat paljon korkeammat kuin mitä uskotaan olevan saatavilla soluissa . Lisäksi triplexin muodostukseen liittyy kolmannen juosteen konformaatiomuutoksia ja jonkin verran taustalla olevan dupleksin vääristymiä . Pyrimidiinimotiivin triplexit ovat epävakaita fysiologisessa pH: ssa, koska sytosiiniprotonaation tarve tapahtuu suhteellisen happamassa pH: ssa (pKa = 4,5). Tämä on välttämätöntä toiselle Hoogsteenin vetysidokselle, vaikka tuloksena oleva positiivinen varaus ilmeisesti vaikuttaa merkittävämmin triplexin stabiiliuteen . Viereisiä sytosiineja sisältävät pyrimidiinimotiivin triplexit ovat usein vähemmän stabiileja kuin eristettyjä sytosiineja sisältävät. Perinteisesti tämä on katsottu johtuvan charge-charge repulsion vaikutuksia, vaikka tuore tutkimus osoittaa epätäydellinen protonaatio viereisten sytosiinit voivat olla kriittinen tekijä . Lisäksi puriinimotiivin kolmannet säikeet (jotka ovat G-rikkaita) voivat muodostaa g-tetradeja fysiologisissa k+ – tasoissa, jotka estävät triplexin muodostumista . Kaikki nämä tekijät asettavat kineettisiä esteitä triplexin muodostumiselle ja vähentävät muodostuneiden triplexien vakautta (useimmat triplexit, jopa optimaalisissa olosuhteissa in vitro, ovat vähemmän stabiileja kuin taustalla oleva duplex .

rajoitukset

kolmikierteisessä antigeenistrategiassa kohdattu ensimmäinen ja tärkein ongelma on tfos: n muodostaman triplexin epävakaus fysiologisissa olosuhteissa, mikä rajoittaa tämän hyvin kiehtovan geenien korjaamiseen tarkoitetun strategian käyttöä vaihtelevassa määrin. Tämän vuoksi on ehdotettu erilaisia lähestymistapoja ja strategioita, joilla voidaan taata muodostuneelle kolmikierteiselle rakenteelle vakaus.

Oligonukleotidin ohjaamat kolmoiskierteet voitiin stabiloida käyttämällä nukleiinihappoligandeja, jotka selektiivisesti stabiloivat kolmoiskierteitä. Esimerkiksi etidiumbromidin on osoitettu sitovan ja stabiloivan Poly (DT)·poly (dA)× poly (dT), joka sisältää vain T·A×T-kolmosia . Tämä yhdiste kuitenkin stabiloi (tai jopa horjuttaa) huonosti sekä T·A×T-että C·G×C+ – emäskolmosia sisältäviä kolmoiskierteitä, todennäköisesti sähköstaattisen repulsion seurauksena . Bentsopyridoindolijohdannaiset olivat ensimmäisiä molekyylejä, joiden raportoitiin voimakkaasti stabiloivan tätä jälkimmäistä kolmoiskierteen tyyppiä, vaikka ne suosivat T·A×T-venymiä . Myös useiden muiden interkalaattoreiden sekä erilaisten DNA-molliuran ligandien on osoitettu sitoutuvan DNA: n kolmoiskierteisiin. Esimerkiksi kolmoiskierteitä voidaan stabiloida oligonukleotidien kemiallisella muunnoksella, kuten oligonukleotideihin kiinnittyneen psoraleenin on osoitettu tehostavan niiden biologista aktiivisuutta UV-säteilytyksen jälkeen . Interkalaattorit yleensä stabiloivat suuremmassa määrin T * A×T-kolmosia sisältäviä kolmoiskierteitä, kun taas pienet urasidokset yleensä epävakauttavat triplexejä, paitsi erityistapauksessa, jossa kolmoiskierteeseen liittyi RNA-juoste . Koska kolmoiskierteisistä ligandikomplekseista ei ole saatavilla rakenteellista tietoa, ei tiedetä paljoakaan vuorovaikutuksista, jotka ohjaavat spesifisen interkalaation kolmoiskierteiksi. BPI-johdannaisten on osoitettu interkaloituvan T·A×T-emäskolmikoiden välillä magnetointifluoresenssienergian siirrolla emäskolmosista ligandeihin sekä lineaarisella ja pyöreällä dikroismilla . Pyrimidiini-parallel morfolino-oligonukleotidien havaittiin pystyvän muodostamaan triplexin duplex-kohteen kanssa. Kuten odotettiin, tämä motiivi vaati alhaisen pH: n triplexin muodostumiselle, kuten pyrimidiini-rinnakkaismotiivi fosfodiesteri TFO vaatii. Tämä pH-riippuvuus voidaan ehkä voittaa sellaisilla substituutioilla kuin 5-metyylisytosiini TFO: n sytosiineille .

vaihtoehtoinen tapa, jolla kolmoiskierteet voidaan stabiloida, on oligonukleotidien kemialliset muunnokset, kuten akridiinimolekyylin kovalenttinen kiinnittyminen . On osoitettu, että akridiinisubstituutio lisää voimakkaasti restrictin-entsyymin pilkkoutumisen estoa eikä heikennä sekvenssispesifisyyttä triplexin muodostumisessa .

Kolmoiskierteisen DNA: n Sovellukset

molekyylien välisten DNA: n kolmoiskierteiden muodostuminen tarjoaa mahdollisuuden suunnitella yhdisteitä, joilla on laajat sekvenssien tunnistusominaisuudet ja jotka voivat olla hyödyllisiä antigeeniaineina tai molekyylibiologian työkaluina . Viime vuosikymmenen aikana lääketieteellisessä kemiassa on kehittymässä uusi lähestymistapa, jossa DNA-analogeja käytetään terapeuttisina aineina. Tämä perustuu tautiin liittyvien proteiinien / entsyymien geenien ilmentymisen säätelyyn estämällä niiden transkriptio (antigeeni) tai translaatio (antisense) (kuva. 4). Se vaikuttaa siten, että komplementaariset oligonukleotidit sitoutuvat sekvenssispesifisesti joko DNA-dupleksiin triplexin muodostumisen kautta estäen mRNA: n tuotantoa tai häiritsemällä jälkimmäisen translaatiota proteiineiksi. Koska oligonukleotidit eivät pääse soluihin helposti ja koska ne voivat tuhoutua solujen nukleaasien avulla, erilaisia oligonukleotidien kemiallisesti muunnettuja analogeja suunnitellaan, syntetisoidaan ja arvioidaan kehittymään terapeuttisina aineina.

homopuriini-homo pyrimidiini-alueiden spesifinen tunnistaminen duplex-DNA: ssa triplexiä muodostavilla oligonukleotideilla (TFOs) tarjoaa houkuttelevan strategian geenimanipulaatiolle, jonka lopullisena tavoitteena on korjata geenivirheet ihmissoluissa. Kyky kohdentaa mutaatioita voi osoittautua hyödylliseksi, välineenä tutkia DNA korjaus, ja tekniikka geeniterapia ja geenitekniikka .

Kolmikierteisiin perustuvia tehokkaita työkaluja kehitettiin erilaisiin biokemiallisiin sovelluksiin, kuten erittäin spesifisten keinotekoisten nukleaasien kehittämiseen. Antigeenistrategia on edelleen yksi triplexin kiehtovimmista sovellusaloista geeniekspression valikoivassa hallinnassa (Taulukko 1). Genomisekvenssien kohdentaminen on nyt osoittautunut arvokkaaksi käsitteeksi vielä rajoitetussa määrässä tutkimuksia; paikallinen mutageneesi on tässä suhteessa mielenkiintoinen triplexiä muodostavien oligonukleotidien sovellus soluviljelmiin .

Table 1: Antigeeninukleiinihappotutkimuksissa eukaryoottisissa Soluissa80

Antigeenistrategioissa keskitytään ensisijaisesti geenien kohdentamiseen homologisella rekombinaatiolla tai kolmikierteistä muodostavilla oligodeoksinukleotideilla . Näiden menetelmien kliininen soveltaminen ei ole edennyt nopeasti monista teknisistä syistä, kuten hyvin rajallisesta geenien saatavuudesta erittäin malariakontensoituneessa, proteiiniin käärityssä kromosomirakenteessa. Kielkopf et al ovat äskettäin kuvanneet vaihtoehtoista lähestymistapaa, käyttäen polyamideja, jotka voivat diffuusi tumaan ja tunnistaa tiettyjä DNA-sekvenssejä . Vaikka tämä menetelmä on hyvin jännittävä, se on vielä lapsenkengissään ja sen lopullinen kliininen hyöty on tuntematon .

antigeeniteknologian terapeuttiset Sovellukset

Triple helix DNA on herättänyt huomiota, koska tfos: ia on mahdollisesti käytetty terapeuttisina aineina, esimerkiksi solunsisäisten geenien kohdistamiseen, rationaalisina kemiallisina ratkaisuina DNA-dupleksin spesifisen tunnistamisen sekvenssiin ja solujen kasvusta ja pahanlaatuisesta transformaatiosta vastaavien geenien tunnistamiseen . Tämän tiedon myötä on syntynyt luonnollinen halu muuntaa tämä tieto uusiksi, kohdekohtaisiksi hoitostrategioiksi syövän, sydän-ja verisuonitautien ja muiden ihmiskunnan yleisten sairauksien hoidossa (Taulukko 2). Hiljattain kehitetty suhteellisen spesifinen biokemiallinen inhibiittori BCR/abl proteiinityrosiinikinaasi potilailla, joilla on krooninen myelooinen leukemia on upea esimerkki tästä quest . Sairauksia aiheuttavien geenien korvaamiseen, korjaamiseen tai invalidisoimiseen suoraan tarkoitetuissa hoidoissa kehitys on ollut paljon hitaampaa, eikä biokemiallista BCR/abl-estäjää vastaavaa menestystä ole vielä saavutettu. Syyt tähän ovat monimutkaisia ja vaihtelevat sen mukaan, minkä tyyppistä geeniohjattua hoitoa käytetään .

Taulukko 2: jotkin taudit, joita voidaan hoitaa DNA-Terapeutikoilla

Stephenson ja Zamecnik osoittivat, että lyhyt (13nt) DNA-oligonukleotidi replacement complementary in sequence (antisense) to the Rous sarkoomavirus voi estää viruksen replikaatio kulttuurissa. Yksi antisense-ja antigeenioligonukleotidien tärkeimmistä ominaisuuksista niiden käytössä terapeuttisina aineina on niiden nukleaasiresistenssi. Fosforotioaatti-oligonukleotidit ovat yleisin oligonukleotidien tyyppi, joilla on suhteellisen korkea nukleaasiresistenssi, ja ne on tuotu markkinoille lääkkeinä sytomegaloviruksen aiheuttamaa retiniittia vastaan . Oligonukleotidit,joiden 2′-O, 4′ – C-etyleeninukleiinihapon (ENA) jäännös on toisessa asennossa 3 ’ – päästä, osoittavat paljon suurempaa nukleaasiresistenssiä kuin ne, joiden nukleiinihapon (LNA) jäännös on samassa asennossa .

vaikka Kurreck ym.raportoivat LNA-oligonukleotidien olevan stabiileja ihmisen seerumissa , osittain modifioidut ENA-oligonukleotidit olivat paljon nukleaasiresistenttisempiä kuin LNA-oligonukleotidit rotan plasmassa. Lisäksi oligonukleotidit, jotka on muunnettu ENA-jäämillä 3′: n ja 5′: n päässä, ovat stabiilimpia kuin osittain muunnetut. Siten ENA-oligonukleotideilla on suuri potentiaali antisense-ja antigeeniaineina, joita voidaan käyttää in vivo . Sekvenssispesifistä triplexin muodostumista voidaan soveltaa geenien kohdistamiseen, geenien hiljentämiseen ja mutageneesiin .

tulevaisuudennäkymät

Oligonukleotidit voivat sitoutua paikkasidonnaisesti kiinnostavaan kohdegeeniin muodostamalla kolmikierteisesti. Triplexin muodostavat oligonukleotidit on tällä hetkellä suunniteltu sitoutumaan HER-2: een (ihmisen epidermaalinen kasvutekijän reseptori 2)/ neu-geeni, geeni, joka on yli-ilmentynyt monenlaisissa ihmisen kasvaimissa, mukaan lukien ei-pienisoluinen keuhkosyöpä, rintasyöpä, munasarjasyöpä ja GI-kasvaimet. Tätä strategiaa voidaan soveltaa laajasti monien onkogeenien tai muiden syöpään liittyvien geenien ilmentymisen estämiseksi. Näitä ”antigeeni” -oligonukleotideja käytetään nyt DNA-alkyloivien aineiden toimittamiseen tiettyihin emäksiin HER-2/neu-promoottori-ja koodaussekvenssissä transkription aloittamisen ja venymisen estämiseksi. Erityisesti triplexiä muodostavia oligonukleotideja on käytetty typpisinapin, kuten klorambusiilin, toimittamiseen Her-2/neu-geenin tiettyyn guaniiniemäkseen estämään geenin ilmentymistä. Target-spesifinen syöpästrategia, jossa antigeenioligonukleotidit yhdistetään DNA-aktiivisiin lääkkeisiin, osoittautuu virstanpylvääksi lähitulevaisuudessa.

1. Thuong, N. T. ja Helene, C., Angew. Kemiaa. Int., 1993, 32, 666
2. Mirkin, S. M. ja Frank-Kamenetskii, M. D., Annu. Pastori Biofys.Biomolia. Struct., 1994, 23, 541.
3. Patrizia, A., Paola B. A., Jean-Louis, M., Therese G., Claude H. andJian-Sheng S., Nucl. Happo. Res., 2002, 30, 5407.
4. Sun, J. S. ja Helene, C., Curr. Opinista. Struct. Biol., 1994, 3, 345.
5. le Doan, T., Perrouault, L., Praseuth, D., Habhoub, N., Decout, J. L.,Thuong, N. T., Lhomme, J. ja Helene, C., Nucl. Happo. Res., 1987,15, 7749.
6. Moser, H. E. and Dervan, P. B., Science, 1987, 238, 645.
7. Beal, P. A. ja Dervan, P. B., Tiede, 1991, 251, 1360.
8. Pilch, D. S., Levenson, C. and Shafer, R. H., Biochemistry, 1991, 30 6081.
9. DeBizemont, T., Duval-Valentin, G., Sun, J. S., Bisagni, E., Garestier, T. ja Helene, C., Nucl. Happo. Res., 1996, 24, 1136.
10. McGuffie, E. M. ja Catapano, C. V., Nucl. Happo. Res., 2002, 30,12, 2701.
11. Basye, J., Trent, J. O., Gao, D. ja Ebbinghaus, S. W., Nucl. Happo.Res., 2001, 29, 4873.
12. Helene, C. and toulme, J. J., Biochem. Biofyysejä. Acta., 1990,1049, 99.
13. Helene, C., Eur. J. Syöpä, 1994, 30, 1721.
14. Stein, C. A. ja Cheng, Y. C., Tiede, 1993, 261, 1004.
15. Wagner, R. W., Nature, 1994, 372, 333.
16. Praseuth, D., Guieysse, A. L., Helene, C., Biochem. Biofyysejä.Acta., 1999, 1489, 181.
17. Sun, J. S., DeBizemont, T., Duval-Valentin, G., Montenay-Garestier, T. and Helene, C., C. R. Acad. Sci., 1991, 313, 585.
18. Gamper, H. B. J., Kutyavin, I. V., Rhinehart, R. L., Lohov, S. G., Reed, M. W. and Meyer, R. B., Biochemistry, 1997, 36, 14816.
19. Eder, P. S., DeVine, R. J., Dagle, J. M. ja Walder, J. A., AntisenseRes. Dev., 1991, 1, 141.
20. Fisher, T. L., Terhorst, T., Cao, X. ja Wagner, R. W., Nucl. Happo.Res., 1993, 21, 3857.
21. Stein, D., Foster, E., Huang, S. B. ,eller AcidDrugDev., 1997, 7, 151.
22. Summerton, St AcidDrugDev., 1997, 7, 63.
23. Summerton, Antis AcidDrugDev., 1997, 7, 187.
24. Hudziak, R. M., Barofsk. AcidDrugDev., 1996, 6,267.
25. Ghosh, C., Stein, D., eller, 2000, 313, 135.
26. Giles, R.V., Spiller, D.G., Clark, R.E. and Tidd, D.M., AntisenseNucl. AcidDrugDev., 1999, 9, 213.
27. Ghosh, C. and Iversen, P.L., AntisenseNucl. AcidDrugDev.,2000, 10, 263.
28. Lacroix, L., Arimondo, P.B., Takasugi, M., Helene, C. and Mergny,J.L., Biochem. Biophys. Res. Commun., 2000, 270, 363.
29. Rougee, M., Faucon, B., Mergny, J.L., Barcelo, F., Giovannangeli, C.,Garestier, T. and Helene, C., Biochemistry, 1992, 31, 9269.
30. Maher, L.J., Dervan, P.B. and Wold, B.J., Biochemistry, 1990, 29,8820.
31. Singleton, S.F. and Dervan, P.B., Biokemia, 1993, 32, 13171.
32. Blume, S. W., Lebowitz, J., Zacharias, W., Guarcello, V.,Mayfield, C. A., Ebbinghaus, S. W., Bates, P., Jones, D. E., Trent, J. andVigneswaran, N., Nucl. Happo. Res., 1999, 27, 695.
33. Darnell, J., Lodish, H. and Baltimore, D., In; Molecular CellBiologyScientific American Books, New York, 1990, 531.
34. Suda, T., Mishima, Y., Asakura, H. ja Kominami, R., Nukl. Happo.Res., 1995, 23, 3771.
35. Olivas, W. M. ja Maher, L. J., Nukl. Happo. Res., 1995, 23, 1936.
36. Svinarchuk, F., Tšerny, D., Debin, A., Delain, E. ja Malvy, C., Nucl.Happo. 1996, 24, 3858.
37. Faruqi, A. F., Krawczyk, S. H., Matteucci, M. D. ja Glazer, P. M., Nukl. Happo. Res., 1997, 25, 633.
38. Blume, S. W., Guarcello, V., Zacharias, W. and Miller, D. M., Nucl.Happo. Res., 1997, 25, 617.
39. Ouali, M., Letellier, R., Adnet, F., Liquier, J., Sun, J. S., Lavery, R. andTaillandier, E., Biochemistry, 1993, 32, 2098.
40. Macaya, R. F., Schultze, P. ja Feigon, J., J. Amer. Kemiaa. Soc.,1992, 114, 781.
41. Radhakrishnan, I. and Patel, D. J., Biochemistry, 1994, 33, 11405.
42. Arnott, S., Bond, P. J., Selsing, E. and Smith, P. J. C., Nukl. Happo.Res., 1976, 3, 2459.
43. Lavery, R. ja Sklenar, H., J. Biomol. Struct. Dyn., 1988, 6, 63.
44. Bertucat, G., Lavery, R. ja Prevost, C., J. Biomol. Struct. Dyn.,1998, 16, 535.
45. Lavery, R., Peyrard, M., toim. In; epälineaarinen heräte inBiomolecules, Springer-Verlag, Editions de Physique, Berlin ja NewYork, 1995, 57.
46. hingerty, B. E., Richtie, R. H., Ferrell, T. L. and Turner,J. E., Biopolymers, 1985, 24, 427.
47. Bernet, J., Zakrzewska, K. ja Lavery, R., J. Mol. Struct.Theochem., 1997, 398-399, 473.
48. Pesco, J., Salmon, J. M., Vigo, J. ja Viallet, P., Anaali. Biochem.,2001, 290, 221.
49. Gilbert, D. E. ja Feigon, J., Curr. Opinista. Struct. Biol., 1990, 9, 305.
50. 50. Shimizu, M., Konishi, A., Shimada, Y., Inoue, H., ja Ohtsuka, E., FEBS. Lett., 1992, 302, 155.
51. Asensio, J. L., Carr, R., Brown, T. ja Lane, A. N., J. Amer.Kemiaa. Soc., 1999, 121, 11063.
52. Asensio, J. L., Lane, A. N., Dhesi, J., Bergqvist, S. and Brown, T., J. Mol. Biol., 1998, 275, 811.
53. Volker, J. and Klump, H. H., biokemia., 1994,33, 13502 .
54. Sugimoto, N., Wu, P., Hara, H. ja Kawamoto, Y., biokemia.,2001, 40, 9396.
55. Arimondo, P. B., Garestier, T., Helene, C. Ja Sun, J. S., Nucl. Happamia., 2001, 29, 15.
56. Michael, M., Seidman, M. M. ja Peter, M. G., J. Clin.Sijoittaa., 2003,112, 487.
57. Panas Scaria, P. V. ja Shafer, R. H., J. Biol. Kemiaa., 1991, 266,5417.
58. Mergny, J. L., Collier, D., Rougee, M., Montenay-Garestier, T. andHelene, C., Nucl. Happo. Res., 1991, 19, 1521.
59. 59. Mergny, J. L., Duval-Valentin, G., Nguyen, C. H., Perrouault, L., Faucon, B., Rougee, M., Montenay-Garestier, T., Bisagni, E. andHelene, C., Science, 1992, 256, 1681.
60. Lee, J. S., Latimer, Ljp ja Hampel, kj, biokemia, 1993, 325591.
61. Park, Y. W. and Breslauer, K. J., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1992, 89, 6653.
62. Durand, M., Thuong, N. T. ja Maurizot, J. C., J. Biol. Kemiaa., 1992,267, 24394.
63. Durand, M., Thuong, N. T. ja Maurizot, J. C., J. Biomol. Struct.Dyn., 1994, 11, 1191.
64. Kulka, M., Smith, C. C., Aurelianus, L., Meade, K., Miller, P. ja Ts ’ O,P. O. P., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, 86, 6868.
65. Chang, E. H., Miller, P. S., Cushman, C., Devdas, K., Pirolo, K. F., Ts ’ op. O. P. ja Yu, Z. P., Biokemia, 1991, 30, 8283.
66. Pilch, D. S. and Breslauer, K. J., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1994, 91, 9332.
67. Pilch, D. S., Waring, M. J., Sun, J. S., Rougee, M., Nguyen, C. H., BisagniE., Garestier, T. ja Helene, C., J. Mol. Biol., 1993, 232, 926.
68. Kim, S. K., Sun, J. S., Garestier, T., Helene, C., Bisagni, E., Rodger, A. ja Norden, B., Biopolymers, 1997, 42, 101.
69. Lin, S. B., Kao, C. F., Lee, S. C. ja Kan, L. S., AnticancerDrugDes., 1994, 9, 1.
70. Grigoriev, M., Praseuth, D., Robin, P., Hemar, A., Saison-Behmoaras, T., Dautry-Varsat, A., Thuong, N. T. ja Helen, C., Proc. Natl.Acad. Sci. USA, 1991, 88, 3389.
71. Grigoriev, M., Praseuth, D., Robin, P., Hemar, A., Saison-Behmoaras,T., Dautry-Varsat, A., Thuong, N. T., Helen, C. ja Harel-Bellan, A.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1992, 267, 3389.
72. Gowers, D. M. ja Fox, K. R., Nucl. Happo. Res., 1999, 27, 1569.
73. 73. Nagatsugi, F., Sasaki, S., Miller, P. S. ja Seidman, M. M., Nucl.Happo. Res., 2003, 15, 31.
74. Melton, D. W., BioEssays, 1994, 16, 633.
75. Helene, C., Cancer, 1994, 30, 1721.
76. Majumdar, A., Khorlin, A. ja Djatkina, N., Nat. Genet., 1998, 20,212.
77. Kielkopf, C. L., Baird, E. E. and Dervan, P. B., Nat. Struct. Biol.,1998, 5, 104.
78. Alan, M. and Gewirtz, M. D., J. Clin. Onkol., 2000, 18, 1809.
79. Rao, N. R. ja Nalluri, B. N., Ind. J. Pharm. Edu., 2003, 37, 132.
80. Varmus, H. E., I. Biosci. Rep., 1990, 10 413.
81. Fearon, E. R. ja Dang, C. V., Current Biol., 1999, 9, R62.
82. Hahn, W. C., Counter, C. M. ja Lundberg, A. S., Nature, 1999, 400 464.
83. Druker, B. J. and Lydon, N. B., J. Clin. Sijoittaa., 2000, 105, 3.
84. Stephenson, M. L. ja Zamecnik, P. C., Proc. Natl. Acad. Sci.USA., 1978, 75, 285.
85. gear GE Farmakokinet.,2002, 41, 255.
86. Morita, K., Hasegaw Med. Kemiaa.Lett., 2002, 12, 73.
87. Kurreck, Nu Acid.Res., 2002, 30, 1911.
88. Koizumi, M., Morita, K., Daigo, M., Tsutsumi, S., Abe, K., Obika, S. ja Imanishi, T., Nucl. Happo. Res., 2003, 31, 3267.