kuvaus
Thermo Scientific Pierce Ellmanin reagenssi (DTNB) reagoi sulfhydryyliryhmien kanssa muodostaen värillisen tuotteen, joka tarjoaa luotettavan menetelmän pelkistyneiden kysteiinien ja muiden vapaiden sulfhydryylien mittaamiseen liuoksessa.
Ellmanin reagenssia (5,5′-ditio-bis-) käytetään sulfhydryyliryhmien arvioimiseen näytteessä vertaamalla sulfhydryyliä sisältävän yhdisteen kuten kysteiinin standardikäyrään. Vaihtoehtoisesti sulfhydryyliryhmät voidaan määrittää TNB: n ekstinktiokertoimella (14,150 M-1 cm-1 412nm: n aallonpituudella). Ellmanin reagenssia on käytetty muissakin sovelluksissa kuin sulfhydryylin estimoinnissa, kuten alkyylitiolien määrittämiseen HPLC: llä esikolonnin johdannaismenetelmällä ja tiolien tutkimiseen useiden entsyymien aktiivisessa kohdassa.
Ellmanin reagenssin ominaisuudet:
* Sulfhydryl assay-reagoi kvantitatiivisesti vapaiden (pelkistettyjen) sulfhydryyliryhmien (—SH) kanssa, jolloin saadaan havaittavaa TNB-tuotetta
• kolorimetrinen detektiovärinen tuote mahdollistaa spektrofotometrisen mittauksen kuvetteina tai mikromuoveina (λmax = 412nm); ε = 14,150/m·cm)
• todistettu menetelmä—hyvin tunnettu kemia mahdollistaa peptidi-tai proteiinisulfhydryyliryhmien kvantitoinnin käyttämällä ekstinktiokertoimen laskentaa tai vertaamalla kysteiinistandardiin
reagenssin ominaisuudet
• vaihtoehtoiset nimet: DTNB, Ellmanin reagenssi
• Kemiallinen nimi: 5,5′-Ditio-bis-(2-nitrobentsoehappo)
• reaktiivinen kohti: sulfhydryyliryhmiä (—SH)
• kemiallinen kaava: c14h8n2o8s2
• CAS-numero: 69-78-3
• molekyylipaino: 396.35
• muoto: Keltainen kiteinen jauhe
DTNB reagoi vapaan sulfhydryyliryhmän kanssa muodostaen disulfidin ja 2-nitro-5-tiobentsoehapon (TNB) sekoituksen. Dtnb: n kohde tässä reaktiossa on vapaan sulfhydryyliryhmän konjugaattiemäs (R—s -). Tämän reaktion nopeus riippuu siis useista tekijöistä: (1) reaktion pH, (2) sulfhydryylin pKa’ ja (3) steeriset ja sähköstaattiset vaikutukset. TNB on tässä reaktiossa syntyvä värillinen laji, jolla on korkea molaarinen ekstinktiokerroin näkyvällä alueella. Ellman raportoi alun perin (1959) TNB: n moolisukupuuttokertoimeksi 13 600 M-1 cm-1 aallonpituudella 412 nm ja pH 8,0. Näin ollen tämä arvo on mainittu usein kirjallisuudessa. Myöhemmät tutkimukset ovat kuitenkin osoittaneet, että molaarinen ekstinktiokerroin kuvastuu tarkemmin arvolla 14 150 M-1 cm-1 aallonpituudella 412 nm. TNB: n häviämiseen eivät vaikuta pH: n muutokset välillä 7,6-8,6. TNB: n sukupuutto on kuitenkin erilainen muissa liuottimissa.