Encephalitozoon cuniculi-kanta III on Enkefalitozoonoosin aiheuttaja sekä ihmisillä että koirilla

Abstrakti

Mikrosporidia ovat velvoittavia solunsisäisiä eukaryoottisia organismeja, joita esiintyy monenlaisissa selkärankaisissa ja selkärangattomissa isännissä. Encephalitozoon cuniculi on yleisesti todettu kotieläiminä kanit ja jyrsijät ja esiintyy myös koirilla, muut koiraeläimet, ja kädelliset, mukaan lukien ihmiset. Ribosomaalisten RNA-geenien DNA-sekvensointia on käytetty näiden loisten tunnistamiseen lajitasolle ja E. cuniculi-kantojen I, II ja III määrittämiseen. kahdeksan uutta koira-isolaattia luonnehdittiin Molekyylimenetelmien avulla E. cuniculi-kannaksi III. Tämä kanta on myös tunnistettu isolaateissa immuunipuutteisista ihmisistä, mikä viittaa tämän loislajin zoonoottiseen potentiaaliin. Pitkäaikainen mikrosporidiaalinen itiöemä alkaen oireeton koirat on myös raportoitu.

Encephalitozoon cuniculi on ”Microspora” – pääjaksoon kuuluva solunsisäinen alkueläin, joka on kotieläiminä pidettyjen kaniinien ja jyrsijöiden yleinen loinen. Satunnaisesti näitä loisia on raportoitu muissa isännissä, mukaan lukien koirat, siniketut (alopex lagopus), ja pieni määrä muita luonnonvaraisia lihansyöjiä . Yhä useammissa raporteissa kuvataan myös E. cuniculin aiheuttamaa kliinistä tautia ihmisillä, mutta tartunnan lähde(lähteet) ei ole tiedossa .

historiallisesti loisten identiteetti perustui morfologisiin ja joskus ultrarakenteellisiin ominaisuuksiin. Viime aikoina morfologisesti samankaltaisia Enkefalitotsoonisuvun jäseniä on specialisoitu ribosomaalisten RNA-geenien immunologisten ominaisuuksien ja molekyylisen karakterisoinnin avulla . E. cuniculin isolaatit on jaettu edelleen kantoihin I, II tai III, perustuen 4-emäsjärjestyksen (5′-GTTT-3′) toistojen määrään ribosomaalisen RNA-geenin sisäisellä transkriboidulla spacer (ITS) – alueella . Kaksi koiran E. cuniculi-isolaattia nimettiin kannaksi III sen perusteella, että niissä oli 4 sekvenssiä . Tämän jälkeen ⩾4 ihmisen isolaattia on tunnistettu kannaksi III (isolaatit ”Donovan” GenBank X98466, CDC:V282 ja IPZ:MX-H5) ja kannaksi I kahdessa Euroopassa tehdyssä raportissa . Tämä tutkimus ulottuu, että työ tunnistamalla 8 ylimääräistä koira isolaatteja E. cuniculi alkaen 4 taudinpurkaukset kuin kanta III. vaikka ei epidemiologiset tiedot ovat suoraan vahvistaneet koira-to-human transmission, molekyylitiedot viittaavat siihen, että koirat voivat toimia mahdollisina säiliöiden loisia. Lisäksi, pitkäaikainen irtoaminen itiöitä oireettomat koirat on dokumentoitu, edelleen vahvistaa todennäköisyyttä zoonoottisen tartunnan loinen.

materiaalit ja menetelmät

loisisolaatit

7 poikasen ruumiit 3: sta toisiinsa liittymättömästä pentueesta ja yhdestä koirasta toimitettiin 18 kuukauden aikana Texas Veterinary Diagnostic Laboratoryyn kuoleman jälkeistä arviointia varten. Eläimet olivat neljästä eri lähteestä Texasin eri alueilta. Kaikissa tapauksissa tehtiin diagnoosi enkefalitotsoonoosista histologisten löydösten perusteella. Eläinten tuoreista kudoksista todettiin kahdeksan loisisolaattia: 5 isolaattia saatiin 5-7 viikon ikäisten bostoninterrierin pentuetovereiden (2 urosta, 3 naarasta) aivojen tai munuaisten kudoksista, jotka kuolivat neurologiseen sairauteen (isolaatit 1-5, pentue 1). Isolaatti 6 oli peräisin 10-viikkoisen maltanterrieriuroksen aivoista, sillä se oli 1 4: stä neurologiseen sairauteen kuolleesta pentueesta (pentue 2). Isolaatti 7 oli peräisin neurologiseen sairauteen kuolleen 10-viikkoisen kääpiövillakoiran pennun (pentue 3) aivoista. Isolaatti 8 oli peräisin munuaisten vajaatoimintaan kuolleen 18 kuukauden ikäisen naarasmäyräkoiran munuaisesta (taulukko 1).

kuoleman jälkeen kudokset kerättiin aseptisesti ja homogenoitiin (Ten Broeck tissue homogenizer; Corning, Corning, NY) käyttäen PBS: ää, pH 7.2, plus 2× antibiootti-antimykoottinen liuos (Gibco, Gaithersburg, MD). Mikrosporidi-itiöt puhdistettiin isäntäkudoshomogenaatista aiemmin kuvatulla Percoll-tiheysgradienttimenetelmällä, jota muutettiin muuttamalla sentrifugointinopeus 600 grammaan . Mikrosporidia kasvatettiin RK-13-soluissa (ATCC CCL-37) käyttäen rpmi 1640-kasvualustaa, jota täydennettiin 5-prosenttisella sikiön naudan seerumilla ja 2× antibiootti-antimykoottisella liuoksella (Gibco), kuten edellä on kuvattu . Loisviljely ja DNA-analyysi tehtiin useiden kuukausien aikana eri tapausnäytteiden vastaanottamisen perusteella, joten satunnaisen ristikontaminaation mahdollisuus oli vähäinen.

DNA: n eristäminen

isolaateille 1-6 ja 8 kasvatettiin loisia lyhytkestoisessa viljelmässä, jotta saatiin riittävästi itiöitä molekyylien karakterisointia varten. Isolaatti 7: ää varten loiset puhdistettiin suoraan tuoreesta koiranpennun aivokudoksesta DNA-eristystä varten. Useimpien isolaattien DNA uutettiin puhdistetuista itiöistä Instagene-matriisin (BioRad, Hercules, CA) avulla valmistajan bakteeriviljelmille antaman protokollan mukaisesti . Osa isolaattien 6 ja 8 molekyylityöstä käsiteltiin edellä kuvatulla tavalla, ja DNA uutettiin itiöistä tavanomaisella fenolikloroformi-uuttomenetelmällä , jossa käytettiin osiointigeeli-mikrofugiputkijärjestelmää (light phase Lock Gel system; 5 Prime→3 Prime Manufacturer, Westchester, PA) DNA: n talteenoton optimoimiseksi. DNA saostettiin etanolilla, pelletti suspendoitiin uudelleen TE : ssä (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7.6) ja DNA-pitoisuus arvioitiin A260: A280-suhteilla UV-spektrofotometrian avulla (Ultraspec Plus; Pharmacia, Piscataway, NJ). Positiivisena kontrollina käytettiin Enkefalitotsooni hellemin kudosviljelmästä saaduista itiöistä eristettyä DNA: ta, ja reagenssilla pelkästään negatiivinen kontrolli sisällytettiin kaikkiin uutto-ja sekvensointireaktioihin.

pienen ribosomaalisen DNA: n (SSU rRNA) alayksikön

osa SSU rRNA-geenin 5′ – lopusta kustakin 8 isolaatista monistettiin käyttämällä primer-paria PMP1 ja PMP2, kuten aiemmin on kuvattu . Polymeraasiketjureaktio (PCR) kullekin isolaatille suoritettiin valmistajan ohjeiden mukaisesti (GeneAmp PCR-ydinreagenssit, N808-0009; Perkin-Elmer Cetus/Roche Molecular Systems, Branchburg, NJ). Vahvistus tehtiin lämpösyklissä (PTC-200 Peltier; MJ Research, Watertown, MA). Kun ensimmäinen denaturointi kesti 5 min 95°C: ssa, jokaiseen 25-µL: n reaktioon lisättiin Taq-polymeraasia (0,5 U). Tämän jälkeen näytteille tehtiin 35 denaturointisykliä (94°C, 30 s), hehkutus (60°C, 30 s) ja laajennus (72°C, 1 min), minkä jälkeen 10 minuuttia 72°C: ssa lopullista laajentamista varten. Epäkorporoitumattomat nukleotidit poistettiin kromatografiakolonnien avulla (Micro Bio-Spin 30; Bioradi). Näytteitä pidettiin 4°C: ssa, kunnes ne käsiteltiin automaattiseen sekvensointiin.

DNA-analyysi ITS-alueesta

osa kunkin isolaatin ribosomaalisen RNA-geenin ITS-alueesta monistettiin PCR: llä int530f-ja int580r-primeriparilla käyttäen edellä kuvattuja monistusmenetelmiä. Tuloksena oleva PCR-tuote sekvensoitiin automatisoidulla DNA-sekvensserillä (malli 377; Perkin-Elmer Applied Biosystems/Roche Molecular Systems, Branchburg).

DNA automated sequencing

PCR-amplified DNA of each isolate was amplified for automated sequence with a commercial kit (ABI Prism Big Dye Terminator Cycle Sequencing Ready-Reaction Kit; Promega, Madison, WI) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Kaikki reaktiot suoritettiin termosyklaattorilla (MJ Research Minicycler). Tämän jälkeen näytteille tehtiin 35 denaturointisykliä (94°C, 30 s), hehkutus (60°C, 30 s) ja laajennus (72°C, 1 min), minkä jälkeen 10 minuuttia 72°C: ssa lopullista laajentamista varten. Jatkotuotteet puhdistettiin kromatografiakolonneilla (Micro Bio-Spin; BioRad), kuivattiin tyhjiösentrifugissa (Savant Instruments, Holbrook, NY) ja varastoitiin -20°C: ssa, kunnes ne sekvensoitiin automatisoidulla sekvensserillä (Perkin-Elmer 377 ABI Applied Biosystems).

kohdistusohjelmiston (Sequencher; Gene Codes, Ann Arbor, MI) avulla SSU rRNA-geenin osalle saatiin konsensussekvenssejä ∼265 emästä jokaista loisisolaattia kohti. Nämä sekvenssit arvioitiin homologisesti NCBI Genbankin tietokannassa aiemmin ilmoitettuja Enkefalitotsoonisekvenssejä vastaan yksinkertaisella BLASTN-haulla.

kaksijuosteinen DNA heteroduplex mobility assay

isolaatti 6: n DNA monistettiin PCR: llä primer-parilla int530f ja int580r, kuten aiemmin on kuvattu . PCR-monistetut tuotteet määritettiin heteroduplexes ja homoduplexes sukupolven käyttäen aiemmin ominaista isolaatteja E. cuniculi eri isännistä.

tulokset

kudosviljelmässä todettiin yhteensä 8 loisisolaattia 4: stä erillisestä kliinisestä Taudinpurkauksesta. Sekä valon mikroskooppiset piirteet että loisten in vitro-kasvuominaisuudet viittasivat siihen, että ne olivat E. cuniculi, mikroporidiaani, jota on aiemmin raportoitu koirilla sekä muilla isännillä. Kunkin isolaatin SSU rRNA-geenin 5′ lopun osittainen sekvensointi (GenBank AF144246-AF144253) vahvisti loisten identiteetin E. cuniculiksi, koska kaikki näytteet osoittivat 100% homologiaa aiemmin julkaistujen sekvenssien kanssa (GenBank L39107dEZORGOA, L17072¦EZORGSMALL; X98470¦ECDSSRR2).

Heteroduplex-analyysi ja ribosomaalisen RNA-geenin its-alueen sekvensointi luonnehtivat edelleen kaikkia koiran isolaatteja kannaksi III, mikä vahvistaa aiemmat raportit hienoisista vaihteluista E. cuniculi-isolaattien välillä eri jyrsijöistä, kaneista ja ihmisisännistä. Kuvassa 1 esitetään DNA: n homoduplex-muodostuminen koiran isolaatin 6 ja aiemmin luonnehditun kannan III isolaatin välillä sekä heteroduplex-muodostuminen isolaatin 6 ja muiden E. cuniculi-kantojen välillä.

Keskustelu

useiden E. cuniculi-kantojen biologista merkitystä ei ole vielä selvitetty; kyky erottaa loiskannat voi kuitenkin tarjota välineen infektiolähteiden jäljittämiseen epidemiologisissa tutkimuksissa. Molekyylitietomme 8 mikrosporidiaani-isolaatin tunnistamisesta koirista E. cuniculi-kannaksi III sopivat yhteen aiemman tutkimuksen kanssa, jossa 2 koira-isolaattia luokiteltiin kannaksi III . Kanin, hiiren ja ketun isolaatteja on raportoitu kantoina I tai II . Nämä tiedot viittaavat siihen, että kanta III saattaa liittyä pääasiassa koiriin. Ihmisen isolaatit on tunnistettu kannaksi III läntisellä pallonpuoliskolla ja kannaksi I Euroopassa . Vaikka ihmisen altistuksen lähde(lähteet) E. cuniculi ei ole tiedossa, on yhä enemmän todisteita siitä, että eläimet voivat toimia tartuntapesäkkeinä, ja on olemassa mahdollisuus zoonoottiseen organismin siirtymiseen eläinten ja ihmisten välillä. On mielenkiintoinen mahdollisuus, että maantieteelliset ja kulttuuriset erot lemmikkieläinten omistuksessa voivat vaikuttaa ihmisten altistumiseen, koska koirat ovat yleisiä lemmikkejä Yhdysvalloissa, kun taas kaneja pidetään usein lemmikkeinä tai ruokana Sveitsissä ja muissa Euroopan maissa.

kliinisesti normaaleilta Bostoninterrierin vanhemmilta ja pentueen 1 yhdeltä pennulta otettujen uloste-ja virtsanäytteiden tutkiminen osoitti, että itiöpesäkkeitä oli vähän ⩾4 kuukauden ajan pentuetovereiden kuoleman jälkeen (isolaatit 1-5; julkaisemattomat tiedot). Tämä havainto viittaa myös mahdolliseen mekanismiin loisten suoralle tai epäsuoralle siirtymiselle koirista ihmisiin paikallisten ympäristöjen saastumisen kautta koiran virtsan ja ulosteen eritteillä. Vaikka yhdessäkään epidemiologisessa tutkimuksessa ei ole arvioitu Lemmikkien omistuksen/altistumisen ja ihmisen mikrosporidiaalisten infektioiden välistä yhteyttä, yksittäisessä tapauksessa, jossa lapset altistuivat koiranpennuille, joilla oli selvä enkefalitotsoonoosi, yksi kolmesta lapsesta serokonverttasi . Muita E. cuniculi-isolaatteja eri isännistä on analysoitava, jotta voidaan arvioida edelleen riskiä ylläpitää mahdollisesti tartunnan saaneita lemmikkejä kotitalouksissa, joissa immuunipuutteisilla henkilöillä on suuri mikrosporidiaalisten infektioiden riski.

kiitokset

Kiitämme Texas Veterinary Medical Diagnostic Laboratoryn patologeja Jay Hoffmania, Joanne Mansellia ja Bruce Abbittia koirien kudosten toimittamisesta tähän tutkimukseen.

,

g ,

,

,

,

.

,

,

, vol.

(pg.

–

)

,

,

.

,

,

, vol.

(pg.

–

)

,

,

,

,

.

,

,

, vol.

(pg.

–

)

,

h ,

,

,

.

,

,

, vol.

(pg.

-35)

,

,

.

,

,

, vol.

(pg.

–

)

4)