du-Huo-Ji-Sheng-Tangin vaikutusmekanismit rustojen hajoamisessa nivelrikon Kanimallissa

Abstrakti

Du-Huo-Ji-Sheng-Tang (dhjst) on perinteinen kiinalainen rohdosvalmiste, jota käytetään nivelrikon hoitoon. Tässä tutkimuksessa selvitettiin dhjst: n terapeuttista vaikutusta rustojen hajoamiseen kanin nivelrikon mallissa. Kanien polvinivelissä tehtiin anterior cruciate ligament transection (ACLT) kokeellisen nivelrikon aikaansaamiseksi. Kuudennen viikon lopussa 30 kania, joilla oli ACLT, jaettiin kuuteen ryhmään, kontrolliryhmään, dhjst-ryhmään ja OSAMINETHACINE (OSA) – ryhmään, joita seurattiin vielä 4 viikon ajan. Muut kolme ryhmää kaneja, joilla oli ACLT, hoidettiin dhjst: llä tai OSA: lla, jotka lopetettiin 6 viikon kuluttua, ja ne toimivat 6 viikon aikapistekontrolleina. Tulokset osoittivat, että kuudennen viikon lopulla leikkauksen jälkeen verrokkiryhmässä oli merkittävästi histologista degeneraatiota verrattuna normaaliin ryhmään. Kontrolliryhmässä histologisen degeneraation keskiarvo nousi edelleen 10.viikolla, ja dhjst-ryhmässä histologisen degeneraation keskiarvo oli huomattavasti pienempi kuin kontrolliryhmässä. Mahdollisen mekanismin tutkimiseksi havaittiin VEGF: n ja HIF-1α: n ilmaisutaso. VEGF mRNA: n ja HIF-1α mRNA: n ilmentyminen on vähäistä normaaliryhmässä, kun taas verrokkiryhmässä toiminta lisääntyy vähitellen. Samaan time point-malliryhmään verrattuna VEGF: n ja HIF-1α: n aktiivisuus kuitenkin väheni merkittävästi DHJST-ryhmässä. Yhteenvetona voidaan todeta, että dhjst: llä on merkittävä terapeuttinen vaikutus nivelrikkokaniineihin, ja mekanismit liittyvät VEGF: n ja HIF-1α: n ilmentymisen estoon.

1. Johdanto

nivelrikko (OA) on etenevä ja heikentävä sairaus, joka voi kestää vuosia ennen kuin se ilmenee kliinisesti sairastuneilla henkilöillä. Ruston vanhenemisella ja kondrocyte vanhenemisella on tärkeä rooli OA: n patogeneesissä ja kehityksessä. OA: n kehittymisen aikana solukuolema lisääntyy usein fokaalisesti. Monet raportit osoittivat, että kondrosyytti vanheneminen edistää riskiä ruston rappeuma vähentämällä kykyä kondrosyyttien ylläpitää ja korjata nivelruston kudosta . Koska on teoretisoitu, että jokainen kondrosyytti on vastuussa sitä ympäröivän solunulkoisen matriisin ylläpidosta ja että kudoksen yhdellä alueella tuotetuilla matriisimolekyyleillä on hyvin rajallinen kyky kulkea kudoksessa, elinkelpoisten solujen polttoväli voi olla osittain vastuussa kudosten kyvyttömyydestä korjata pieniä vaurioita .

tällä hetkellä OA: han ei ole parannuskeinoa, ja saatavilla olevat hoidot vain hidastavat taudin etenemistä . Viimeisen 20 vuoden aikana perinteinen kiinalainen lääketiede (TCM) on nähnyt merkittävää edistystä OA: ta vastaan, kuten parantamalla potilaiden kliinisiä löydöksiä, estämällä tulehdusreaktiota ja ruston rappeutumista . In vivo-ja in vitro-tutkimukset osoittivat myös, että kiinalaisilla yrtteillä on useita kattavia vaikutuksia OA: ta vastaan . Du-Huo-Ji-Sheng-Tang, joka koostuu Radix Angelicae Pubescentis, Herba Taxilli, Herba Taxilli, Radix Acanthopanacis Bidentatae, Herba Asari, Radix Gentianae Macrophyllae, Cortex Cinnamomi ja Poria, on laajalti käytetty hoitoon OA. Se voi parantaa kliinisiä oireita, polven toimintaa ja potilaiden elämänlaatua . Perustuen tietämykseemme OA: n patogeneesistä TCM: ssä selvitimme dhjst: n vaikutusta OA: n rustorappeuman estämiseen kaniineilla ja havainnoimme sen mekanismeja.

2. Menetelmät

2. 1. Materiaalit

umpikujan kolorimetrinen apoptoosin havaitsemisjärjestelmä (TUNEL assay) saatiin Nanjing Jiancheng Biotech Companyltä (Kiina). Trizol total RNA extraction kit, DNA molecular marker, SYBR Premix EX TaqTM ja Perfect Real Time kit ostettiin Invitrogen Co. (YHDYSVALLAT). Yrtit DJST: ssä (koostuu Radix Angelicae Pubescentis, Herba Taxilli, Herba Taxilli, Radix Acanthopanacis Bidentatae, Herba Asari, Radix Gentianae Macrophyllae, Cortex Cinnamomi ja Poria, palvelun tarjoaa Shanghai Huayu Chinese Herbs Co. Ltd., Kiina) oli akkreditoitu farmakognosisti standardiprotokollien mukaan, jotka on valmistanut Shanghai Municipal Hospital of Traditional Chinese Medicine, komponentit sekoitettiin, jotta suhde 2 : 1 : 1 : 1 : 0.2 : 1 : 0.3 : 1 (kuivapaino), lääkkeet uutettiin standardimenetelmillä Kiinan farmakopean (China Pharmacopoeia and Committee, 2000) mukaan. Nämä raa ’ at lääkkeet liotettiin tislattuun veteen ja keitettiin 30 minuuttia kahdesti, ja lääkeliuos suodatettiin verkon läpi, sitten suodos konsentroitiin 4 g mL−1: een tyhjöpumpulla ja varastoitiin sitten -20°C: ssa käyttöön asti. Osaminetasiini (OSA), jokainen tabletti sisältää 25 mg indometasiinia ja 75 mg aminoglukoosia (toimittanut Hebei Jizhong Pharmaceutical Co. Ltd., Kiina), käytettiin positiivisena kontrollilääkkeenä.

2, 2. Kanit ja Kudosvalmisteet

neljäkymmentäkahdeksan kuukautta vanhat Uuden-Seelannin valkoiset kanit toimitti Koe-eläinkeskus Kiinan tiedeakatemialle. Kolmekymmentä kanit tehtiin yksipuolinen anterior cruciate nivelside transection (ACLT) yleisanestesiassa. Normaaleille kaneille ei tehty toimenpidettä.

kuudennen viikon lopussa ne 30 kania, joilla oli ACLT, jaettiin kuuteen ryhmään, kontrolliryhmään, dhjst-ryhmään ja OSA-ryhmään, joita seurattiin vielä 4 viikkoa. Muut kolme ryhmää kaneja, joilla oli ACLT, hoidettiin dhjst: llä tai OSA: lla, jotka lopetettiin 6 viikon kuluttua, ja ne toimivat 6 viikon aikapistekontrolleina. Decoctions olivat suun kautta ylläpitäjä annoksella 0.923 g (kg−1·d−1) 4 viikon ajan OSA−ryhmän kaneille annettiin 0, 09 g (kg−1·d-1) 4 viikon ajan, malliryhmälle ja normaaliryhmälle annettiin suun kautta sama määrä fysiologista suolaliuosta.

kaneja lopetettiin näytteenottoa varten. Pöytäkirja sai Shanghaissa, Kiinassa sijaitsevan University Medical Centren eläinkokeiden komitean hyväksynnän. Kanin sääriluut poistettiin ja sääriluun nivelrusto säilytettiin välittömästi -80°C: ssa. Sääriluu leikattiin huolellisesti, poistettiin viereisestä lihasta ja kiinnitettiin välittömästi 10-prosenttiseen formaliiniin 24 tunnin ajaksi. Tämän jälkeen sääriluut kalkittiin 4 viikon ajan 100 g/L etyleenidiamiinitetraetikkahapossa, pestiin PBS: ssä, dehydratoitiin etanolisarjalla ja upotettiin parafiiniin standardoidulla tavalla oikean suuntautumisen varmistamiseksi. Parafiinikudososat (7 µm) leikattiin standardoidulla tavalla. Osat poistettiin histokemiallisia analyysejä varten.

2, 3. Rustojen histologinen arviointi

histologinen arviointi tehtiin kanien femorotibiaalinivelille DHJST-ryhmässä, OSA-ryhmässä ja kontrolliryhmässä. Osat värjättiin Safranin O-fast-vihreällä. Kaksi riippumatonta, lautakunnan sertifioimaa eläinlääketieteellistä patologiaarvioi nämä histologiset osiot kustakin havaintopaikasta mankin-luokitusjärjestelmällä (Taulukko 1).

2, 4. TUNEL-määritys

H2O2-indusoitunut apoptoosi havaittiin suorittamalla terminaalinen deoksinukleotidedyylitransferaasivälitteinen DUTP nick end-labeling (TUNEL)-määritys käyttäen Apo-DirectTM-pakkausta (CalBiochem, San Diego, CA). Viritys tehtiin valmistajan ohjeiden mukaan. Lyhyesti, kun esivalmistelut ja altistuminen H2O2: lle, solut kerättiin, pestiin, kiinnitettiin, permeabiloitiin ja merkittiin DNA-juosteen katkoksille, sitten analysoitiin Coulter-epiikan eliittivirtaussytometrillä (Beckman-Coulter, Miami, USA). Kaikki määritykset tehtiin kolmena kappaleena.

2, 5. Fluoresoiva kvantitatiivinen PCR

kokonais-RNA uutettiin 50 mg: sta sääriluun nivelruston rustosta Trizolireagenssilla. CDNA: n synteesi suoritettiin käyttäen 4 µg kokonais-RNA: ta näytettä kohti satunnaisilla alukkeilla ja reagensseilla, jotka sisältyivät Revert Aid First Strand cDNA-synteesipakkaukseen. Kaksi mikrolitraa (2 µL) kutakin näytettä käytettiin reaaliaikaiseen PCR: ään Roottorigeeni 2000-järjestelmässä (Australia). Suhteellinen kvantitaatio laskettiin käyttämällä deltasyklin kynnysarvoa () suhteellista kvantitaatiota. Endogeenisen kontrollin CAPDH mRNA: n kynnysjakso () ja kohdesignaalit määritettiin ja suhteellinen RNA-kvantitaatio laskettiin vertailumenetelmällä, jossa

verisuonten endoteelikasvutekijän (VEGF) alukkeiden sekvenssit ovat: 5′-TGCCACCGAGGAGTTCA-3(eteenpäin) ja 5′-GGCCCTGAGGTTGAT-3(taaksepäin) (tuotteen pituus: 75 bp).Hypoksian indusoituvassa tekijä-1α: ssa (HIF-1α) käytetyt alukkeet ovat: 5′-cagtgcaaaagacaggtggaag-3(eteenpäin) ja 5′-CCCTGTAGGTGTGTGTGTGTGT-3(taaksepäin) (tuotteen pituus: 107 bp).Gapdh: ssa käytetyt alukkeet ovat: 5′-CCGAGGGCACTAAGG-3(eteenpäin) ja 5 ’ -GCTGTTGAAGTCACAGGAGACAA-3(taaksepäin) (tuotteen pituus: 88 bp).

2, 6. Tilastoanalyysi

kaikki tulokset ilmaistiin keskiarvona ja keskihajontana (SD). Mittaustiedot analysoitiin yksisuuntaisella varianssianalyysillä (ANOVA, SPSS 11.0). Rank-tiedot analysoitiin riditillä. Tulos p < .05: tä pidettiin tilastollisesti merkitsevänä.

3. Tulokset

3.1. ACLT: n aiheuttamaa histologista degeneraatiota kaniineilla vähensi dhjst

edustavat histologiset kohdat on esitetty kuvassa 1. 10. viikon lopussa havaitsimme nivelpinnan normaalin eheyden normaalissa ryhmässä(Kuva 1 (a)). Kontrolliryhmässä, jossa on lisääntynyt degeneraatio, menetettiin safranin O-fast green-värjäystä, johon liittyi halkeama, joka ulottui Keski-ja syvävyöhykkeille (Kuva 1(b)), ja DHJST-ryhmässä menetettiin varhainen lievä värinä, ja safranin O-fast green-värjäystä havaittiin yhdessä kondrosyyttiklusteroinnin kanssa (kuva 1(c)). OSA-ryhmä, jossa Safraniini-O-fast green-värjäytyminen hävisi, nämä muutokset olivat samanlaisia kuin DHJST-ryhmä(kuva 1 (d)). Kuudennen viikon lopulla leikkauksen jälkeen verrokkiryhmässä oli merkittäviä histologisia eroja normaaliin ryhmään verrattuna (p < .01). Kontrolliryhmässä Safraniini-o-fast green-värjäyksen keskiarvo nousi edelleen 10 .viikolla verrattuna 6. viikolla saavutettuun keskiarvoon (p <.01) (Kuva 2A). 10. viikonloppuna mankin-pisteissä oli merkittäviä eroja kontrolliryhmän ja dhjst-ryhmän välillä, safranin O-fast green-värjäyksen keskiarvo dhjst-ryhmässä oli huomattavasti pienempi verrattuna kontrolliryhmään (p < .01) (kuva 2(b)), eikä tilastollisesti merkitseviä eroja Mankinin pisteytyksessä DHJST-ryhmän ja OSA-ryhmän välillä (p >.05).

(a)

(b)

(c)

(d)

(a)
(b)
(c)
(d)

Figure 1

Histological examination of cartilage (Safranin O-fast green staining, ×100).

(a)

(b)

(c)

(d)

(a)
(b)
(c)
(d)

Figure 2

The influence of DHJST on histological parameters and apoptotic of chondrocytes. Tulokset esitettiin keskiarvona ± SD (n = 5 ryhmää kohti) kussakin sarakkeessa. * P < .01 verrattuna nivelrikon kontrolliryhmään 6. viikolla, * * p < .01, verrattuna nivelrikon verrokkiryhmään.

3, 2. DHJST: n estämät rustosolut apoptoosi

kuudennen viikon lopussa leikkauksen jälkeen verrokkiryhmän apoptoosisoluindeksi verrattuna normaaliryhmään oli merkitsevästi erilainen (p < .01). Verrokkiryhmässä apoptoosisolun indeksi nousi edelleen huomattavasti (keskiarvosta ± SD 0,35 ± 0,13 kuudennella viikolla 0,62 ± 0,10 kymmenennellä viikolla; P < .01) (kuva 2 c). 10. viikon lopussa DHJST-ryhmään verrattuna apoptoosisolun indeksi kasvaa huomattavasti kontrolliryhmässä (p < .01) (kuva 2 (d)). APOPTOOSISOLUINDEKSISSÄ ei ollut merkittäviä eroja OSA-ryhmän ja DHJST-ryhmän välillä (P >.05).

3, 3. VEGF: n ja HIF-1α: n ilmentymisen esto rustosoluissa liittyy Dhjst: n terapeuttiseen vaikutukseen

fluoresoiva kvantitatiivinen PCR osoitti, että VEGF mRNA: n ja HIF-1α mRNA: n ilmentyminen on vähäistä normaalissa ryhmässä, kun taas kontrolliryhmässä aktiivisuus lisääntyy asteittain ja merkittävästi verrattuna normaaliin ryhmään (p < .01); kontrolliryhmässä nivelen kondrosyyttien HIF-1α alkaa lisääntyä kuudennella viikolla leikkauksen jälkeen, edelleen kymmenennellä viikolla verrattuna kuudenteen viikkoon (keskiarvo ± SD 94, 21 ± 20.12 kuudennella viikolla ja 160, 35 ± 72, 27 kymmenennellä viikolla; P < .05) (Taulukko 2). 10 .viikonloppuna VEGF mrnan ja HIF-1α mrnan ilmentyminen dhjst-ryhmässä väheni merkittävästi verrattuna kontrolliryhmään annostelun jälkeen (p <.01). Vaikka VEGF-mRNA-ja HIF-1α-mRNA-pitoisuudet OSARYHMÄSSÄ vähenivät yleensä 4 viikkoa kestäneellä OSAHOIDOLLA verrattuna kontrolliryhmään, merkittävää eroa ei ollut (Taulukko 3).

4. Keskustelu

ACLT-malli on yksi yleisimmin käytetyistä OA: n kokeellisista malleista. Kanin ACLT: tä käytetään yhä enemmän OA-tutkimuksissa, koska tauti puhkeaa nopeasti. Kokeellisten ACLT-mallien käytöllä on erityistä kliinistä merkitystä, koska ihmisellä esiintyy ACL: n repeämiä ja se johtaa myös OA: n kehittymiseen. Tutkimus osoittaa, että suuri määrä kondrosyyttien apoptoosi olemassa aikana etenevä vaiheessa OA kaneilla aiheuttama leikkaus. Kondrosyyttiapoptoosi on yksi OA: n rustolle ominaisista muutoksista. Patologinen apoptoosi haitallisen stimulaation yhteydessä voi johtaa kemotaksien tai tulehdustekijöiden vapautumiseen, mikä puolestaan pahentaa rustovaurioita ja aktivoi kipua . Siksi kondrocyte apoptosis estävä saattaa olla tärkeä strategia vastaan rappeuttavat muutokset kanit polvinivelet. Kondrosyyttien apoptoosi-indeksi dhjst-ryhmässä vähenee merkittävästi verrattuna malliryhmään, mikä viittaa siihen, että kondrosyyttien apoptoosin estäminen saattaa olla yksi dhjst: n tärkeimmistä mekanismeista degeneratiivisia muutoksia vastaan.

aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet nivelen kondrosyyttien mikroympäristön hypoksisen luonteen. Mielenkiintoista, osteoartritic nivelet näkyvät edelleen vähentynyt happipitoisuus, rooli hypoksia aikana patogeneesi OA . Tuoreessa tutkimuksessa kuvattiin, että nivelen kondrosyyteissä katabolinen ja hypoksinen stressi ovat voimakkaita transkriptiotekijän HIF-1 indusoijia, joka on tärkein säätelijä solujen sopeutumisessa alhaiseen happipitoisuuteen. HIF-1 on ratkaisevan tärkeää eloonjäämisen ja kasvun pysäyttäminen kondrosyyttien aikana ruston kehityksen sekä energiantuotannon ja matriisi synteesi kondrosyyttien terveissä sekä osteoartritic ruston. Osteoartriittisessa rustossa HIF-1: n proteiinitasot lisääntyvät merkittävästi ja sen aktiivisuus korreloi rappeuttavien rustomuutosten vakavuuteen . Tämä teos dokumentoi transkriptiotekijän HIF-1α merkityksen hypoksisen nivelruston eheyden ylläpitämisessä. HIF-1α: n ylijäämätasot yhtyivät nivelen kondrosyyttien lisääntyneeseen apoptoosiin ja johtivat kanien polvinivelten degeneratiivisiin muutoksiin. DHJST: n antamisen jälkeen HIF-1α-lauseke vähenee verrattuna malliryhmän lausekkeeseen. Tulokset osoittavat, että dhjst: n vaikutus kondrosyyttien säätelytoimintaan saattaa HIF-1α: n toiminnan estämisen kautta.

on mielenkiintoista, että VEGF: n ja HIF-1α: n ilmaisun ero dhjst-ryhmän ja OSA-ryhmän välillä on merkittävä annostelun jälkeen. Useat tutkimukset ovat osoittaneet, että tietyt steroideihin kuulumattomat tulehduskipulääkkeet, kuten indometasiini, aiheuttavat HIF-1α-aktiivisuudesta riippumattomia anti-inflammatorisia vaikutuksia, koska indometasiini ei pystynyt estämään fosfatidyylinositoli-3-kinaasia tai solunulkoista signaalia säätelevää kinaasi/mitogeeniaktivoitua proteiinikinaasireittiä eikä Erk-aktiivisuutta . Indometasiini taas kykenee aktivoimaan peroksisomiproliferaattorilla aktivoitua reseptori-γ: ta, joka ei ole herkkä natriumsalisylaatille tai aspiriinille. Fosfatidyylinositoli-3-kinaasin tai Erk-reitin esto liittyy HIF-1α: n ja angiogeenisten tekijöiden estoon .

hypoksia ja erilaiset kasvutekijät / sytokiinit tehostavat VEGF-ekspressiota . VEGF ei ole vain yksi tärkeimmistä angiogeneesitekijöistä , mutta on mukana myös tulehduksellisissa prosesseissa OA: ssa ja edistää oireita, kuten kipua ja turvotusta kohdistamalla synoviaalikalvoihin, krooniset tulehdusvasteet liittyvät usein verisuonten proliferaatiota aiheuttavien angiogeenisten tekijöiden tuotantoon, ja nivelreumassa VEGF ilmaistaan hyvin synoviaalisoluissa . Koska mekaaninen ylikuormitus on yksi OA: n aiheuttavista tekijöistä, tutkimme sen vaikutusta VEGF: n ilmentymiseen kanin rustossa, että VEGF: n ilmentyminen vähenee dhjst: n antamisen jälkeen, tulos osoittaa, että DHJST voi suojata nivelrustoa tukahduttamalla VEGF: n ilmentymisen kondrosyyteissä (kuva 3).

5. Päätelmät

tähän mennessä dhjst: n bioaktiivisia ainesosia ei tunneta, mutta tutkimuksemme osoittaa, että dhjst: llä on merkittävä terapeuttinen vaikutus kaniinien OA: han, koska se estää kondrosyyttien apoptoosia ja säätelee VEGF: n, HIF-1α: n ilmentymistä kondrosyyteissä. Tämä tarjoaa tieteellistä näyttöä klinikalle DHJST: n soveltamiseksi OA: n hoidossa.

Rahoitus

Shanghain Luonnontieteellinen säätiö (apurahanumero: 08JC1418800).