määritelmä
fluoresoiva merkintä on prosessi, jossa fluoresoivat värit sidotaan biomolekyylien sisältämiin funktionaalisiin ryhmiin siten, että ne voidaan visualisoida fluoresenssikuvauksella (nature.com uusien fluoriforeiden saatavuus on muuttanut ratkaisevasti mahdollisuuksia biomolekyylien herkkään havaitsemiseen ja niiden vuorovaikutusten analysointiin. Parannetut fluoresoivat väriaineet mahdollistavat nyt aiemmin mahdottomat tutkimukset solurakenteista ja soluprosesseista. Fluoresoivilla merkinnöillä on monia etuja, sillä ne ovat erittäin herkkiä pienilläkin pitoisuuksilla, ne ovat stabiileja pitkiä aikoja eivätkä häiritse kohdemolekyylien toimintaa. Merkittyjen solujen kohdennettu kuvantaminen mahdollistaa niiden seurannan in vitro ja In vivo. Eri fluoriforien käyttäminen samassa näytteessä voi myös mahdollistaa useiden molekyylien samanaikaisen havainnoinnin samaan aikaan. Yleisimmin käytettyjä fluoriforeja ovat Fluoreseiini-isotiosyanaatti (FITC), rodamiinin (TRITC) johdannaiset, kumariini ja syaniini. Näitä synteettisiä orgaanisia väriaineita käytetään merkitsemään biomolekyylejä proteiineiksi, peptideiksi, vasta-aineiksi, nukleiinihapoiksi, bakteereiksi tai hiivaksi. Luonnossa esiintyviä fluorokromeja, kuten vihreää fluoresoivaa proteiinia (GFP), voidaan käyttää myös elävien solujen merkitsemiseen geneettisesti.
- fluoresoivan proteiinin merkintä
fluoresoivan merkinnän avulla tutkijat voivat tutkia proteiinien konformaatiodynamiikkaa ja molekyylien vuorovaikutuksia tai seurata niiden liikkeitä ymmärtääkseen paremmin niiden biologisia toimintoja (Modesti M, 2011). Jotta saataisiin parempi käsitys reseptorin ja ligandin sitoutumisesta, proteiinirakenteista ja entsyymiaktiivisuudesta, voidaan myös merkitä yksittäisiä peptidejä. Fluorokromi merkittyjä vasta-aineita käytetään laajalti biolääketieteellisessä tutkimuksessa antigeenien havaitsemiseen immunofluoresenssimäärityksissä ja ne ovat myös välttämättömiä välineitä immunodiagnostiikassa. Luotettavien tulosten varmistamiseksi fluoriforikonjugaatio ei saa vaikuttaa vasta-aineen antigeenisitoutumisominaisuuksiin (Nath n et al, 2016). - nukleiinihappojen fluoresoivilla merkinnöillä
Fluoresenssipohjaisilla määrityksillä on suuri merkitys nukleiinihappojen rakenteen, toiminnan ja dynamiikan biofysikaalisissa tutkimuksissa. Merkintämenetelmien ja kuvantamisjärjestelmien viimeaikaiset edistysaskeleet ovat mahdollistaneet DNA: n ja RNA: n suoran in vivo-tarkkailun ja niiden vuorovaikutuksen muiden solukomponenttien kanssa. Nukleiinihappojen elävien solujen kuvantaminen on avannut uusia polkuja kromatiinin organisaation ja geeniekspression säätelyn parempaan ymmärtämiseen. (Dirks RW et al, 2018). - polysakkaridien fluoresoivat merkinnät
Kompleksipolysakkaridit, kuten hepariini, ovat solunulkoisen matriisin rakenneosia. Nämä polysakkaridit ovat välttämättömiä solujen tarttumiselle, muuttoliikkeelle ja kasvulle (Prigent-Richard S. et al, 1998). Jotkut yhdisteet tunnetaan myös niiden antikoagulantti, antitromboottiset, anti-inflammatoriset, antiviraaliset ja antiangiogeneettiset ominaisuudet. Fluoresenssiin perustuvat menetelmät helpottavat uusien bioaktiivisten polysakkaridien tunnistamista ja niiden biologisten toimintojen luonnehtimista (Roger O et al, 2002). - lipidien fluoresoivilla merkinnöillä
Solulipideillä on ratkaiseva rooli solussa energian varastoinnissa, solukalvojen muodostumisessa ja solunsisäisissä signalointiprosesseissa (Maekawa M. and Fairn G, 2014). Lipofiilinen väriaine Nile red käytetään laajalti värjäämään solunsisäisiä lipidejä niiden sijainnin ja organisaation analysoimiseksi (Greenspan P et al, 1985). Lisäksi rasvadynamiikan tutkimiseen on myös mahdollista merkitä elävissä soluissa erityisiä merkintöjä (Schultz C et al, 2010).
fluoresoivat Merkintätekniikat
yleisesti käytetyt fluoresoivat merkintätavat käyttävät kemiallisia, entsymaattisia, peptidi – / proteiinilappuja ja geneettisiä merkintätekniikoita (Sahoo H, 2012 , Toseland CP, 2013).
- kemialliset merkintätekniikat: Fluoroforit kiinnittyvät kohdemolekyyleihin kemiallisella muunnoksella (kovalenttinen tai ei-kovalenttinen sitoutuminen). Kemiallisilla merkintämenetelmillä on useita etuja, koska ne ovat kestäviä, helppoja suorittaa ja erittäin tehokkaita monilla fluoriforeilla. Ne soveltuvat paremmin in vitro-tutkimuksiin kuin In vivo-tutkimuksiin.
- entsymaattiset merkintätekniikat: entsymaattiset reaktiot mahdollistavat nopean, erittäin tehokkaan ja selektiivisen merkitsemisen in vivo ja in vitro, ja niitä voidaan käyttää proteiinien tai kokonaisten solujen kohdentamiseen. Etikettien suuren koon vuoksi voi kuitenkin esiintyä häiriöitä kohdemolekyylien toimintaan.
- peptidi / proteiinitagi: äskettäin kehitetty ja erittäin lupaava tekniikka mahdollistaa proteiinien spesifisen ja valikoivan merkitsemisen sisällyttämällä siihen lyhyitä fluoresoivia tunnisteita, jotka eivät häiritse molekyylin laskostumista tai toimintaa. Tämä tekniikka on myös helppo suorittaa, ja sitä voidaan käyttää yksittäisten proteiinien eri kohtien tutkimiseen peptidimerkin spesifisyydestä riippuen.
- geneettinen merkintä: geneettinen merkintä voidaan saavuttaa käyttämällä proteiinidomeeneja, pieniä peptidejä tai yksittäisiä aminohappoja, jotka on merkitty fluoresoivilla väriaineilla ja jotka voivat kiinnittyä erityisesti kromosomeja pitkin oleviin kohtiin in vivo. Tällä menetelmällä voidaan havaita kromosomipoikkeavuuksia, kuten poistoja tai päällekkäisyyksiä.
- Monivärinen merkintä: Elävien solujen kuvantamisessa ja virtaussytometriasovelluksissa yleinen vaatimus on kyky seurata tai havaita useita fluoresenssilla merkittyjä proteiineja samanaikaisesti. Tätä tarkoitusta varten voidaan käyttää erityisesti suunniteltuja väriaineita, joilla on hyvin suuri Stokes-muutos, jotka mahdollistavat eri biokemiallisten prosessien samanaikaisen seurannan.
Fluoresenssiin perustuvat määritykset
Fluoresenssiin perustuvat määritykset perustuvat fluoroforien kykyyn lähettää valoa uudelleen valohiukkasille tai fotoneille altistumisen jälkeen. Aallon pituuden ero herätevalon ja emissiovalon välillä, niin sanottu Stokesin siirto, voidaan havaita mikroskoopeilla ja kuvantamisjärjestelmillä. Jokaisella fluoroforilla on oma Stokes-siirtonsa. Eri määritysten avulla tutkijat voivat paikallistaa biomolekyylejä, tarkkailla niitä reaaliajassa, tutkia niiden yhteisvaikutuksia ja tutkia entsymaattisia toimintoja.
- Fluoresenssimikroskopia
Fluoresenssimikroskopia mahdollistaa solujen ja solukomponenttien tunnistamisen sekä solufysiologian seurannan suurella spesifisyydellä. Fluoresenssimikroskopia erottaa emittoituneen valon herätevalosta optisten suodattimien avulla. Kahden indikaattorin käyttö mahdollistaa myös eri biomolekyylien samanaikaisen havainnoinnin samanaikaisesti. Siinä missä perinteiset kuvantamisjärjestelmät mahdollistavat 200-300 nm: n resoluution fysikaalisten diffraktiorajojen vuoksi, uudet superresoluutioiset fluoresenssimikroskoopit kuten STED (stimulated emission depleetion) ylittävät nämä rajat ja antavat tietoa molekyylien nanomittaisesta maailmasta (Sanderson MJ et al, 2014). - Virtaussytometriaa
Virtaussytometriaa käytetään laajalti perustutkimuksessa ja kliinisessä käytännössä tiettyjen fluoriforeiden signaalin mittaamiseen. Solut ja hiukkaset analysoidaan ja lajitellaan lopulta ”reaaliaikaisesti” niiden kulkiessa ilmaisimien valonsäteen läpi, joka määrittää merkittyjen vasta-aineiden tai ligandien tuottaman fluoresenssin. Nämä merkkiaineet sitoutuvat tiettyihin molekyyleihin solun pinnalla tai solun sisällä, mikä mahdollistaa niiden havaitsemisen ja kvantifioinnin. Yksittäisistä soluista voidaan mitata useita parametreja, kuten koko ja tilavuus, ja eri solutyypit voidaan eristää ja luonnehtia (Nolan JT and Condello D, 2013). Virtaussytometrialla on laajoja sovelluksia immunologian, hematologian, elinsiirtolääketieteen, onkologian ja genetiikan aloilla. - fluoresenssi in situ hybridisaatio (FISH)
fluoresenssi in situ hybridisaatio (FISH) mahdollistaa tiettyjen DNA-sekvenssien lokalisoinnin kromosomeihin. Fluoresoivia DNA-tai RNA-luotaimia käytetään hybridisoimaan ja tunnistamaan toisiaan täydentäviä kohde-DNA-sekvenssejä. Kalaa on perinteisesti käytetty geenien kartoittamiseen kromosomeista esimerkiksi Human Genome Projectin aikana. Nykyään fluoresenssi in situ hybridisaatiota käytetään pääasiassa diagnostisiin tarkoituksiin kromosomipoikkeavuuksien havaitsemisessa tai syöpäsolujen analyysissä (O ’ Connor C, 2008). - Fluoresenssikorrelaatiospektroskopia (FCS)
Fluoresenssikorrelaatiospektroskopia (FCS) mahdollistaa fluorokromien fluoresenssin intensiteetin ajallisten muutosten analysoinnin, jotka johtuvat kemiallisista, biologisista tai fysikaalisista vaikutuksista. FCS otettiin käyttöön lääkeaineiden ja DNA: n välisen vuorovaikutuksen tutkimiseksi, ja se on nyt herkkä työkalu proteiinien konsentraatio-ja aggregointitasojen määrittämiseen sekä molekyylien vuorovaikutusten tarkkailuun (Tian Y et al, 2011). - Mikroarrayt
Mikroarrayt mahdollistavat geeniekspression tutkimisen eri olosuhteissa. Tuhansia geenejä voidaan tutkia samanaikaisesti DNA-siruilla. Nämä ovat mikroskooppisia dioja, joihin on painettu pieniä täpliä, jotka sisältävät tunnettuja DNA-sekvenssejä, jotka voivat sitoutua selektiivisesti fluoresoiviin mRNA / cDNA-molekyyleihin. Hybridisaation jälkeen DNA-siru luetaan, ja tietoja käytetään geenien ilmentymisprofiilien luomiseen (Hoen PAC et al, 2003).
fluoresoiva merkintä: elävien solujen kuvantaminen
solujen prosessien kineettisestä havainnoinnista aikaperusteisella fluoresenssimikroskopialla on tullut keskeinen tekniikka solubiologiassa, sillä elävien solujen kuvantaminen voi tarjota erittäin arvokasta tietoa solujen kasvu-ja kuljetusmekanismeista. Yksi suuri haaste aikamikroskopiassa on valoherkistymisestä aiheutuvien valotoksisten vaikutusten minimointi. Valoaltistus tuhoaa vähitellen fluoresoivia molekyylejä, mikä johtaa fluoresenssisignaalin vähenemiseen ja vapaiden radikaalien muodostumiseen, jotka voivat vahingoittaa soluja. Siksi on tärkeää, että menetelmä elävien solujen kuvantaminen löytää tasapaino vähentää valoaltistusta mahdollisimman paljon ja saada hyödyllisiä signaaleja tarkkailla soluja. Tutkijoiden on myös luotava fysiologinen ympäristö, joka mahdollistaa In vivo-dynamiikan läheisen toistamisen. (Ettinger and Wittmann T, 2014).
PromoCell-fluoresoiva merkintä
uusien fluoriforeiden saatavuus on muuttanut dramaattisesti mahdollisuuksia biomolekyylien herkkään havaitsemiseen ja niiden vuorovaikutusten analysointiin. Parannetut fluoresoivat väriaineet mahdollistavat nyt aiemmin mahdottomat tutkimukset solurakenteista ja soluprosesseista. PromoCell tarjoaa laajan valikoiman korkealaatuisia fluoriforeja erilaisten biomolekyylien fluoresoiviin merkintöihin: proteiinien merkinnät, vasta-aineiden merkinnät, nukleiinihappojen merkinnät (DNA-merkinnät, RNA-merkinnät) sekä täydelliset merkintäsarjat ja käyttövalmiit fluoresoivat konjugaatit.
Promofluorivärimme ovat kustannustehokkaita vaihtoehtoja tunnetuille, johtaville fluoriforeille ja kattavat aallonpituusspektrin sinisestä pitkälle punaiseen. Niillä on erinomainen fluoresenssin voimakkuus ja fotostabiilisuus, voimakas valon absorptio, suuri fluoresenssin kvanttisaanto ja hyvä vesiliukoisuus, ja niitä voidaan käyttää fluoresenssimikroskopiassa, fluoresoivissa in situ-hybridisaatiossa (FISH), fluoresenssikorrelaatiospektroskopiassa (FCS) ja mikroarrayseissa (proteiini, DNA). Jotkut niistä tarjoavat erityisen suuren Stokes-siirron, mikä tekee niistä ihanteellisesti monivärisiä merkintöjä tai virtaussytometriasovelluksia varten. Promofluorivärejä on saatavilla esim. NHS-estereinä, maleimideina ja aminomodifioideina, jotka ovat valmiita kovalenttiseen kytkentään, tai konjugaatteina biotiinin, falloidiinin ja deoksinukleotidien (dutp) kanssa. Lisäksi tarjoamme laadukkaita valkuaisaineita & vasta-Ainemerkintäsarjoja erilaisilla Promofluoriväreillä.