Frontiers in Farmakology

Introduction

Membrane proteins participate in fundamental physiological events in every biological system from bacterias to human. >50% markkinoiduista lääkkeistä kohdistuu kalvoproteiineihin, kun taas monien muiden kalvoproteiinien farmakologista kohdentamista pidetään potentiaalisesti hyödyllisenä lukuisissa biolääketieteellisissä sovelluksissa (Overington et al., 2006; Yıldırım et al., 2007; Arinaminpathy et al., 2009). Niiden toiminnan ja säätelyn taustalla olevat molekyylimekanismit jäävät kuitenkin pitkälti tuntemattomiksi rakenteellisen informaation puutteen vuoksi. Itse asiassa, vaikka kalvoproteiinien osuus on ~26% ihmisen proteomista, niiden rakenteet edustavat vain ∼2% proteiinin tietopankin rakenteista (Fagerberg et al., 2010; Pandey et al., 2016). Useat esteet vaikeuttavat kalvoproteiinien rakenteellista tutkimusta, mikä edellyttää huipputeknologian kehittämistä niiden molekyyliarkkitehtuurien valaisemiseksi (Pandey et al., 2016; Masson et al., 2017; Hagn et al., 2018; Ravula and Ramamoorthy, 2019; Redhair et al., 2019). Suurimmat esteet ovat se, että niiden yliekspressio ja puhdistus sekä rakenteelliset tutkimukset useimmilla tekniikoilla (esim.Röntgenkristallografia) jäävät monissa tapauksissa vähäisiksi. Nämä esteet haittaavat siten sairauteen liittyviä kalvoproteiineja kohdentavien lääkeaihioiden järkevää kehitystä (Vinothkumar and Henderson, 2010; Lounnas et al., 2013; Marciano et al., 2014).

Sekundaarikuljettajat ovat kalvoon sitoutuneita proteiineja, jotka katalysoivat selektiivisesti huonosti läpäisevien liuosten liikettä (esim., ionit, välittäjäaineet, lääkkeet) solukalvon poikki tukemalla erilaisia solutoimintoja terveydessä ja sairauksissa. Sekundaarikuljettajat noudattavat Alternative access-paradigmaa, jonka mukaan proteiini ligandia sitova tasku tulee vaihtoehtoisesti saataville kalvon vastakkaisilla puolilla hyväksymällä sisäänpäin suunnatut (if) ja ulospäin suunnatut (of) valtiot peräkkäin (Jardetzky, 1966; Forrest et al., 2011). Viimeaikaiset läpimurrot kalvoproteiinien rakennebiologiassa tarjosivat runsaasti kalvoon sitoutuneiden transporttereiden rakenteita eri konformaatiotiloissa (Drew and Boudker, 2016; Bai et al., 2017), joka tarjoaa oivalluksia kuljetus-ja solute-tunnistusmekanismeistaan. Ne tarjoavat kuitenkin staattisia tilannekuvia luontaisesti monivaiheisesta prosessista (Seeger, 2018). Siksi on kasvava tarve kehittää uusia lähestymistapoja tutkimaan kalvoproteiinien dynamiikkaa (Konermann et al., 2011; Smith ym., 2012; Sim ym., 2017; Mandala et al., 2018; Burke, 2019). Näitä ovat yhdistelmä molecular dynamics (MD) simulaatiot (Roux et al., 2011; Zdravkovic et al., 2012; Zhekova et al., 2016; Zhekova et al., 2017; Harpole and Delemotte, 2018) kehittyneillä kokeellisilla tekniikoilla, mukaan lukien spektroskooppiset tekniikat ja yksihiukkasten kryogeeninen elektronimikroskopia (Smith et al., 2012; Pandey et al., 2016; Castell et al., 2018; Hagn et al., 2018; Ravula ja Ramamoorthy, 2019; Sun ja Gennis, 2019).

vety-deuterium-vaihtomassaspektrometria (HDX-MS) sai viime vuosina huomiota kalvoproteiinien dynamiikan tutkimisessa, vaikka sitä on käytetty vuosikymmeniä liukoisten proteiinien luonnehtimiseen (Konermann et al., 2011; Vadas et al., 2017). HDX-MS valvoo ajasta riippuvaa liuotin D2O: n vaihtoa proteiinien runkovetyamidivetyjen kanssa kotimaisissa olosuhteissa. Deuteriumin vaihtokurssi riippuu liuottimen saatavuudesta, sekundäärirakenteesta ja rakenteellisesta jäykkyydestä (Konermann et al., 2011). Yhdessä proteolyyttisen digestion ja peptidien erottelun kanssa HDX-MS mahdollistaa valuuttakurssien kvantifioinnin lyhyissä proteiinisegmenteissä aina yhden jäämän erottelukykyyn saakka. HDX-MS: n kaksi merkittävää etua ovat se, että analyysiin tarvitaan pieniä proteiinimääriä (< 0.1 mg) ja ettei kemiallisia proteiinimerkintöjä tarvita, jolloin vältetään ei-toivotut rakenteelliset häiriöt. Tässä tiivistämme viimeaikaiset edistysaskeleet ja sovellukset HDX-MS: n käytössä kuljettimien rakenteellisen dynamiikan tutkimiseen.

vety-Deuterium-Vaihtomassaspektrometriaperiaatteet

HDX-MS-periaatteet on kuvattu alla lyhyesti ja laadullisesti, jotta voidaan keskustella sen sovelluksista kuljettajaproteiinien tutkimisessa. Syvällisiä selityksiä varten on saatavilla useita erinomaisia tarkistusartikkeleita (Konermann et al., 2011; Rand et al., 2014; Engen and Wales, 2015; Masson et al., 2017; Oganesyan et al., 2018; Masson et al., 2019; Redhair et al., 2019).

HDX-kokeissa deuterium vaihtuu labiiliproteiinivetyjen kanssa ajasta riippuvalla tavalla, kun proteiini on laimennettu D2O-puskuriin (Masson et al., 2017) (Kuva 1). HDX-MS valvoo pääasiassa selkärangan amidivetyjen vaihtoa, koska I) neutraalissa pH: ssa ne vaihdetaan kursseihin, jotka voidaan havaita HDX-MS: llä (sekunneista päiviin) ja ii) niiden vaihto voidaan tehokkaasti sammuttaa (Marcsin and Engen, 2010; Gallagher and Hudgens, 2016). HDX-nopeus riippuu useista parametreista. Amidivedyt voivat esiintyä ”suljetussa tilassa”, joka johtuu osallistumisesta stabiileihin vetysidoksiin sekundaarirakenteissa tai liuottimen luoksepääsemättömyydestä, joka ei salli niiden vaihtoa liuottimen deuteriumin kanssa, tai” avoimessa tilassa”, jossa protonin abstraktio, HDX: n nopeutta rajoittava vaihe, voi tapahtua (Oganesyan et al., 2018). Lisäksi reaktiolla on luontainen kemiallinen nopeusvakio, joka riippuu pH: sta, lämpötilasta ja jäännösympäristöstä (Oganesyan et al., 2018).

kuva 1 kaavio vety-deuterium-vaihtomassaspektrometrian (HDX-MS) työnkulusta. Proteiinit merkitään D2O-puskuriin ennalta määrätyn ajan, minkä jälkeen tapahtuu vaihto-sammutus ja proteolyysi. Peptidit erotetaan toisistaan, ja niiden massa havaitaan MS-menetelmällä.lopuksi lasketaan kunkin peptidin sisältämän deuteriumin määrä kullekin aikapisteelle.

siirtyminen suljettujen ja avointen valtioiden välillä tapahtuu paikallisten kehittyvien tapahtumien kautta. Native olosuhteissa, joissa proteiinit ovat hyvin taitettu, HDX-nopeus riippuu pääasiassa siirtymisnopeudesta takaisin suljettuun tilaan (Weis et al., 2006). Jos avautumaton proteiinialue palaa suljettuun tilaan kemiallista vaihtokurssia paljon hitaammin, havaitaan EKS1-kinetiikkaa, mikä johtaa korreloituneeseen deuteriumin kertymiseen viereisiin jäämiin. Tämä johtaa kahteen populaatioon: toisessa on alhainen m/z ja toisessa korkea m/z, mikä heijastaa peptidejä proteiinimolekyyleistä, joita ei ole vaihdettu ja jotka ovat läpikäyneet vaihdon. Ajan myötä korkea m / z-populaatio korostuu matalan m/z-populaation kustannuksella. EX1-kinetiikkaa pidetään harvinaisena taitetuissa proteiineissa native-olosuhteissa, mutta sitä voidaan indusoida esimerkiksi lisäämällä denaturointiaineita (Weis et al., 2006; Oganesyan et al., 2018). Jos proteiini palaa suljettuun tilaan paljon nopeammin kuin kemiallinen vaihtokurssi, havaitaan EX2-kinetiikka. Tässä vaihto riippuu yksittäisten jäämien siirtymisestä avoimen ja suljetun tilan välillä, mikä tapahtuu korrelaatiottomalla tavalla. Niinpä ajan myötä havaitaan yksittäinen populaatio, jonka m/z-arvot kasvavat vähitellen (Weis et al., 2006).

deuteroinnin jälkeen reaktio sammutetaan ennalta määritellyissä aikapisteissä muuttamalla pH neutraalista (7) pHmin: ksi (2,5-3), jolloin HDX: n määrä vähenee ~10 000–kertaiseksi (Konermann ym., 2011; Masson et al., 2017; Oganesyan et al., 2018); ja vähentämällä lämpötilaa 25: stä 0°C: seen, mikä johtaa ~14-kertaiseen laskuun HDX: ssä (Englander, 2006; Oganesyan et al., 2018). Seuraavaksi proteiini pilkotaan proteaasin avulla ja peptidit erotetaan analyyttisellä käänteisfaasikromatografialla. Tällä hetkellä HDX-MS-kokeiden suurin tekninen pullonkaula piilee siinä, että saadaan aikaan suuri sekvenssipeitto, jota rajoittavat ruoansulatusentsyymien vastustuskyky ja proteolyyttiset olosuhteet. Lopuksi elutoidut peptidit tunnistetaan MS: n avulla ja HDX: n aste lasketaan saatujen m/z-arvojen perusteella. Kokeelliset yksityiskohdat ja sudenkuopat proteiinin pilkkoutumisesta, peptidien erottamisesta ja MS-tunnistamisesta ovat tämän tarkastelun ulkopuolella (Konermann et al., 2011; Masson ym., 2017; Masson et al., 2019).

vedyn ja deuteriumin Vaihtomassaspektrometriatutkimukset Kalvoproteiineilla

huolimatta siitä, että heillä on vaihteleva access-paradigma, ligandin aiheuttamat konformaatiomuutokset vaihtelevat kuljettajaproteiinien välillä johtuen ligandin ja proteiinin vuorovaikutusten eroista. Esimerkiksi symporterit (kahden tai useamman ligandin yhteiskuljetus) voivat siirtyä IF: n ja sellaisten valtioiden välillä, joissa ei ole sidottuja ligandeja, kun taas ligandisidonta on pakollista IF: n ja antiportereissa olevien valtioiden välillä (ligandien vaihtaminen kalvon vastakkaisilla puolilla) (Forrest et al., 2011; Drew and Boudker, 2016; Bai et al., 2017).

paikallisten ligandien aiheuttamien dynaamisten muutosten havaitseminen proteiineissa on yleensä vaikeaa. Esimerkiksi kalvoproteiinien kiderakenteet sekä ligandittomissa että ligandeihin sitoutuneissa muodoissa ovat usein poissa käytöstä, mikä estää ligandien aiheuttamien konformaatiomuutosten havaitsemisen edes sellaisilla proteiineilla, joilla on tunnetut rakenteet. Lisäksi korkean resoluution rakenteelliset tilannekuvat apo-ja ligandisidonnaisista valtioista eivät välttämättä ratkaise merkittäviä konformaatioeroja. Pieniä ligandin aiheuttamia konformaatiomuutoksia voidaan kuitenkin havaita HDX-MS: n avulla spesifisissä proteiinin aladomaaneissa native-olosuhteissa mittaamalla differentiaalinen deuteriumin kertymä (ΔHDX) ligandien läsnä ollessa ja ilman. Tämä HDX-MS: n kyky tarjoaa ainutlaatuisia mahdollisuuksia käsitellä haastavimpia kysymyksiä ligandiproteiinin ja proteiini-proteiini-vuorovaikutuksen mekanismien selvittämisessä (Rand et al., 2014; Masson et al., 2019; Redhair et al., 2019), kuten tässä tarkasteltiin useita äskettäin tutkittuja kuljettajaproteiineja.

Konformaatiomuutokset Alternative Accessin taustalla: Na+/H+ Antiporter

Nha-proteiinit säätelevät solujen pH: ta, ja tilavuutta kaikkialla elämän valtakunnissa (Padan and Landau , 2016). Tärkein Nha-ortologien tutkimuksessa käytetty Rakennemalli on Escherichia coli NhaA, jolle on saatavilla inaktiivisen tilan kiderakenne happamassa pH: ssa (Hunte et al., 2005). NhaA: n rakenteellisen dynamiikan tutkimiseen fysiologisessa pH: ssa käytettiin äskettäin HDX-MS: ää (Eisinger et al., 2017). Tässä tutkimuksessa saatujen oivallusten kannalta ratkaisevaa on, että HDX-MS tarjoaa globaalia dynaamista dataa, toisin kuin paikkasidonnaisiin merkintöihin perustuvat menetelmät, jotka havaitsevat vain ennalta määriteltyjen proteiinialueiden liikkeet.

tässä tutkimuksessa nhaa: n peittojärjestys pesuaineissa oli poikkeuksellisen korkea, 88, 5%, mikä antoi käsityksen ligandisitoutumisen taustalla olevasta mekanismista. Vertaamalla HDX – kuvioita apo: n ja substraattiin sitoutuneen Nha: n välillä havaittiin toistuva HDX-muutoksen kuvio useissa heliaaleissa, joissa lisääntynyt deuteriumin kertymä yhdessä terminaalissa liittyi deuteriumin vähenemiseen toisessa terminaalissa. Nousukiitojen keskivaiheilla oli suurin piirtein ennallaan.

HDX-muutoksen havaitun kaavan perusteella, vaikkakaan se ei suoraan tarjoa paikkatietoa, ehdotettiin, että transmembraanikierteet transloituvat suhteessa kalvoon, mikä näkyy kahden Terminin vastavuoroisissa HDX-muutoksissa tietyissä transmembraanikierteissä. Tämä malli on yhdenmukainen” hissin kaltainen ” mekanismi vuorotellen pääsy, mikä tarkoittaa pystysuora käännös transmembrane helices kuljetuksen aikana (Ryan and Vandenberg, 2016). Yhteenvetona HDX-MS tarjosi uusia oivalluksia rakenteellisista siirtymistä, jotka liittyvät vuorottelevaan pääsyyn, joita aiemmin ratkaistut inaktiivisen NhaA: n rakenteet eivät voi saavuttaa.

proteiinin ja lipidin välisten interaktioiden vaikutus kuljettajaproteiinien Konformaatiomaisemiin

useimmat sekundaarikuljettajat kuuluvat suurimpaan fasilitaattoriperheeseen (MFS), ja heillä on säilynyt arkkitehtuuri erilaisista toiminnoistaan huolimatta (Radestock and Forrest, 2011). Vaikka MFS: n jäsenten kiderakenteet ovat käytettävissä, ne antoivat vain vähän tietoa proteiinin ja lipidin välisistä vuorovaikutuksista ja niiden vaikutuksesta OF: n ja IF: n tilojen väliseen tasapainoon. Näin ollen Martens et al. yhdistetyt MD-simulaatiot HDX-MS: n kanssa rasva-ympäristön vaikutusten tutkimiseksi kolmeen hyvin tunnettuun kuljettajaproteiiniin: laktoosileptie, ksyloosikuljettaja ja glyseroli-3-fosfaattiantiporteri (Martens et al., 2018).

ensinnäkin kaikkien transportterien solunulkoisessa eteisessä (Kumar ym., 2014). WT: n ja mutatoituneiden transportterien vertailu HDX-MS: n avulla paljasti, että menetelmä havaitsee konformaatiomuutoksen, jolloin solunulkoisen eteisen alueet vievät enemmän deuteriumia mutantteihin verrattuna WT: hen, kun taas solunsisäisen eteisen jäännöksille käy päinvastoin. Seuraavaksi kuljetinproteiinit valmistettiin uudelleen nanodiskeiksi, jotka koostuivat fosfatidyyliglyserolista, tetraoleyylikardiolipiinista ja joko fosfatidyylikoliinista tai fosfatidyylietanoliamiinista. Mielenkiintoista on, että fosfatidyylietanoliamiinin läsnäolo siirsi tasapainoa kohti IF-tilaa. Tämän jälkeen MD-simulaatiot lipidikaksikerroksissa olevista kuljettajaproteiineista, jotka ovat identtisiä nanodiskkien koostumuksen kanssa, ennustivat suoria vuorovaikutuksia varautuneen fosfatidyylietanoliamiinin pääryhmän ja varautuneiden jäämien varautuneen sytoplasmaverkoston välillä, stabiloiden tilan (Doki et al., 2013). Varattujen jäämien mutaatio kumosi fosfatidyylietanoliamiinin vaikutuksen, mikä viittaa vahvasti siihen, että spesifiset fosfatidyylietanoliamiinin ja proteiinin väliset vuorovaikutukset säätelevät kuljettajaproteiinien sisäistä tasapainoa. Tämä tutkimus on karu esimerkki kokeellisten ja laskennallisten menetelmien yhdistämisestä hienovaraisten mutta toiminnallisesti merkittävien proteiini-lipidi-vuorovaikutusten tunnistamiseksi.

Helix purkautuu kuljetuksen aikana: Leut-tutkimukset

LeuT on välittäjäaine / Na+ symporters (NSS) – perheeseen kuuluva prokaryoottinen homologi, joka sisältää tärkeitä lääkeaineita, kuten serotoniinin, dopamiinin ja noradrenaliinin kuljettajaproteiineja (Kristensen et al., 2011). Leutia tutkittiin laajasti, ja sen kristallografisia rakenteita kuljetussyklin varrelta on saatavilla (Focke et al., 2013). Nämä rakenteet viittasivat siihen, että vuorotteluyhteydessä tarvitaan laajamittaisia rakennemuutoksia (Krishnamurthy and Gouaux, 2012). Kuitenkin konformaatio maisema mahdollistaa siirtymisen IF ja valtioiden edelleen vaikeasti ja kiistanalainen.

eri valtioiden välisen siirtymän tutkimiseksi tutkittiin pesuaineliukoista Leutia olosuhteissa, jotka suosivat IF-tai-valtioita (Merkle et al., 2018). Yllättävää oli, että monilla peptideillä, pääasiassa Transporterin solunsisäisellä puolella, esiintyi EKS1-kinetiikkaa. Tämä on melko epätavallista taitetuissa proteiineissa alkuperäisissä olosuhteissa ja sen katsotaan kuvastavan sekundaaristen rakenneosien pitkäikäistä kehittymistä. EKS1-kinetiikkaa ilmentävien peptidien spatiaalisen jakautumisen ja käytettävissä olevien kristallografisten rakenteiden perusteella ehdotettiin, että tietyt helikset purkautuvat osittain vuorotteluaikana ja että nämä konformaatiomuutokset edistävät myös substraatin vapautumista. Tämä tutkimus korostaa hitaan (sekunnin aikaskaalan) konformaatiomuutoksen funktionaalista merkitystä, joka voidaan ratkaista hyvin HDX-MS: n avulla, toisin kuin muut kokeelliset tai laskennalliset (esim.MD) menetelmät.

Lipidinanodiskeissa olevien kalvoproteiinien vety-Deuteriumvaihtomassaspektrometria

kalvoproteiinien vuorovaikutus ympäröivien lipidien kanssa voi dramaattisesti moduloida niiden toimintaa (Vadas et al., 2017). Eukaryoottisten NSS: n jäsenten aktiivisuus riippuu merkittävästi spesifisistä lipidi-proteiini-vuorovaikutuksista, jotka moduloivat proteiinidynamiikkaa ja siten substraattivuoroja (Divito and Amara, 2009). Therefore, Adhikary et al. tutkittu LeuT rekonstruoitu fosfolipidiksi kaksikerroksisiksi nanodiskeiksi (Adhikary et al., 2017). Käyttämällä tätä lähestymistapaa, LeuT tutkittiin olosuhteissa, jotka suosivat IF ja konformations. Näiden valtioiden välisten HDX-kaavojen vertailu paljasti erityisiä muutoksia alueilla, jotka olivat aiemmin osallisina kuljetussyklissä, mikä heijasti toiminnallisesti merkittäviä rakenteellisia muutoksia. Mielenkiintoista on, että HDX-MS-tiedot, jotka ovat yhdenmukaisia aiempien biofysikaalisten ja laskennallisten tutkimusten kanssa, tukivat pienempää kallistuskulmaa ensimmäiselle transmembraanikierteelle IF-konformaatiossa verrattuna kiderakenteissa havaittuun kallistuskulmaan. Eron katsottiin johtuvan lipidiympäristöstä, sillä kiderakenne saatiin pesuaineessa, jossa oli pieni määrä lipidejä. Yhteenvetona voidaan todeta, että HDX-MS tarjoaa joustavan alustan tutkia kalvoproteiineja erilaisissa hydrofobisissa ympäristöissä ja olosuhteissa, jotka suosivat tiettyjä konformaatiotiloja, ilman paikkasidonnaisia merkintöjä.

ionien vuorovaikutus useiden alueiden kanssa: Na+/Ca2+ – lämmönvaihdin

NCX osallistuu Ca2+ – homeostaasiin puristamalla Ca2+ – soluista sähkökemiallista gradienttiaan vastaan (Blaustein and Lederer, 1999). NCX vaihto 3NA+: 1Ca2+, jossa Na + ja Ca2+ kuljetetaan erillisissä vaiheissa (Khananshvili, 1990). Yllättäen, kiderakenne NCX alkaen Methanocaldococcus jannaschii (NCX_Mj) paljasti neljä ionin sitoutumispaikat, samanaikaisesti käytössä kolme Na+ Ionia paikoissa kutsutaan Sint, Smid, Sekt, ja yksi Ca2+ ion paikassa kutsutaan SCa (Liao et al., 2012). Koska tämä sidontatila oli ristiriidassa aiempien tutkimusten kanssa, MD-simulaatiot ja mutanttien ionivuotoanalyysit tehtiin, mikä viittaa siihen, että Na + ionit miehittävät Sint, SCa ja Sekt, kun taas Ca2+ miehittää SCa (Marinelli et al., 2014; Giladi ym., 2016b; Giladi et al., 2017; van Dijk et al., 2018). Näin ollen Na+ ja Ca2+ ionit sitoutuvat toisensa poissulkevaan tapaan pitkin kuljetuskiertoa.

määrittääksemme kokeellisesti ionisitoutumispaikkojen osoittamisen vertasimme apo-tilaa NCX_MJ: n IONISITOUTUNEISIIN tiloihin HDX-MS: n avulla (Giladi et al., 2016a; Giladi et al., 2017). Alhaisesta sekvenssistä huolimatta analyysimme sisälsi 10 Ionia 12: sta koordinoivasta jäämästä. Havaitsimme Na+-riippuvaisen deuteriumin oton vähenemisen Sint: ssä, SCa: ssa ja Sekt: ssä, mutta emme Smid: ssä, kun taas Ca2+: n läsnä ollessa deuteriumin oton väheneminen havaittiin pääasiassa SCa: ssa. Tämä on yhdenmukainen MD-simulaatioiden ja mutaatioanalyysien tekemien ennusteiden kanssa, joissa Smid: n miehitys tapahtuu vesimolekyylillä, mutta ei na+: lla tai Ca2+: lla maatilassa (Marinelli et al., 2014; Giladi ym., 2016a; Giladi et al., 2017; van Dijk et al., 2018). Erityisesti myöhemmät kristallografiset tutkimukset ovat validoineet sidontapaikkojemme toimeksiannon (Liao et al., 2016). Näin HDX-MS vahvisti laskennallisten ja funktionaalisten tutkimusten ehdottaman ionisidontatilan.

Li+-kuljetettavan NCX-mutantin Ioniselektiivisyys

mitokondrion Na+ / Ca2+ – vaihdin (nclx) on poikkeuksellisen ioniselektiivinen, vaihtaa Ca2+: n joko Na+: aan tai Li+: aan, kun taas NCX: t eivät kuljeta Li+: aa (Palty et al., 2010). Vaikka tämän ioniselektiivisyyden fysiologinen merkitys on edelleen hämmentävä, on huomattava, että 9 (12: sta) nclx: n ioneja koordinoivaa jäämää eroaa NCXs: n ja muiden Ca2+/kationiantagonistien superperheen jäsenten jäämistä. Jotta ymmärtäisimme, miten nämä erot vaikuttavat ionisidontatunnistukseen ja kuljetukseen, suoritimme ncx_mj: n ionisidontajäämien rakenteen mukaisen korvaamisen jäljitelläksemme NCLX: n sitoutumispaikkoja (Refaeli et al., 2016). Silmiinpistävää on, että hiljattain suunniteltu konstruktio (nclx_mj) välittää Na+/Ca2+ ja Li+/Ca2+ vertailukelpoisilla Km-arvoilla (Refaeli et al., 2016).

seuraavaksi pyrittiin selvittämään, muistuttavatko nclx_mj: n ionisidontapaikat ncx_mj: n (Giladi et al., 2019). HDX-MS-analyysit ionien aiheuttamista konformaatiomuutoksista osoittivat, että SCa sitoo Na+, Li+ tai Ca2+, kun taas yksi tai useampi muu Nclx_mj: n Na+/Li+ – alue on yhteensopimaton NCX_Mj: lle osoitettujen alkuperäisten Na+ – alueiden (Sekt ja Sint) kanssa. Nämä tulokset viittasivat siihen, että NCLX_Mj voi kuljettaa ioneja, joiden elektroneutraalinen Stoikiometria on 2NA+:1ca2+ tai 2li+:1ca2+. HDX-MS-tietojen mukaisesti jännitteen kiristys nopeuttaa Na+/Ca2+ – vaihtokursseja NCX_Mj-rekonstruoiduissa proteoliposomeissa (3NA+: n stoikiometrialla:1Ca2+), kun taas sillä ei ole merkittävää vaikutusta Na+/Ca2+ tai Li+/Ca2+ vaihtokursseihin nclx_mj: ssä (Giladi et al., 2019).

tutkimuksemme ovat osoittaneet HDX-MS: n hyödyllisyyden ionikuljettajien sitoutumiskohtien tunnistamisessa ja validoinnissa, sillä suhteellisen pienet erot ionin indusoimissa ΔHDX-signaaleissa antavat tärkeää tietoa ionin selektiivisyydestä ja konformaatiomuutoksista, joita tapahtuu ionisitoutumisessa eri paikoissa. Näin ollen yhdessä MD-simulaatioiden ja röntgenkristallografian kanssa HDX-MS on erityisen houkutteleva ioniselektiivisyyden ja ionien aiheuttamien konformaatiomuutosten rakenteellisten taustatekijöiden selvittämisessä ionin kuljetusjärjestelmissä, joissa on useita ionisitoutumispaikkoja.

johtopäätökset

viimeisten vuosikymmenten aikana rakennebiologia on edistänyt valtavasti ymmärrystämme kalvoproteiinin toiminnasta, lähinnä tarjoamalla staattisia tilannekuvia diskreeteistä tiloista korkealla resoluutiolla. Täysin tulkita rakenne-funktio suhteita taustalla monimutkainen prosessi solute liikenteen, kasvava määrä kokeellisia ja laskennallisia menetelmiä on kehitetty kuromaan kuilu näiden staattinen tilannekuvia ja määrittää taustalla konformaatio maisemia. HDX-MS: ää käytetään yhä enemmän ehjien kalvoproteiinien tutkimiseen erilaisissa lähellä syntyviä olosuhteita, mikä tarjoaa uusia mahdollisuuksia tutkia kalvoproteiinien vuorovaikutusta, substraatin tunnistamista ja liikenteeseen liittyviä konformaatiomuutoksia. Instrumentoinnin ja data-analyysiautomaation tuleva kehitys saattaa mahdollistaa HDX-MS: n käytön suurella teholla hyödyntäen täysin sen potentiaalista käyttöä perustutkimuksessa ja biolääketieteellisissä sovelluksissa, kuten lääkesuunnittelussa.

Tekijäosuudet

MG ja DK tarkastelivat kirjallisuutta ja kirjoittivat käsikirjoituksen.

rahoitusta

työtä tukivat Israel Science Foundation (Grant #1351/18) (D. K) ja Israel Cancer Research Foundation (Grant #19202) (MG). Taloudellinen tuki Shmuel Shalit-palkinnosta DK: lle myönnetään kiitollisena.

eturistiriita

kirjoittajat toteavat, että tutkimus tehtiin ilman kaupallisia tai taloudellisia suhteita, jotka voitaisiin tulkita mahdollisiksi eturistiriidoiksi.