tulokset
HlyA-indusoitu hemolyysi vaatii Purinergisten reseptorien aktivointia.
α-hemolysiiniä (HlyA) tuottavan E. coli–kannan Ard6 lyses hevosen, ihmisen ja hiiren erytrosyytit (Kuva. 1). Kuvassa 1 on HlyA: n aiheuttama hemolyysi ajan funktiona. Time-lapse kokeet hiiren ja ihmisen erytrosyyttejä kiinnitetty coverslips paljasti, että HlyA-indusoima hemolyysi on peräkkäinen prosessi. Ensimmäisten 20 minuutin aikana HlyA indusoi punasolujen krenaatiota solujen kutistumisen seurauksena, minkä jälkeen solujen tilavuus kasvoi asteittain ja lopulta lyysi (viikunat. 1A ja 1b, elokuva S1). Tämä peräkkäinen kutistuminen ja turvotus pätee myös yksisoluisella tasolla. Punasolujen eri populaatiot eivät siis kutistu tai turpoa, vaan yksi punasolu kutistuu ensin ja turpoaa sitten HlyA-sovelluksen seurauksena. Erytrosyyttisuspensio (1, 25%) inkuboitiin laimealla E. coli−supernatantilla (50 µl · ml-1). Kolmen testatun lajin erytrosyytit osoittivat huomattavaa eroa HlyA-vasteessa (Kuva. 1C), joilla on alhaisin herkkyys HlyA: lle ihmisen erytrosyyteissä. Kaikissa seuraavissa kokeissa lisätyn E. coli-supernatantin määrä säädettiin siten, että 60 minuutin inkubaation jälkeen saadaan ≈50% hemolyysiä.
α-hemolysiinin aiheuttama hemolyysi hevosen, hiiren ja ihmisen punasoluissa. A) E. coli-bakteeria (ARD6, serotyyppi OK:K13) sisältävän α-hemolysiinin vaikutus:H1) supernatantti ihmisen punasoluissa, jotka ovat kiinnittyneet peitinkalvoon 10, 20 ja 60 minuutin inkubaation jälkeen 37 °C: ssa (KS.myös elokuva S1). (B) yhteenveto tiedoista. Krenatoitujen erytrosyyttien (avoimet pylväät) ja lysoitujen erytrosyyttien (pistepylväät) kokonaismäärä ajan kuluessa analysoituna kuvasekvensseinä, jotka on kerätty 60 minuutin aikana taajuudella 0, 1 Hz (N = 8 ihmistä). (C) yleinen hemolyysi näkyy optisen tiheyden kasvuna 540 nm: ssä (OD540), mikä heijastaa liuoksen hemoglobiinipitoisuutta. Erytrosyyttejä inkuboitiin supernatantilla E. coli-bakteerilla (50 µl·ml-1) 0-60 minuutin ajan. N = 5, 7 ja 6 hevoseläimille, hiirille ja ihmisille.
käytämme yleensä suodatettua E. coli (ARD6) – supernatanttia hemolyysin indusoimiseen, ellei toisin mainita. Tämä lähestymistapa valittiin sen varmistamiseksi, että tuloksemme pätisivät myös in vivo, kun HlyA vapautuu E. coli-bakteerista yhdessä useiden muiden aineosien kanssa. Kun valitsimme tämän lähestymistavan, meidän oli kuitenkin tarkistettava, että HlyA-bakteeria tuottavan kolibakteerin aiheuttama hemolyysi voitiin itse asiassa katsoa HlyA-bakteerin aiheuttamaksi. Siksi puhdistimme Hlyan ARD6-kulttuuristamme. Puhdistuksen jälkeen puhdistetun HlyA: n suspensio erotettiin 5-15-prosenttiseen natriumdodekyylisulfaattigeeliin (SDS). Coomassie R-värjäyksen jälkeen ilmestyi yksi 100 kDa-yhtye, ja massaspektroskopia tunnisti yhtyeen HlyA(Kuva. S1 A ja B). Lisäkontrollina käytimme supernatanttia E. coli-kannasta D2103, joka on ei-patologinen E. coli-laboratoriokanta, joka ei tuota HlyA-bakteeria. Näiden bakteerien supernatantti ei aiheuttanut hemolyysiä ihmisen, hiiren tai hevosen punasoluissa (Kuva. S1D). Lisäksi vertasimme havaintojamme Hlya ystävällisesti toimittamia Prof. Sucharit Bhakdi, Mainzin yliopisto, Saksa(aktiivisuus 10 ng * ml−1 ≈50% hemolyysiä varten, kuva. S2). Seuraavassa, kun puhdistettu HlyA mainitaan, se viittaa tähän valmisteeseen. HlyA: n biologisen aktiivisuuden ensimmäisissä testeissämme huomasimme, että ATP-raadonsyöjä apyraasi esti täysin hlya-indusoidun hevosen erytrosyyttien hemolyysin. Tämä havainto oli todella yllättävä, sillä se viittasi solunulkoiseen ATP: hen, jota tarvitaan HlyA-bakteeria tuottavan E. colin aiheuttamaan hemolyysiin. Koska solunulkoinen ATP on signalointimolekyyli, joka aktivoi P2-reseptoreita, havaintomme voivat viitata siihen, että vallitseva huokosmalli HlyA-indusoituneelle hemolyysille saattaa olla yksinkertaistus. Siksi testasimme ATP: n haaskauksen tehoa perusteellisemmin. Havaitsimme, että apyraasi esti täysin paitsi hevosen myös hiiren ja ihmisen erytrosyyttien hemolyysin (Kuva. 2 A). Lisäksi heksokinaasi, joka hajottaa adenosiinitrifosfaatin (ATP) nopeasti adenosiinidifosfaatiksi (ADP), vähensi hlya-indusoitua hemolyysiä hiiren ja ihmisen punasoluissa pitoisuudesta riippuvalla tavalla (Kuva. 2b). Tämän havainnon todensi puhdistettu HlyA (Kuva. 2B, pikkukuva). On syytä huomata, että ihmisen erytrosyyteissä sekä apyraasi että heksokinaasi voimistivat hlya-indusoitua hemolyysiä pienemmillä pitoisuuksilla. Ero saattaa viitata siihen, että P2-reseptorin ilmentymismalli punasoluissa on erilainen eri lajien välillä.
ektoatpaasit ja purinergiantagonistit estävät punasolujen hlya-indusoimaa hemolyysiä. E. coli supernatantti (60 minuuttia) indusoi hemolyysiä ihmisen (neliö), hiiren (täynnä piireissä), ja hevosen (avoin piireissä) punasolujen. A) ATP–raadonsyöjäapyraasin pitoisuus-vastekäyrät. Pikkukuvassa on edustava kuva hiiren punasolujen supernatantista, johon on kohdistettu HlyA 0, 1, 2, 5 tai 10 U ml−1 apyraasin läsnä ollessa. (B) Heksokinaasin vaikutus ihmisen, hiiren ja hevosen punasolujen hlya-indusoimaan lyysiin; pikkukuva osoittaa heksokinaasin (10 U ml−1) vaikutuksen puhdistetun HlyA: n aiheuttamaan hemolyysiin hiiren ja ihmisen erytrosyyteissä). (C) epäselektiivisten P2-reseptoriantagonistien Ppad-reseptorien vaikutus kaikkien kolmen lajin punasolujen hlya-indusoituun lyysiin. D) PPAD: n pitoisuus–vastesuhde puhdistetun HlyA: n eri pitoisuuksina ihmisen punasoluissa. Hemolyysiksi mitattiin od540. Arvot ovat keskiarvo ± sem; n = 5-13.
tämän löydöksen relevanssin varmistamiseksi oli tärkeää selvittää, vaikuttivatko P2-reseptoriantagonistit HlyA: n aiheuttamaan hemolyysiin. Epäselektiivisen P2-reseptorin antagonistin PPAD: n pitoisuus-riippuu HlyA-bakteeria tuottavan E. colin aiheuttamasta hemolyysistä hevosen, hiiren ja ihmisen erytrosyyteissä (Kuva. 2C). PPAD-yhdisteiden EC50-arvo oli 520 µM, 400 µM ihmisen, hiiren ja hevosen punasolujen osalta 180 µM. Tämä havainto vahvistettiin kaikkien HlyA-pitoisuuksien osalta (Kuva. 2D) testattu ihmisen punasoluissa, jotka altistettiin puhdistetulle HlyA: lle. Pitoisuus-vastesuhde oli yhteensopiva kilpailevan antagonismin kanssa, ja on huomattava, että P2-reseptorin salpaaja vähensi jopa maksimaalisten toksiinipitoisuuksien vaikutusta. P2-reseptorin aktivaatio näyttää siis liittyvän HlyA: n aiheuttamaan hemolyysiin. Epäselektiivinen P2-reseptorin salpaaja suramiini vähensi myös pitoisuudesta riippuvasti HlyA-indusoitua hemolyysiä kaikilla kolmella lajilla (tietoja ei ole osoitettu). Suurempina pitoisuuksina suramiini aiheuttaa kuitenkin dramaattista erytrosyyttien kutistumista, joten se ei välttämättä sovellu P2-reseptorin vaikutuksen arviointiin punasoluissa.
arvioidaksemme, johtuiko purinergiantagonistin vaikutus hemolyysiin pelkästään lisääntyneestä osmolaliteetista, testasimme solunulkoisen sakkaroosin vaikutusta HlyA: n aiheuttamaan hemolyysiin (tietoja ei näy). Sakkaroosi (1 mM) vähensi vain hieman hemolyysiä (5, 1% ± 1, 7%), kun taas 10 mM: n ja 75 mM: n sakkaroosi vähensi huomattavasti hemolyysiä (28.5% ± 5.0%, 82.8% ± 5.2%). Koska tässä tutkimuksessa käytettyjen antagonistien ja Atpaasien pitoisuudet eivät koskaan ylittäneet 1 mM: tä, vaikutus ei voi johtua lisääntyneestä osmolariteetista. Tuloksemme eivät myöskään heijastaneet epäselektiivistä sitoutumista antagonistien ja myrkyn välillä. Tätä testattiin hevoseläinten erytrosyyteissä, jotka esiinkuboitiin HlyA: lla 10-15 minuutin ajan 37 °C: ssa tai 30 minuutin ajan 4 °C: ssa, pestiin perusteellisesti ja suspendoitiin uudelleen antagonistien kanssa tai ilman niitä. Koska HlyA on sisällytetty kalvoon preincubaation aikana, erytrosyytit etenivät lyysiin vapaan HlyA: n puuttuessa. Kuva. S2 osoittaa, että erilaiset farmakologiset toimenpiteet vähensivät hemolyysiä sen jälkeen, kun HlyA oli sitoutunut erytrosyytteihin. Antagonistit olivat kuitenkin tehottomampia, kun ne lisättiin pestyihin punasoluihin, joissa Lyytinen prosessi oli jo aloitettu.
mitkä P2-reseptorit osallistuvat HlyA: n aiheuttamaan hemolyysiin?
erytrosyytit ilmentävät erityyppisiä P2-reseptoreita. P2-reseptoreita, joiden on raportoitu ilmentyvän kypsissä ihmisen punasoluissa, ovat P2Y1 (14), P2Y2 (15), P2Y13 (15), P2X1 (15) ja P2X7 (16), kun taas p2y1, P2X1, P2X4 ja P2X7 näyttävät olevan punasolujen kantasoluissa (17). Testataksemme, mitkä näistä purinergisistä reseptoreista osallistuvat HlyA: n aiheuttamaan hemolyysiin, käsittelimme kyseisiä reseptoreita erikseen. Koska P2Y1-reseptori liittyy sorbitolin indusoimaan hemolyysiin plasmodium-infektoituneissa ihmisen ja hiiren erytrosyyteissä (14), testasimme, oliko tämä reseptori vastuussa HlyA-indusoidusta hemolyysistä. P2Y1-reseptorin salpaaja MRS2179 ei vaikuttanut HlyA: n aiheuttamaan hemolyysiin (Kuva. S3A) pitoisuuksina (jopa 500 µM), jotka ylittävät hemolyysin estämiseen tarvittavan määrän Plasmodium berghei– infektoituneissa erytrosyyteissä (14). Koska p2y2-reseptoreille ei ole spesifisiä antagonisteja, tutkimme HlyA: n vaikutusta siirtogeenisillä hiirillä. HlyA-indusoitu hemolyysi oli samanlainen punasoluissa p2y2−/ – ja p2y2+/+ hiirillä (Kuva. S3B). Testasimme p2y13: n tapauksessa antagonistia MRS2211, jonka on raportoitu osoittavan jonkin verran selektiivisyyttä P2Y13-reseptoria kohtaan (18). MRS2211 vähensi HlyA-indusoitua hemolyysiä merkittävästi ihmisen ja hiiren erytrosyyteissä (Kuva. S3C). Tämä havainto on ristiriidassa tuloksemme kanssa heksokinaasi (hajottaa ATP: tä ADP: ksi), jonka pitäisi pikemminkin stimuloida kuin estää ADP-herkkää P2Y13-reseptoria. Siksi heksokinaasin ja MRS2211: n pitäisi antaa vastakkaisia tuloksia, jos p2y13-reseptori on mukana. Koska näin ei ole, P2y13-reseptori on epätodennäköinen ehdokas HlyA: n aiheuttamaan hemolyysiin osallistuvalle P2-reseptorille. Emme voi sulkea pois sitä mahdollisuutta, että MRS2211: n tuottama inhibitio välittyy toisen P2-reseptorin kautta.
tämä jättää periaatteessa huomioon vain P2X-reseptorit. Kuva. 3a osoittaa, että P2X-reseptorien epäselektiivinen salpaaja Evans blue vähensi voimakkaasti HlyA-indusoitua hemolyysiä, mikä viittaa siihen, että P2X-reseptori osallistuu tähän hemolyysiin. Erytrosyytteinä ilmaistuista P2X-reseptoreista pidimme p2x7: ää HlyA-indusoidun hemolyysin todennäköisimpänä välittäjänä seuraavista syistä. P2x7-reseptorien tiedetään käyvän läpi siirtymisen suurempaan läpäisevyystilaan, mikä johtaa lopulta lyysiin tietyissä soluissa (12). P2x7-reseptorin on raportoitu olevan vuorovaikutuksessa kanavaproteiini pannexin1: n (12) kanssa, ja kompleksi luo suuria huokosia, jotka läpäisevät suuremmat molekyylit, kuten etidiumbromidin (13). Panneksin1 ilmaistaan ihmisen punasoluissa (19) ja sitä on äskettäin ehdotettu ATP: n vapautuskanavaksi erytrosyyteissä (20). Testataksemme, osallistuvatko P2X7-reseptorit HlyA-indusoituun hemolyysiin, käytimme antagonisteja, joilla on suhteellinen selektiivisyys P2X7: lle: Brilliant Blue G (BBG), ATP-2′,3′-dialdehydi (OxATP) ja KN-62 (21). Kaikkien antagonistien pitoisuus – riippuu hemolyysin vähenemisestä hevosen, hiiren ja ihmisen erytrosyyteissä (Kuva. 3). Hevosen ja ihmisen punasolut olivat herkempiä kaikille testatuille aineille kuin hiiren punasolut. Tässä yhteydessä on mainittava, että hiiren P2X7-reseptorin tiedetään olevan vähemmän herkkä kn-62: lle kuin ihmisen reseptorin (22). Suoja P2X-reseptoriantagonismin aiheuttamaa hemolyysiä vastaan vahvistettiin jälleen puhdistetun HlyA: n koko pitoisuusalueella ihmisen erytrosyyteissä käyttämällä BBG: tä esimerkkinä p2x7-antagonistista (Kuva. 3D). Antagonistilla on jälleen huomattava vaikutus HlyA: n aiheuttamaan hemolyysiin jopa alle HlyA-pitoisuuksien, jotka aiheuttivat suurimman hemolyysin. Oksatp: n hemolyysin esto varmistettiin puhdistetulla HlyA: lla hiiren ja ihmisen erytrosyyteissä (Fig. 3 E, pikkukuva). Uusi selektiivinen, kilpaileva P2X7-reseptoriantagonisti A438079 vähensi hemolyysiä ihmisen erytrosyyteissä, mutta oli tehottomampi hiiren erytrosyyteissä (Kuva. 3 F). Plasman kalvofraktioiden immunoblotit p2x7-reseptorille vahvistavat, että ihmisen ja hiiren erytrosyytit ilmentävät merkityksellisen kokoista proteiinia (66 kDa, Kuva. 3G, ja kokonaisuudessaan viikuna. S4B). P2X-reseptorien suhteellinen osuus HlyA-indusoidussa hemolyysissä vaatii lisätutkimuksia. Nykyisillä työkaluillamme emme voi sulkea pois muiden P2X-reseptorien vaikutusta HlyA-indusoituneeseen hemolyysiin millään tutkituista lajeista.
P2x7-reseptoriantagonistit estävät HlyA: n aiheuttamaa hemolyysiä. HlyA-induced hemolysis in human (neliöt), hiiri (täytetyt ympyrät), ja hevonen (avoimet ympyrät). Hlya: ta tuottavan E: n aiheuttama hemolyysi. coli-bakteeria vähensivät a) Evansinisen, b) KN-62: n ja C) Briljanttisinisen G: n (BBG) pitoisuudet. D) BBG: n pitoisuudesta riippuva vaikutus puhdistetun HlyA: n eri pitoisuuksina. ATP-2′,3′-dialdehydi (Oksatp) (e) vähensi myös HlyA-bakteeria tuottavan E. colin ja puhdistetun toksiinin (inset, OxATP, 500 µM) aiheuttamaa hemolyysiä. F) selektiivinen p2x7-antagonisti A438079 vaikutti pääasiassa ihmisen punasoluihin. Arvot ovat keskiarvo ± sem, n = 5-13. G) Immunoblotit, joissa on C-terminaalinen vasta-aine p2x7-reseptoria vastaan (laimennus 1:200). Vasemmassa paneelissa on samanlainen läikkä peptidin esiadsorption kanssa.
viikuna. S4A osoittaa hlya-indusoidun hemolyysin hiiren (p2x7+/+ ja P2X7−/−) punasoluissa. Hiiren erytrosyytit osoittavat samanlaista hemolyysiä HlyA – vasteessa genotyypistä riippumatta. P2x7 – / – Hiiret ja p2x7 + / + – hiiret olivat alun perin Pfizerin tuottamia, ja ne palautettiin BALB / c-taustalle. Emme havainneet eroja hlya-indusoidun hemolyysin herkkyyden välillä punasoluissa, jotka on eristetty BALB / c-ja c57bl / 6-hiiristä (tietoja ei näy), vaikka c57bl/6-kannalla tiedetään olevan geneettinen vaihtelu P2X7-reseptorin C-terminuksessa (23). Nämä tiedot vastaavat a438079: n vähäistä vaikutusta hiiren punasoluihin ja p2x7-reseptorin vähäistä proteiiniekspressiota hiiren punasoluihin (viikunoihin). 3F ja 3G).
nämä tulokset viittaavat siihen, että hiiren punasolujen hlya-indusoimaan hemolyysiin osallistuu ainakin yksi P2-reseptori lisää. Koska P2X1: llä ja P2X7: llä on samanlaiset inhibiittoriprofiilit BBG: lle, KN-62: lle ja OxATP: lle (24), testasimme P2X1-antagonistit MRS2159 ja NF449. MRS2159-pitoisuus-riippuu hemolyysin estymisestä erytrosyyteissä hevosella (EC50:150 µM) ja hiirellä (EC50: ≈250 µM). Ihmisen erytrosyytit olivat suhteellisen epäherkkiä antagonistille, mutta yli 250 µM: n pitoisuudella näimme pienen ja tilastollisesti merkittävän vähenemisen (Kuva. 4 A). Tämä vaikutus oli paljon voimakkaampi, jos puhdistettua HlyA käytettiin (Kuva. 4c). Tämä tarkoittaa, että solujen vasteessa voi olla eroja sen suhteen, altistuvatko ne HlyA: lle puhtaassa muodossa vai yhdessä muiden E. coli-ainesosien kanssa. Nf449-pitoisuus-riippuu ihmisen HlyA-indusoiman hemolyysin (Kuva. 4b). NF449 oli paljon tehottomampi hiiren punasoluissa, ja hiiren P2X1-reseptori oli suhteellisen resistentti tälle inhibiittorille (25). On korostettava, että vaikka NF449 on suramiinijohdannainen, se ei aiheuttanut samoja tilavuusmuutoksia punasoluissa kuin suramiini. P2X1-reseptorin immunoblottien tiedetään esiintyvän jopa 4 kaistaa eri kudoksissa; 45 kDa ei-glykosyloitu, 60 kDa glykosyloitu ja 95/120 kDa-kaista, joka saattaa olla reseptorin polymeroitunut muoto (26, 27). Käsissämme P2X1-reseptorin vasta-aine tunnisti johdonmukaisesti 45 KD: n kaistan ja hyvin heikon 60 kDa: n kaistan hiiren ja ihmisen erytrosyyttien plasmakalvojen bloteissa (Kuva. 4D). Mielenkiintoista, huomasimme, että ilmaisutaso 60 kDa bändi oli paljon korkeampi P2X7−/− hiirillä verrattuna kontrolleihin (samanlainen kolmessa valmisteessa, Fig. 4D). Tässä immunoblotissa proteiinitasoja säädetään, jotta vältetään p2x7−/− hiirten kaistojen ylikuormitus, jolloin p2x7+/+ – hiirillä 60 kDa: n alue jää lähes havaitsematta. Tämä P2X1-reseptorin näennäinen säätely saattaa mahdollisesti kätkeä hemolyyttisen fenotyypin p2x7–reseptoripuutteisista hiiristä. Yhdessä nämä tiedot tukevat hypoteesia, että sekä P2X1 että P2X7-reseptori ovat merkityksellisiä HlyA-indusoituneen hemolyysin kannalta. Tuloksemme viittaavat merkittäviin lajien välisiin vaihteluihin, joissa p2x7-reseptori on tärkeämpi hemolyysille ihmisen erytrosyyteissä.
P2X1-antagonistien (MRS2159 ja NF449) vaikutus HlyA-indusoituun hemolyysiin hevoseläinten, hiiren ja ihmisen punasoluissa. A) punasoluja inkuboitiin HlyA-bakteeria sisältävällä supernatantilla E. coli-bakteerilla ja mrs2159-pitoisuuksilla (keskiarvo ± sem, n = 7-8). B) punasoluja inkuboitiin puhdistetulla HlyA: lla ja nf449: n pitoisuuksilla (keskiarvo ± sem, N = 5-6). C) 250 µM: n mrs2159: n vaikutus puhdistetun HlyA: n aiheuttamassa hemolyysissä. D)immunoblottaus P2X1-reseptoriin kohdistuvalla vasta-aineella (laimennettu 1:200); oikeassa paneelissa on yhdensuuntainen läikkä peptidin esiadsorption kanssa. Proteiinieristys ja immunoblottaus toistettiin kolme kertaa, ja tulokset olivat samanlaiset.
Pannexin1-salpaajat estävät Hlya-indusoidun hemolyysin.
Karbenoksolonia (28), meflokiinia ja probenesidia (30) on käytetty antagonisteina, joilla on suhteellinen selektiivisyys panneksiini1. Karbenoksoloni vähensi merkittävästi hemolyysin tasoa kaikilla kolmella yhtä herkällä lajilla (Kuva. 5 A). Karbenoksolonin vaikutusta testattiin jälleen koko hlya-pitoisuuksien (puhdistettu toksiini, Fig. 5B), joka myös osoittaa huomattavia vaikutuksia suurimmilla HlyA-pitoisuuksilla. Meflokiinia ja probenesidia testattiin vain hiirillä ja humaaneilla erytrosyyteillä. Meflokiinin EC50-arvo oli 25 µM ihmisen ja 18 µM hiiren punasoluissa. Probenesidi esti hemolyysiä ihmisen erytrosyyteissä, EC50: n ollessa 2 mM, mutta oli tehottomampi hiiren erytosyyteissä. Viime aikoina tunnettujen Cl-kanavan antagonistien NPPB: n ja niflumiinihapon on osoitettu estävän myös panneksiinikanavia (31). Molemmat aineet vähensivät HlyA-indusoitua hemolyysiä, jolla on huomattavasti voimakkaampi vaikutus ihmisen erytrosyytteihin (Kuva. S5).
HlyA-indusoidun hemolyysin ihmisen, hiiren ja hevosen punasoluissa. Hemolyysiä indusoi E. colin sisältämä HlyA-supernatantti. Karbenoksoloni (a) vähensi hemolyysiä pitoisuudesta riippuvaisesti, mikä myös vähensi puhdistetun HlyA: n aiheuttamaa hemolyysiä useilla pitoisuuksilla (B). Hlya: ta tuottavan E: n aiheuttama hemolyysi. kolibakteeria vähensivät myös meflokiini (C) ja probenesidi (D). Arvot ilmoitetaan keskiarvona ± sem; n = 5-13.