2.38.6.1.1 Solid-Liquid Extraction (SLE)
SLE on yksinkertaisin menetelmä biologisten aktiivisten yhdisteiden erottamiseksi luonnollisista lähteistä. Se koostuu kohdeyhdisteiden passiivisesta uuttamisesta diffuusiolla kohti uuttoliuotinta. Tärkeimmät parametrit, jotka voivat vaikuttaa SLE: hen, ovat liuottimen ja raaka-aineen suhde, uuttolämpötila ja liuottimen koostumus. Viimeisen parametrin osalta vihreät liuottimet ovat osoittaneet erittäin positiivisen vasteen useiden bioaktiivisten yhdisteiden uuttamisessa SLE-menetelmissä. SLE: n tärkeimmät käyttökohteet vihreillä liuottimilla viittaavat fenoliyhdisteiden uuttamiseen, vaikka nämä liuottimet ovat tehokkaita myös muunlaisten bioaktiivisten aineiden, kuten hiilihydraattien ja lipidien, uuttamisessa. Taulukossa 1 on tiivistetty joitakin viimeisten viiden vuoden aikana julkaistuja esimerkkejä vihreitä liuottimia käyttävien bioaktiivisten aineiden SLE: stä.
Taulukko 1. Tavanomaiset uuttomenetelmät, joissa käytetään ympäristöystävällisiä liuottimia
| liuotin | tutkittavana oleva elintarvike tai ainesosa | uuttomenetelmä | erottelu/määritysmenetelmä | Elintarvikekäyttö | |
|---|---|---|---|---|---|
| etanoli | E. elaterium | SLE followed by LLE with ethyl acetate and column chromatography purification (CHCl3/MeOH gradient) | HPLC-MS/MS | Antioxidant and anti-inflammatory activities | Bourebaba et al., 2018 |
| Ethanol | Bioactives of green coffee beans and its press meal | Soxhlet 2 g sample 10 g solvent 3h and 5 h |
HPLC-DAD | Antioxidant activity | Resende Oliveira et al., 2019 |
| Ethanol 70% | Phenolic compounds from Citrus reticulata peel | SLE 50 g sample 1 L solvent Boiling solvent 60 min |
HPLC-PDA | Anti-proliferative effect against BT-475, HepG2 and Caco-2 human cancer cell lines | Ferreira et al., 2018 |
| Ethanol, Water | Polyphenols of Salvia amplexicaulis Lam. | SLE, 10 g sample 100 mL water or 96% EtOH 24 h, RT |
HPLC-DAD | Antioxidant activity and enzyme inhibition (AChE and tyrosinase) | Alimpić et al., 2017 |
| etyyliasetaatti (EtOAc) | torjunta-ainejäämät mehiläistuotteita sisältävissä makeisissa | Ketsit: 1)
SLE, 10 g näytettä + 10 mL etyyliasetaattia + 10 mL vettä 2) dSPE: n puhdistus-ja haihdutus 3) esivalmistus etoac |
GC-MS | elintarviketurvallisuus | gérez et al., 2017 |
| Pesticide residues in fruits and vegetables | Uclés et al., 2014 | ||||
| vesi | Salvia eriophora Boissin Fytokemiallinen pitoisuus. & Kotschy | SLE 20 g sample 200 mL water 12h, RT |
HPLC-MS/MS | Antioxidant activity and enzyme inhibition (acetylcholinesterase, α-amylase, butyrylcholinesterase, α-glycosidase) | Bursal et al., 2019 |
| Water | Phenolic compounds from leaves of the kiwi tree | SLE 10 g sample 100 mL water Boiling water 10 min |
HPLC-DAD HRMS |
Cytotoxicity, permeability and protein profile modification of Caco-2 cells | Henriques et al., 2018 |
| vesi | Hericium erinaceus-sienen Polysakkaridifraktio | SLE 1 g 15 mL vettä kiehuva vesi 60 min |
FT-IR GC-FID |
polysakkaridien vaikutuksen arviointi paksusuolen terveyteen | |
| butanoli/metanoli (3:1) ja heptaani/etyyliasetaatti (3:1) | eläinkudoksen lipidit | 15-150 mg pakastettu kudos 500 µL butanoli/MeOH (3:1) + 500 µL heptaani/Etoac (3:1) + 500 µL etikkahappoa 1% + 500 µl heptaania/etoac (3:1) |
HPLC-ELSD | Development of chloroform-free extraction method for lipidomics | Löfgren et al., 2016 |
EtOH, ethanol; FT-IR, Fourier transform infrared spectroscopy; GC-FID, gas chromatography coupled to flame ionization detector; HPLC-DAD, high performance liquid chromatography coupled to diode array detector; HPLC-PDA, high performance liquid chromatography coupled to photodiode array detector; HRMS, high resolution mass spectrometry; MeOH, methanol; RT, room temperature; SLE, kiinteä / nestemäinen uutto.
fenoliyhdisteiden uuttamisessa SLE: llä on perinteisesti käytetty metanolia, etanolia, asetonia tai näiden liuottimien seosta veden kanssa. Tämän jälkeen voidaan suorittaa edelleen jakotislaus nestejaotteella (LLE), yleensä heksaanilla tai etyyliasetaatilla, joka voi päätyä puhdistukseen SPE: llä tai kolonnikromatografiafrakotukseen (Ajila et al., 2010). Esimerkiksi tätä perinteistä työnkulkua on käytetty saamaan Ecballium elateriumista cucurbitacineihin ja flavonoideihin rikastettuja uutteita alkaen SLE: n etanolilla valmistamasta raakauutteesta 96%: lla liuottimen ja näytteen suhde on 20 mL g−1. Raakauutteen fraktiointi etyyliasetaatilla tuotti uutteen, jolla on antioksidanttista ja anti-inflammatorista vaikutusta (Bourebaba et al., 2018). Tämä ei kuitenkaan ole kaikkein ympäristöystävällisin lähestymistapa, ja olisi suositeltavaa korvata se strategioilla, jotka vähentävät liuottimien kulutusta, aikaa ja haihtumisvaiheita.
puhtaan veden käyttö on yksi halvimmista ja helpoimmista vaihtoehdoista toteuttaa SLE. Sitä käytetään laajalti valmistettaessa uutteita kasveista, elintarvikkeista ja ruokahävikistä niiden kemiallisen koostumuksen ja mahdollisten terveysvaikutusten tutkimiseksi. SLE: n hyödyntäminen kiehuvalla vedellä on varsin mielenkiintoista, koska se jäljittelee kasvien infuusion tai keittämisen aikana tapahtuvia prosesseja, joten näiden uutteiden koostumuksen tulisi olla samanlainen kuin analogisten kulutettujen yrttiteet. Lisäksi elintarvikejätteen vesiuutteet, joilla on mahdollista biologista aktiivisuutta, voidaan helposti skaalata näiden tuotteiden valorisoimiseksi. Toisaalta jotkin kasvien aineenvaihduntatuotteet saattavat hydrolysoitua vesiuutteiden uuttamisen tai säilyttämisen aikana ja vesi on hyvä kasvualusta bakteerien kasvulle (Belwal et al., 2018). Liuottimen poisto on myös haitta, koska vesi ei haihdu helposti ja kylmäkuivaus vaatii paljon energiaa ja on aikaa vievää; tämä on yleensä pakollinen vaihe, koska kylmäsulatusjaksot, jotka syntyvät uutteiden säilyttämisen seurauksena alhaisissa lämpötiloissa, voivat hajottaa kiinnostavia yhdisteitä. Nämä haitat voitetaan yleensä käyttämällä vesiseoksia muiden orgaanisten liuottimien kanssa.
hyviä esimerkkejä vihreiden liuottimien käytöstä biologisten aktiivisten fenoliyhdisteiden uuttamisessa ovat useat tutkimukset, joita on viime aikoina julkaistu eri Salvia-lajien fenoliyhdisteiden SLE: stä. Salvia eriophoran maserointi (Bursal et al., 2019) ja Salvia amplexicaulis Lam. (Alimpić et al., 2017) vedellä (10 mL g−1) tuotettu lupaavia uutteita, joilla on inhiboiva vaikutus entsyymejä, kuten asetyylikoliiniesteraasia (AChE), jotka liittyvät neurodegeneratiivisiin reitteihin. Eri salvia-lajien vesiuutteilla oli erilainen fenoliprofiili, mutta saman lajin etanoliuutteen kemiallinen profiili oli analoginen vesipitoisen kanssa, joten alkoholiuute oli myös bioaktiivinen (Alimpić et al., 2017). Molemmissa tutkimuksissa testattiin myös metanolia liuottimena, koska sen avulla saadaan suuri fenoliyhdisteiden saanto. Metanoli on hieman polaarisempi ja edullisempi kuin etanoli, ja sitä on helpompi haihduttaa matalamman kiehumispisteensä vuoksi; huonompien ympäristöominaisuuksiensa vuoksi metanoli kuitenkin korvataan yhä useammin etanolilla tai etanolin ja veden seoksilla. Vihreiden liuottimien käytöstä huolimatta ehdotettu uuttomenetelmä on kuitenkin aikaa vievä ja sitä voidaan parantaa, koska ehdotettu S. eriophora-ja S. amplexicaulis Lam-uutto on. tehtiin 12 tunnin ja 24 tunnin ajan. Soxhlet-uuttajalla tapahtuva refluksiuutto voi osaltaan lyhentää bioaktiivisten yhdisteiden talteenottoon näytteestä kuluvaa aikaa. Esimerkiksi soxhlet uuttamalla bioaktiivisia yhdisteitä vihreistä kahvipavuista etanolilla saatiin 5 h (Resende Oliveira et al., 2019).
SLE etanolia, vettä ja niiden seoksia käyttäen on hyödynnetty fenoliyhdisteitä ja flavonoideja eri elintarviketeollisuuden sivutuotteista, päätarkoituksena on valorisoida tuotteita, joita yleensä pidetään jätteinä. Esimerkiksi SLE, joka käyttää 80% etanolia vedessä, osoitti polyfenolien tehokkaan talteenoton eri punaviinilajikkeiden puristemassasta (nahasta ja siemenistä) viiniteollisuudessa (Makris, 2018). Etanolin ja veden seosta 70:30 (v/v) käytettiin fenoliyhdisteiden talteenottoon Citrus reticulata Blanco-kuoresta, toisesta elintarviketeollisuuden sivutuotteesta. Uutetta saatiin kiehuttamalla näytettä liuottimessa 60 minuutin ajan, jolloin liuottimen ja näytteen suhde oli 20 mL g−1. SPE: n puhdistama uute osoitti antiproliferatiivista aktiivisuutta BT-475 ihmisen rintasyöpäsoluja vastaan (Ferreira et al., 2018). Tämä lähestymistapa on varsin mielenkiintoinen vihreän kemian näkökulmasta, koska sivutuotteen valorisointi edistää kiertotaloutta ja kestävyyttä, ja ehdotettu 1 tunnin uuttoaika bioaktiivisten uutteiden saamiseksi on elinkelpoisempi kuin maserointiajat, jotka vaihtelevat 12 tunnista 24 tuntiin. jopa lyhennettyä uuttoaikaa ehdotettiin bioaktiivisten fenoliyhdisteiden talteenotolle kiivien lehdistä (Actinidia deliciosa), jota pidetään hedelmäteollisuuden jätteenä. Tässä sovelluksessa käytettiin 10 min kiehuvaa vettä liuottimen ja näytteen suhteessa 10 mL g-1, ja SLE-vaihetta seurasi kuitujen etanolinen saostaminen. AChE: n proteiiniprofiiliin kohdistuvia vaikutuksia ja inhibitiovaikutuksia havaittiin, mikä osoittaa tämän sivutuotteen vesiuutteen potentiaalin (Henriques ym., 2018).
fenoliyhdisteiden lisäksi veden ja etanolin yhdistelmiä käytetään runsaasti tavanomaisessa hiilihydraattien uuttamisessa. Esimerkiksi SLE vedellä on käytetty kiinnostavien polysakkaridien erottamiseen sienestä Hericium erinaceus. Kiehuvasta vedestä (15 mL g−1, 1h, kahdesti) saatiin raaka polysakkaridifraktio ja sen jälkeen väkevä polysakkaridifraktio etanolisaostuksella. Tämä uute alistettiin proteiinin saostumiselle ja dialysoitiin, jotta saatiin jalostettua uutetta. Nämä fraktiot toimitettiin hiirille suun kautta ja paksusuolen terveyden havaittiin parantuneen (Wang et al., 2018c).
kaikista tähän mennessä altistuneista on helppo havaita, että fenoliyhdisteet ja hiilihydraatit ovat polaarisia molekyylejä, jotka soveltuvat uutettavaksi vedellä ja etanolilla, mutta vähemmän polaarisia vihreitä liuottimia tarvitaan karotenoidien tai lipidien kaltaisten molekyylien uuttamiseen. Nämä ei-polaariset analyytit on perinteisesti uutettu kloroformi/metanoliseoksilla, ja niiden korvaaminen ympäristöystävällisemmillä liuottimilla tavanomaisissa SLE: issä on haastavaa. Tässä yhteydessä on ehdotettu kloroformivapaata menetelmää SLE: hen perustuvien eläinkudosten rasvauuttamiseksi kokonaan butanoli / metanoli (3:1) – seoksella (n. 10 µL mg−1), jota seuraa LLE, jossa on 1% etikkahappoa ja heptaani / etyyliasetaatti (3:1) – seosta (Löfgren et al., 2016). Tämä menetelmä oli parempi lipidien talteenotto kuin tavanomainen kloroformi/metanoli (2:1)-seoksen käyttöön perustuva Folch-menetelmä ja myös parempi kuin lipidien uuttaminen metyyli-tert-butyylieetterillä (MTBE). Kaikki ehdotetussa pöytäkirjassa käytetyt liuottimet eivät kuitenkaan ole ympäristöystävällisiä, vaikka kaikki klooratut liuottimet ovat mukana.
lopuksi on syytä mainita esimerkki SLE: n käytöstä ympäristöystävällisten liuottimien kanssa elintarviketurvallisuussovelluksissa. Tältä osin suosituin uuttomenetelmä torjunta-ainejäämien määrityksessä on niin sanottu QuEChERS-menetelmä (lyhenne sanoista quick, easy, cheap, effective, rugged and safe), joka perustuu SLE: hen ja jota seuraa dispersiivinen SPE (dSPE) uutteiden puhdistamisessa (http://quechers.cvua-stuttgart.de). Polaariset torjunta-aineet uutetaan yleensä asetonitriilillä tai metanolilla ennen niiden analysointia korkean erotuskyvyn nestekromatografialla (HPLC), mutta vähemmän polaariset torjunta-aineet uutetaan ympäristöystävällisellä etyyliasetaattiliuottimella, ennen kaasukromatografiaa (GC). Esimerkkeinä kaksi hedelmien ja vihannesten torjunta-ainejäämien määritysmenetelmää (Uclés et al., 2014)ja karkeissa (Gérez et al., 2017) sisältyvät taulukkoon 1, jotka molemmat perustuvat Ketšerien uuttoon etyyliasetaatilla.