Experimental and Therapeutic Medicine

Introduction

bronkiaalinen astma on krooninen tulehduksellinen ilmasairaus, johon liittyy monia tulehdussoluja ja välittäjiä. T-solut, erityisesti T-auttaja (Th)1 ja Th2. on ratkaiseva rooli hengitystieinfektioiden vähentämisessä astmaattisilla potilailla (1). Komplisoituneet immuunivasteet voivat aiheuttaa Th1-puutosta ja th2-hyperaktiivisuutta, mikä johtaa th1/Th2-epätasapainoon. Tämä epätasapaino edistää immunoglobuliinin (Ig)Esekreetiota ja herkistää mastosyyttien ja eosinofiilien toimintaa muuttuneen sytokiinierityksen kautta sekä aiheuttaa allergista tulehdusta ja hengitystien reaktioherkkyyttä (2,3).Interferoni (IFN)-γ ja interleukiini (IL)-4 ovat tyypillisiä th2: n sytokiineja.

astmapotilailla jatkuva ilmainflammaatio aloitetaan antigeenia esittelevillä soluilla (APC), jotka yhdistävät eri allergeenit T-solujen signaaliksi ja alustavat sitä seuraavan immuunivasteen (4,5).T-solujen aktivoituminen edellyttää signaaleja, jotka käynnistetään thetcr-kompleksin ja erilaistumisryppään (CD)28 kautta. Kypsät Dendritic-solut (MDC-solut) ilmentävät suuria määriä moleculatorisia moleculesCD80: tä ja CD86: ta, jotka antavat signaalin, joka tarvitaan käynnistämään T-solujen aktivaatio, laajeneminen ja differentaatio viainteraction cd28: n kanssa (6). Aikaisemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että CD80-ja CD86-pitoisuudet ovat koholla astmaa sairastavilla potilailla (7, 8).

aiemmissa tutkimuksissa,joissa tutkittiin astmamalleja, inhalaatiosumutteiden on osoitettu indusoivan Th2-polarisaatiota, suurentavan IL-4SECRETIONIA, vähentävän IFN-γ: n tuotantoa ja indusoivan eosinofiilista tulehdusreaktiota (9,10). Tutkimukset, joissa tutkitaan Cd80: n ja CD86: n kaatumisen vaikutuksia DCs: ssä T-auttajasolujen erilaistumiseen ja sytokiinieritykseen astman uriinimalleissa, puuttuvat kuitenkin.

tässä tutkimuksessa cd80: n ja Cd86-molekyylin ekspressio DCs: ssä estettiin suppressiolla käyttäen pientä häiritsevää RNA: ta (siRNA), ja cd80: n ja CD86: n knockdownin vaikutuksia th1 / Th2: n tyypillisten sytokiinien IFN-γ: n ja IL-4: n ekspressiotasoihin arvioitiin. Näin ollen tutkittiin CD80: n ja CD86: n mahdollisuuksia RNA-interferenssin (RNAi) kohteena astman terapeuttisessa kohdentamisessa.

materiaalit ja menetelmät

Eläimet

yhteensä 20 tervettä spesifistä patogeenitöntä gradeBALB / C-hiirtä (6-8 viikkoa; keskipaino, 18±2 g) ostettiin Sun Yat-Senin yliopiston koe-eläinten keskuksesta(Guangzhou, Kiina). Kokeet tehtiin Sun Yat-SenUniversity-Eläintutkimuskomitean hyväksymien toprotokoolien mukaisesti.

Astmamallit

yhteensä 20 hiirtä satunnaistettiin kahteen ryhmään: i) astmaattinen ryhmä ja ii) normaali kontrolli group.In astmaatikkojen ryhmässä jokainen hiiri herkistyi ovalbumiinille (OVA; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) intraperitoneaalisesti päivinä 1, 14 ja 21, 100 µg munasoluja, jotka emulgoitiin 20 mg: aan alunaa (Guangzhou Chemical Reagent Co., Guangzhou, Kiina). Sen jälkeen hiirille altistettiin aerosolialtistus 5% munasoluja 30min / vrk ilmatiiviissä säiliöissä (mitat 50×50×50 cm) päivinä 28-34. Normaalissa kontrolliryhmässä hiiret herkistettiin ja altistettiin edellä kuvatulla tavalla vastaavalla määrällä suolaliuosta MUNASOLUPROTEIINILIUOKSEN sijasta. 24 tunnin kuluttua viimeisestä altistuksesta hiiret lopetettiin hyväksytyllä kaularangan sijoiltapoistamismenetelmällä, jonka suoritti ammattitaitoinen ja täysin koulutettu henkilöstö. Näytteet poistettiin ja kiinnitettiin 10-prosenttiseen etanoliin 24 tunnin ajan.näytteet kuivatettiin, upotettiin parafiiniin ja värjättiin hematoksyliinillä ja eosiinilla edellä kuvatulla tavalla (11). Patologisia muutoksia keuhkoputkissa ja kudoksissa arvioitiin Nikon Eclipse Ti lightmicroscope – tutkimuksessa (Nikon Corporation, Tokio, Japani).

luuydinjohdannaisten erottaminen

kaikki hiiret lopetettiin kaularangan sijoiltaan 24h viimeisen haasteen jälkeen. Luuydintä huuhdeltiin emursista ja sääriluusta RPMI – 1640-viljelyaineella (Gibco; ThermoFisher Scientific, Inc., Waltham, MA, Yhdysvallat). 250 × g: n pitoisuudessa 5 minuutin ajan tapahtuneiden pitoisuuksien jälkeen soluja käsiteltiin punaverisolun (RBC) hajoamispuskurilla (CWBio Co., Ltd., Beijing, Kiina), pesty fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella (PBS), sentrifugoitu 250 × gfor 5 min ja viljelty rpmi-1640: ssä täydennettynä rekombinanttimakulosyyttien makrofagikasvustotekijällä (rmGM-CSF;Peprotech, Inc., Rocky Hill, NJ, USA; 10 ng/ml), ja rmIL-4(Peprotech; 10 ng / ml) käytettiin puolestaan. 6 päivän viljelyn jälkeen lisättiin 1µg / ml lipopolysakkaridia (LPS; Sigma-Aldrich), ja kiinnittymättömät MDC: t korjattiin 7.päivänä. DCs värjättiin 4°Cforissa 30 min fluoreseiini-isotiosyanaatilla (FITC)-konjugoitu hamsteri anti-CD11c (5 µg/ml; 11-0114), phycoerytrin (PE)-konjugoitu hamsteri anti-CD80 (5 µg/ml; 12-0801), FITC-konjugoiturat anti-CD86 (5 µg/ml; 11-0862) ja PE-konjugoitu rotta anti-majorhisto-yhteensopivuuskompleksi (MHC) II (5 µg/ml; 12-5322; allebioscience, Inc., San Diego, CA, USA) monoklonaaliset vasta-aineet, ja ne analysoitiin myöhemmin virtaussytometrialla (BD Facsvere; BDBiosciences, Franklin Lakes, NJ, USA) merkityn antigeeniekspression positiivisen ilmentymisnopeuden määrittämiseksi.

siRNA ja transfektio

erityiset siRNA-sekvenssit (taulukko I), jotka kohdistuivat CD80: een ja CD86: een, suunniteltiin ja valittiin gu et al(12) – menetelmien mukaisesti. Kaikki siRNA ostettiin Shanghai GenePharma Co., Ltd. Shanghai, Kiina). Transfectionstep suoritettiin valmistajan protokollan mukaisesti forLipofectamine 2000 (Invitrogen; Thermo Fisher Scientific, Inc.).DCs: ää viljeltiin lyhyesti verensiirtoa edeltävänä päivänä 24 kuopan kudosviljelylevyllä, jonka voimakkuus oli 1×105 solua/kuoppa. Topreparate lipid-siRNA complexes, 3 µl Lipofektamiini 2000 wasincubated in 50 µl Opti-MEM (Gibco; Thermo Fisher Scientific, Inc.) huoneenlämmössä 5 min, ja 12 µl osoitettua sirnaa yhdistettiin samanaikaisesti 50 µl Opti-memiin. Tämän jälkeen dilutedlipofektamiini 2000 ja siRNA sekoitettiin ja inkuboitiin vielä 20 min huoneenlämmössä kompleksinmuodostusta varten.Tämän jälkeen kompleksi inkuboitiin DCs:n kanssa 24-kaivolevyssä 37°C:ssa 5% kostutetussa CO2: ssa ilman ilmakehässä 6 tunnin ajan. kun cotransfektio suoritettiin, kuhunkin kaivoon lisättiin vastaavat määrät cd80 siRNA: Lipofektamiini 2000 ja CD86 siRNA: Lipofektamiini 2000komplekseja. FAM-munakokkelia-sirnaa käytettiin negatiivisena kontrollina transfektiotehokkuuden määrittämiseen. Transfektoitujen DCs: ien ryhmiä perustettiin kolme: ei-siRNA-ryhmään lisättiin ainoastaan Lipofektamiini 2000, eikä Anysirnaa lisätty DCs: ään. Sirna-ryhmässä MDC: t valittiin CD80 – ja CD86-spesifisten sirnan mukaan. NegativesiRNA-ryhmässä mDCs transfektoitiin ei-spesifisellä ei-targetingFAM-sirnalla, jolla ei ole homologiaa kohdennettujen RNA: iden kanssa.Kokeet tehtiin kolmena kappaleena kutakin näytettä kohti.Transfektion tehokkuus määritettiin fluoresenssikemikroskopialla (Nikon Eclipse Ti, Nikon Corporation) ja havaittiin byvirtaussytometrialla.

käänteistranskriptio-kvantitatiivipolymeraasiketjureaktio (RT-qPCR)

cd80-ja CD86 mRNA-lauseketasojen arvioimiseksi transfektion jälkeen suoritettiin RT-qPCR. Primer sekvenssit (taulukko II) suunniteltiin genbank ja syntetisoitiin daan Gene Co., Ltd. Sun Yat-SenUniversity (Guangzhou, Kiina). 24 tunnin kuluttua verensiirron jälkeen 1×106 DCs: n kokonaisrna uutettiin Trizolireagenssilla (Invitrogen;Thermo Fisher Scientific, Inc.) ja käänteiskopioituna ja vahvistettuna käyttäen QuantiTect SYBR Green RT-PCR kitiä (Qiagen GmbH,Hilden, Saksa) Roche LightCycler 480: ssä (Roche Diagnostics,Basel, Sveitsi). Vahvistukset tehtiin valmistajan SYBR Green RT-PCRkit-kvantitatiivia koskevan protokollan mukaisesti (Takala, Japani). Vahvistusolosuhteet olivat 40 sykliä 93°C 3 min, 93°C 30 S, 55°C 45 S ja 72°C 45 SC. jokainen näyte annettiin jokaiseen kolmeen kuoppaan. Relativegene expression levels were calculated using the quantificationcycle (Cq) method with normalization to glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase (GAPDH) as the reference gene using 2−∆∆Cq(13).

Virtaussytometria

cd80: n ja cd86: n positiivisten ilmentymisnopeuksien havaitsemiseksi DCS: ssä transfektion jälkeen virtaussytometria suoritettiin MHC II / CD11c-portissa cd80: lle ja CD86: lle. Kuusi tuntia verensiirron jälkeen DCs pestiin kahdesti PBS: llä ja inkuboitiin fluoresoivalla vasta-aineella 4°C: ssa 30 minuutin ajan.Tämän jälkeen solut pestiin uudelleen PBS: llä ja kiinnitettiin 10 g/l paraformaldehydiin. Seuraavia hiiren antimonoklonaalivasta-aineita käytettiin: PE-anti-MHC II, FITC-anti-CD11c, PE-anti-CD80 ja FITC-anti-CD86, kuten edellä on mainittu. Kaikki virtaussytometriset analyysit tehtiin käyttäen IgG – isotyyppisiä kontrolleja.

T-solujen erotus

perna poistettiin, kun hiirille oli tehty kohdunkaulan sijoiltaanmeno. T-solut erotettiin käyttämällä henkilökohtaista lymfosyyttien Erotusväliainetta valmistajan Protocolin (Dakewe Biotech Co., Ltd., Kiina). Kennotiheys muutettiin 1×109/l: ksi ennen jatkokäsittelyä.

sekamuotoinen lymfosyyttireaktio (MLR)

astmaattisen hiiren luuytimestä johdettuja DCs-soluja(1×104/kuoppa) ja terveitä T-soluja (1×105 / kuoppa) viljeltiin yhdessä in96-kuoppalevyissä suhteessa 1:10. Rinnakkaisviljelyjärjestelmät jakaantuivat kolmeen ryhmään: i) ei-siRNA-ryhmään, ii) siRNA-ryhmään, andiii) negatiiviseen siRNA-ryhmään, jolloin edellä kuvatuista vastaavista ryhmistä tuli DCs. Seuraavaksi jokaiseen kuoppaan lisättiin munasoluja, joiden afinaalipitoisuus oli 10 mg / l ja kokonaistilavuus 200 µl. Kennoja inkuboitiin 37°C: ssa 5%: n kostutetussa CO2-ilmastossa 72 tunnin ajan.

entsyymi-immunologiset määritykset(Elisa)

supernatantti kerättiin 3 päivän samanaikaisen viljelyn jälkeen. IFN-γ-ja IL-4-tasot analysoitiin Elisa kitsspectiven avulla IFN-γ: lle ja IL-4: lle (Dakewe Biotech Co., Ltd.) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Absorbanssiarvot luettiin 450 nm: ssä Multiskan MK3: lla (Thermo Fisher Scientific, Inc.).

tilastoanalyysi

Tilastoanalyysit tehtiin spssoftwaren versiolla 13.0 (SPSS, Inc., Chicago, IL, Yhdysvallat). Tiedot esitetään keskiarvona ± keskihajonta (SD). Tutkimukset suoritettiin kolmena kappaleena kullekin hiirelle. Ryhmien väliset tilastolliset vertailut suoritettiin yksisuuntaisella varianssianalyysillä, ja ryhmän sisäiset vertailut suoritettiin Student ’ St-testillä. Ryhmien välisiä eroja pidettiin tilastollisesti merkittävinä, kun P<0, 05.

tulokset

astmaattinen malli

20 tervettä SPF-luokan BALB / C-hiirtä luokiteltiin astmaattisiin ja normaaleihin verrokkiryhmiin, joissa kussakin oli 10 hiirtä. Allmice arvioitiin lopullisessa analyysissä ilman kokeellista eläimellistä häviötä. Keuhkokudospatologian mukaan munasolu-immunisoiduilta hiiriltä saadut keuhkojen osastot osoittivat selkeää hengitystietulehdusta peribronkiolaarisilla ja perivaskulaarisilla infiltraateilla. Nämä infiltraatit koostuivat pääasiassa eosinofiileistä ja lymfosyyteistä,ja keuhkoissa ilmeni keuhkoputkien limakalvon ja sileän lihaksen paksuuntumista, limanerityksen lisääntymistä, hengitysteiden epiteelisolujen irtoamista, airwaystenoosia ja lunginterstitiumissa hajallaan olevia tulehdussoluja. Normaalista kontrolliryhmästä peräisin olevissa sektioissa ei havaittu merkittäviä patologisia muutoksia. Representativehistopatologiset tiedot on esitetty kuvassa.1.

solun pintamolekyyliekspressio bymDCs

cd11c: n, CD80: n ja CD86: n ilmentymistasot DC-pinnoilla havaittiin fluoresenssilla aktivoidulla solulajittelulla(FACS). astmaatikkoryhmän MDC-arvot ilmaistiin CD11c-arvolla, joka oli verrattavissa normaalin kontrolliryhmän vastaavaan tasoon; näiden kahden ryhmän välillä ei havaittu merkittävää eroa (p>0, 05). Astmaattiryhmässä CD80-ja CD86-ekspressiotasot olivat kuitenkin huomattavasti korkeammat verrattuna normaaliin kontrolliryhmään (p<0, 05; Kuva. 2).

Vuosituhattavoitteiden siirto

CD80 – ja CD86-spesifiset siRNA-rakenteet siirrettiin onnistuneesti vuosituhattavoitteisiin. Transfektoidut MDC: t havaittiin fluoresenssimikroskoopilla 6 tuntia transfektion jälkeen.FACS: n havaitsema sirnan transfektiotehokkuus oli ~75% (Kuva. 3).

cd80: n ja CD86: n proteiiniekspressio transfektion jälkeen

transfektion jälkeen CD80: n mRNA-ja cd86: n proteiiniekspressioarvot transfektoiduissa vuosituhattuotteissa havaittiin RT-qPCR-analyysissä 24 tunnin kohdalla ja Faksanalyysissä 72 tunnin kohdalla. RT-qPCR: n havaitsemat Cd80 ja CD86 mRNA-lauseketasot osoittivat, että cd80 mRNA-lauseketasot muissa kuin siRNA -, siRNA-ja negativesiRNA-ryhmissä olivat 2,09±0,46, siRNA-ja sirna-ryhmissä 0,60±0,17 ja 2,04±0,93 ja CD86 mRNA-lauseketasot olivat 3,58±0,20, 0,91±0,48 ja 2,83±0,83. Factsin toimittamat tiedot osoittivat, että cd80-proteiinin positiiviset ilmentymisnopeudet olivat siRNA-ryhmässä 82, 45±15,80, 79±7, 07 ja siRNA-ryhmässä 81, 83±10, 07% ja CD86-proteiinipositiiviset ilmentymisnopeudet olivat 89, 45±10, 22, 27, 29±6, 99 ja 87, 66±11.74%. MRNA-ekspressiotaso ja proteinpositiiviset ilmentymisnopeudet osoittivat vertailukelpoisia tuloksia. Ei-siRNA-ryhmän ja thenegatiivisen siRNA-ryhmän välillä ei ollut merkittävää merkitystä (P>0, 05). CD80: n ja CD86: n ilmentyminen sirna-ja proteiinitasoilla väheni huomattavasti verrattuna ei-siRNA-ja negatiivisten siRNA-ryhmien ilmentymiseen(p<0, 05; viikunat. 4 ja 5). Tämä osoittaa, että siRNA-targetedinterferenssi voi merkittävästi tukahduttaa CD80-ja CD86 mRNA-japrotein-ilmaisutasot.

IFN-γ-ja IL-4-eritystä T-soluissa viljeltiin MDC-pitoisuuksilla

72 tunnin koeviljelyn jälkeen, IFN-γ-ja IL-4-tasot mDC-ja T-soluviljelyjärjestelmän supernatantissa havaittiin ELISA-menetelmällä. IFN-γ-ilmentymä lisääntyi merkittävästi siRNA-ryhmässä (132, 73±25, 04 pg/ml) verrattuna thenon-siRNA-ryhmään ja negatiiviseen siRNA-ryhmään (72, 56±26, 30 ja 80, 21±24, 42 pg/ml; p<0, 05), kun taas ei-siRNA-ja negatiivisten siRNA-ryhmien välillä ei havaittu merkittäviä eroja(P>0, 05). IL-4: n ilmentymätasot pienenivät merkittävästi siRNA-ryhmässä (93, 04±23,13 pg/ml) verrattuna ei-sirna-ja negatiivisiin siRNA-ryhmiin (150, 69±29, 50 ja 163, 19±25, 36 pg/ml; p<0, 05), kun taas ei-siRNA-ja negatiivisten siRNA-ryhmien välillä ei havaittu merkittäviä eroja(p>0, 05; kuva. 6).

Keskustelu

keuhkoastma on krooninen tulehduksellinen ilmasairaus, johon liittyy erilaisia tulehdussoluja, kuten mastosoluja, eosinofiilejä, lymfosyyttejä ja muita solukomponentteja (14-17).Th1/Th2-epätasapaino on keskeinen astman vaikeusasteeseen vaikuttava tekijä (18). APCs: llä,mukaan lukien DCs, makrofagit ja B-solut (19), on ratkaiseva rooli T-solujen stimuloinnissa (3). Niistä DC on voimakkainapc, joka edistää primaarista ja sekundaarista immuunivastetta,mukaan lukien allerginen immuniteetti. Kypsät DCS-yhdisteet (mDCs), joissa on suuri apustimuloivien molekyylien cd80 ja CD86 ekspressio, voivat aktivoida T-soluja, kun taas epäkypsät dendriittisolut (IDC), joiden ilmentymistaso on alhainen CD80 ja CD86, vaimentavat T-soluvastetta ja indusoivat immuunitoleranssia (20,21). Dcsiinipotilaiden, joilla on astma, on osoitettu olevan hyperaktiivisia (22).

CD80 ja CD86 ovat kahta proteiinityyppiä, jotka ilmentyvät APC: n pinnalla ja jotka toimivat yhdessä T-solujen aktivoinnin ja survivalaation edellyttämien eostimuloivien signaalien tuottamiseksi. Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että kostimuloivien molekyylien CD80 ja CD86 ekspressiotasot mDC: n pinnalla liittyvät läheisesti Th2-solureaktioon ja hengitystietulehdukseen(23,24). Astmapotilailla cd80: tä ja CD86: ta voimakkaasti ilmentävät MDC: t voivat stimuloida aiemmin hoitamatonta CD4+-auttaja-T-solujen aktivaatiota erilaistumaan Th2-soluja kohti,jolloin th1/Th2-epätasapaino syntyy. Tämän jälkeen Th1-sytokiinien, kuten IFN-γ: n, riittämättömyys sekä T2-sytokiinien, kuten IL-4: n ja IL-5: n, lisääntynyt eritys aiheuttavat seosinofiilisen tulehduksen ja allergisen hengitystietulehduksen(10,24,25). Th2-solun aktivaation edistämiseen tarvitaan kaksi signaalia(26-28). Ensimmäinen signaali on sellaisten MDC-kompleksien muodostuminen mDC-pinnalle,jotka sitoutuvat spesifisesti T-solun reseptori-CD3-reseptorikompleksiin T-solujen pinnoilla, ja toinen signaali on ko-stimuloiva molekyyliekspressio ja funktionaalinen aktivaatio MDC-pinnoilla, jotka sitoutuvat erityisesti naiivien T-solujen reseptoreihin; nämä kaksi signaalia muodostavat co-stimulatorypathwayn (29). On myös osoitettu, että on olemassa kolmas signaali (30), koska tietyt DCs: n tuottamat solumolekyylit, kuten kateenkorvan strooman lymfopoietiini (TSLP), vaikuttavat TH-solujen erilaistumiseen. Kaikkien edellä mainittujen signaalien joukossa cd80 / CD86-CD28-rinnakkaisstimulaatiopolku on kuitenkin klassisin ja tärkein. Aikaisemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että CD80 / CD86-CD28-rinnakkaisstimulaatioreitti voi olla tehokas kohde astman hoidossa osoittamalla, että monoklonaalisen vasta-ainelähestymistavan (cd80/CD86) esto voi estää tulehdusta astmaattisilla hiirillä (25). Lisäksi cd80/CD86co-stimulaatioreitin tukahduttaminen antisensiteettioligonukleotideilla voi tukea hengitysteiden hyperaktiivisuutta (31).

RNAi on geenin hiljentävä ilmiö, jossa endogeeniset tai eksogeeniset kaksijuosteiset Rnat laukaisevat homologisen mRNA: n hajoamisen ja aiheuttavat vastaavien funktionaalisten fenotyyppien häviämisen. Sen jälkeen, kun Fire ym. (32) löysivät tekniikan ensimmäisen kerran vuonna 1998, tekniikkaa on kehitetty edelleen korkean spesifisyyden ja tehokkuuden saavuttamiseksi. Rnaiteknologian terapeuttinen soveltaminen on aihe, joka on viime vuosina herättänyt suurta kiinnostusta lääketieteelliseen ja kliiniseen perustutkimukseen.RNAi: n kykyä estää virulenttia geeniekspressiota on käytetty laajalti erilaisten sairauksien (33-35) hoitoon.Myös useat tutkimukset ovat ilmoittaneet, että RNAi voidaan käyttää inDCs diagnosoida ja hoitaa keuhkoastma (36-39).Darcan-Nicolaisen et al (40) havaitsivat, että kaksi merkittävää allergisen astman merkkiä in theOVA-indusoitu astma hiiri-mallissa, jotka ovat hengitysteiden tulehdus jahyperactivity, paranivat merkittävästi signaalianturilla ja aktivaattorilla transkriptio 6 (STAT6) äänenvaimennus ilmatiepiteelisoluissa käyttämällä siRNA-nenätippoja.Moriwaki et al (41) osoitti, että siRNA-välitteinen suppressori sytokiini signalointi 3(SOCS3) geenin hiljentäminen voisi tukahduttaa hengitysteiden reaktiivisuus jaeosinofiilinen infiltraatio, joka indusoi allergisestimulaatio astmaatikoilla hiirillä. Zheng et al (42) havaitsi, että siRNA: n käyttö oli mahdollista estää tyrosiiniproteiinikinaasin (TPK) geenin ilmentymistä astmaattisten hiirten DCs: ssä, mikä tukahdutti DCS: n toimintakyvyn antigeenia esittelevinä soluina ja esti siten T-solujen aktivoitumista ja erilaistumista. Tutkimukset, jotka koskevat siRNA-välitteisen CD80-ja CD86-knockdownin vaikutuksia DCS: ssä T-solujen erilaistumiseen astmaattisilla hiirillä, puuttuvat kuitenkin. Tässä tutkimuksessa cd80: n ja CD86: n mRNA: ta ja proteiinin ilmentymistä hiiren bonemarrow-johdetussa DCs: ssä onnistuttiin vähentämään CD80 – ja cd86-kohdistetulla sirnalla, mikä todensi RNAi: n tehokkuuden.

tässä tutkimuksessa käytettiin astmaattista hiirimallia, joka vahvistettiin aiemmin ilmoitettujen menetelmien mukaisesti(43). Tulokset osoittivat, että astmaatikkoryhmältä saaduissa inhalaatiosumutteissa Cd80-ja CD86-ekspressiotasot olivat koholla, mikä merkitsee sitä, että cd80/Cd86-kapasiteetti voi olla kohonnut astmapotilailla. Kun vuosituhattavoitteet siirrettiin cd80-ja CD86-kohdennetulla siRNA: lla, cd80: n ja CD86: n RNA-ekspressiotasot ja proteiinipositiiviset ilmentymisnopeudet pienenivät merkittävästi, mikä vahvisti siRNA-lähestymistavan estävän vaikutuksen cd80-ja CD86-stimulaattorimolekyyleihin transkriptiotasolla ja translaatiotasolla. Inhalaatiosumutteiden ja T-solujen rinnakkaisviljelyn supernatantissa RNAi aiheutti IFN-γ-ekspression lisääntymistä ja ofIL-4-tasojen vähenemistä,mikä osoittaa, että cd80-ja CD86-komstimuloivien molekyylien ilmentymisen väheneminen inhalaatiosumutteissa heikensi cd80/CD86-CD28-kostimulaatioreittiä astmaattisissa hiirissä. RNAi vaikutti myös Th1 / Th2-sytokiinien ilmentymiseen, mikä osoittaa, että alkuperäinen Th1 / Th2-epätasapaino oli muuttunut ja näin ollen immunetoleranssi aiheutui. Nämä havainnot osoittavat, että CD80 ja Cd86 voivat olla mahdollisia kohteita RNAi: n sovellukselle astman hoidossa ja tarjota uuden väylän astman geeniterapialle.

tunnustukset

tätä tutkimusta tuettiin avoimilla hankkeilla,jotka sai valtion Key Laboratory of Respiratory Disease (Guangzhou, Kiina) (apuraha nro 2007da80154f1107).

	Locksley RM: Astma ja allergiatulehdus. Solu. 140:777–783. 2010. Katso Artikkeli: Google Scholar : PubMed / NCBI
	Holgate ST: synnynnäiset ja adaptiiviset immuunivasteet astmassa. Nat Med. 18:673–683. 2012. Katso artikkeli: Google Scholar: PubMed/NCBI
	Larché M, Robinson DS and Kay AB: The roleof T lymphocytes in the patogenesis of astma. J Allergia ClinImmunol. 111:450–464. 2003. Katso Artikkeli: Google Scholar : PubMed/NCBI
	Lambrecht BN ja Hammad H: endriittisten ja epiteelisolujen rooli allergiatulehduksen pääsäätelijöinä. Lancet. 376:835–843. 2010. Katso artikkeli: Google Scholar: PubMed/NCBI
	Holt PG and Upham JW: the role ofdendriittiset solut astmassa. Curr Opin Allergia Clin Immunol. 4:39–44.2004. Katso Artikkeli: Google Scholar : PubMed/NCBI
	Lim TS, Goh JK, Mortellaro a, Lim CT,Hämerling GJ ja Ricciardi-Castagnoli P: CD80 ja Cd86 säätelevät eri tavoin T-solujen mekaanista vuorovaikutusta antigeenejä esittelevien dendriittisolujen kanssa ja B-soluja. PLoS Yksi.7:. Katso artikkeli: Google Scholar: PubMed/NCBI
	Wong CK, Lun SW, Ko FW, Ip WK, Hui DS andLam CW: Plasman ja solujen pinnan eostimuloivat molekyylit ctla-4, CD28 ja CD86 lisääntyivät aikuispotilailla, joilla on allerginen astma. Clin Exp Immunol. 141:122–129. 2005.Katso artikkeli: Google Scholar: PubMed/NCBI
	Shi HZ, Xie ZF, Deng JM, Chen YQ ja XiaoCQ: liukoinen CD86-proteiini astmapotilaiden seeruminäytteissä.Rintakehä. 59:870–875. 2004. Katso artikkeli: Google Scholar: PubMed/NCBI
	Van Rijt LS ja Lambrecht BN: Dendriticcells in astma: toiminto kuin herkistyminen. Clin Exp Allergia.35:1125–34. 2005. Katso artikkeli : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Van Rijt LS, Vos n, Willart M, Kleinjan a,Coyle AJ, Hoogsteden HC and Lambrecht BN: Essential role ofdendritic cell CD80/CD86 costimulation th2-efektorivasteen induktiossa, mutta Eiaktivoitumisessa hiirimallissa astmassa.J Allergia Clin Immunol. 114:166–173. 2004. Katso Artikkeli: Google Scholar : PubMed/NCBI
	Wu SG, Wang GL, Li LY and Ji J: Effects ofmicroRNA-21 on the interleukin12/signal transducer and Activator of transkription 4 signalointireitti in astmatic mice. Sentti Euroa JImmunol. 39:40–45. 2014. Katso artikkeli: Google Scholar: PubMed/NCBI
	Gu X, Xiang J, Yao Y and Chen Z: Effectsof RNA interferenssiä CD80: ssä ja CD86: n ilmentymistä bonemarrow-johdetuissa hiiren dendriittisoluissa. Scand J Immunol. 64:588–594.2006. Katso artikkeli: Google Scholar: PubMed/NCBI
	Livak KJ and Schmittgen TD: Analysis ofrelative gene expression data using real-time quantitative PCR and 2−∆∆Ct method. Menetelmä. 25:402–408. 2001. Katso artikkeli: Google Scholar: PubMed/NCBI
	Fanta CH: astma. N Engl J Med.360:1002–1014. 2009. Katso Artikkeli: Google Scholar : PubMed/NCBI
	Lambrecht BN ja Hammad H: Lung dendriticcells in respiratory virus infection and ASTM: from protection toimmunopathology. Annu Rev. Immunol. 30:243–270. 2012. Katso artikkeli: Google Scholar: PubMed/NCBI
	Wenzel SE: Asthma phenotypes: Theevolution from clinical to molecular approaches. Nat Med.18:716–725. 2012. Katso Artikkeli: Google Scholar : PubMed/NCBI
	Hansel TT, Johnston SL ja Openshaw PJ:mikrobeja ja limakalvojen immuunivasteita astmassa. Lancet.381:861–873. 2013. Katso artikkeli: Google Scholar: PubMed/NCBI
	Compalati E, Braido F ja Canonica GW: anupdate on allergen immunoterapia ja astma. Olen Pahoillani.20:109–117. 2014. Katso Artikkeli: Google Scholar : PubMed/NCBI
	Goyvaerts C, Dingemans J, De Groeve K,Heirman C, Van Gulck E, Vanham G, De Baetselier P, Thielemans K,Raes G ja Breckpot K: Ihmisantigeenin kohdentaminen solusubstituutioita. J Virol. 87:11304–11308. 2013. Katso artikkeli: Google Scholar: PubMed/NCBI
	Reise Sousa C: dendriittisiä soluja kypsyysasteessa. Nat Rev. Immunol. 6:476–483. 2006. Katso Artikkeli: Google Scholar : PubMed / NCBI
	Gill MA: dendriittisten solujen rooli inasthma. J Allergia Clin Immunol. 129:889–901. 2012. Katso artikkeli: Google Scholar: PubMed/NCBI
	Shi JH, LI YG ja LI TS: endriittisten solujen roolit antigeenin esityksessä ja asthman patogeneesi. Zhonghua Jie He He Hu Xi Za Zhi. 28:22–27. 2005.(InChinese). PubMed/NCBI
	Wong CK, Lun SW, Ko FW, Ip WK, Hui DS andLam CW: plasman ja solujen pinta-stimuloivien molekyylien Ctla-4, CD28 ja CD86 lisääntynyt ilmentyminen aikuispotilailla, joilla on allerginen astma. Clin Exp Immunol. 141:122–129. 2005.Katso artikkeli: Google Scholar: PubMed/NCBI
	Bellou A and Finn PW:Costimulation: Critical pathways in the immunologic regulation of asthma. CurrAllergy Astma Rep. 5: 149-154. 2005. Näytä Artikkeli : Google Scholar: PubMed/NCBI
	Chen YQ ja Shi HZ: CD28/CTLA-4-CD80/Cd86 and ICOS-b7rp-1 costimulatory path in bronkiaalinen astma. Allergia.61:15–26. 2006. Katso artikkeli: Google Scholar:PubMed/NCBI
	Bieber T, Novak N, Herrmann N and Koch s: Role of Dendritic cells in atopic dermatitis: An update. Clin RevAllergy Immunol. 41:254–258. 2011. Katso Artikkeli: Google Scholar : PubMed/NCBI
	Hespel C ja Moser M: tulehdussolujen rooli synnynnäisessä ja adaptiivisessa immuniteetissa. EUR J Immunol.42:2535–2543. 2012. Katso artikkeli: Google Scholar: PubMed/NCBI
	Novak N: an update on the role of humandendritic cells in patients with atopic dermatitis. J Allergia ClinImmunol. 129:879–886. 2012. Katso Artikkeli: Google Scholar : PubMed/NCBI
	Lombardi V, Singh AK and Akbari O: costimulatory molecules in allergic disease and astma. IntArch Allergia Immunol. 151:179–189. 2010. Katso artikkeli: Google Scholar: PubMed/NCBI
	Zhang Y, Zhou X ja Zhou B: DC-derivedTSLP edistää Th2-polarisaatiota LPS-pohjustetussa allergisessa ilmatilassa. EUR J Immunol. 42:1735–1743. 2012. Katso Artikkeli: Google Scholar : PubMed/NCBI
	Crosby JR, Guha M, Tung D, Miller DA,Bender B, Condon TP, York-DeFalco C, Geary RS, Monia BP, Karras JGand Gregory SA: Inhaled CD86 antisense-oligonukleotidi tukahduttaapulmonaalinen tulehdus ja hengitysteiden hypervasteherkkyys allergiahoidossa. J Pharmacol Exp Ther. 321:938–946. 2007. Katso artikkeli: Google Scholar: PubMed/NCBI
	Fire a, Xu S, Montgomery MK, Kostas SA,Driver SE ja Mello CC: Voimakas ja spesifinen geneettinen häiriö kaksijuosteisella RNA: lla Caenorhabditis elegansissa. Luonto.391:806–811. 1998. Katso artikkeli: Google Scholar: PubMed/NCBI
	Ghafouri-Fard S: siRNA ja cancerimmunoterapia. Immunoterapia. 4:907–917. 2012. Katso artikkeli: Google Scholar: PubMed/NCBI
	Gavrilov K and Saltzman WM: TherapeuticsiRNA: Principles, challenges and strategies. Yale J Biol Med.85:187–200. 2012.PubMed/NCBI
	Yan WJ, Xu SJ, Xie MM ja Wu Bl: eksogeenisen syklisen dimeerisen guanosinemonofosfaatin vaikutus Streptococcus mutansin geneekspressioon. Zhongguo Zu Zhi GongCheng Yan Jiu. 16:1451–1454. 2012.(Kiinaksi).
	Lee CC, Huang HY ja Chiang BL:Lentiviraalivälitteinen interleukiini-4 ja interleukiini-13 Rnainterferenssi vähentää hengitysteiden tulehdusta ja hypervastetta.Hum Gene Ther. 22:577–686. 2011. Näytä Artikkeli : Google Scholar: PubMed/NCBI
	Li Y, Sun M, Cheng H, Li S, Liu L, Qiao H,Hua s ja Lu J: IL-23: n ilmaisun hiljentäminen pienellä hiusneulalla suojaa hiirillä astmaa vastaan. Käyt.Viim. 43:197–204. 2011.Katso artikkeli: Google Scholar:PubMed/NCBI
	Woska JJ and Gillespie ME: Small-interfering RNA-mediated identification and regulation of theeternary SNARE complex mediating RBL-2h3 mast cell degranulation.Scand J Immunol. 73:8–17. 2011. Katso artikkeli: Google Scholar:PubMed/NCBI
	Lu XX, McCoy KS, Xu JL, Hu WK ja Chen HB: Small interfering RNA targeting T-cell Ig mucin-3 decreasesallergic airway inflammation and hyper responsiveness. Tulehdus.36:582–591. 2013. Katso artikkeli : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Darcan-Nicolaisen Y, Meinicke H, Fels G,Hegend O, Haberland a, Kühl a, Loddenkemper C, Witzenrath M, KubeS, Henke W ja hamelmann E: Pieni häiritsevä RNA: n vastatranscriptiotekijä STAT6 estää allergista hengitystieinfektiota ja hyperreaktiivisuutta hiirillä. J Immunol. 182:7501–7508. 2009.Katso artikkeli : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Moriwaki A, Inoue H, Nakano T, MatsunagaY, Matsuno Y, Matsumoto T, Fukuyama s, Kan-O K, Matsumoto K,Tsuda-Eguchi M, et al: t-Soluhoito pienillä häiritsevillä rnaforisuppressorilla sytokiinin signalointi 3 moduloi allergisia ilmareseptejä hiiren astman mallissa. Am J Respir Cell Mol Biol.44:448–455. 2011. Katso artikkeli: Google Scholar: PubMed/NCBI
	Zheng YH, Lu JJ, Guo ZL, Ren T ja LiangYJ: Small interfering RNAS specific for pernatyrosiinikinaseinhibit maturity of Dendritic cells of asthmic mice in vitro.Zhongguo Hu Xi Yu Wei Zhong Jian Hu Za Zhi. 8:487–491. 2009.(InChinese).
	Li JG, Zhuansun YX, Ran PX, Zhang W, MoXN, Wu h ja Li YQ: CD4+CD25+ regulatory T-solujen vaikutukset luuytimen mesenkymaalisten kantasolujen vaikutuksiin ja ilmavirtainflammaatioon astmaattisilla hiirillä. Zhongguo Zu Zhi Gong Cheng Yan Jiu.12:9302–9305. 2008.(Kiinaksi).