T-solujen aktivoituminen indusoi CD25: n ja Foxp3: n ilmentymistä, jotka liittyvät efektorin ja muistin fenotyypin erilaistumiseen
pbmc: tä stimuloitiin bryostatiini-1: llä (5 nM) ja ionomysiini (1 µm) (B/I), kun läsnä on 80 U/ml IL-2: ta (peprotech) 16 tunnin ajan. B / I-aktivaatio jäljittelee solunsisäisiä signaaleja, jotka johtavat T-solujen aktivoitumiseen lisäämällä proteiinikinaasi C: n aktiivisuutta ja vastaavasti solunsisäistä kalsiumia . Soluja pestiin kolme kertaa ja niitä viljeltiin 106 solua/mL täydellisessä väliaineessa 40 U/mL IL-2: lla (Peprotech) 3 päivän ajan, ja foxp3: n ilmentyminen määritettiin virtaussytometrian avulla. Foxp3: n ilmentyminen määritettiin myös vasta eristetyissä T-soluissa päivänä 0. Kuten kuvassa. 1A (yläpaneeli) pelkästään IL-2: n esiintyminen 3 päivän ajan ei merkittävästi lisännyt Foxp3: n tai CD25: n ilmentymistä lähtötason tasosta päivänä 0 (Kuva. 1C). B / I-aktivaatio indusoi kuitenkin Foxp3: n ja CD25: n ilmentymistä CD4+ – ja CD8+ T-soluissa (Kuva. 1A, keskimmäinen paneeli). B / I-aktivaation yhteydessä CD4 + CD25+ Foxp3+T-solujen määrä nousi 1%: sta 23%: iin (P = 0, 016) ja CD8+CD25+ FOXP3 + T-solujen määrä nousi 0, 6%: sta 9%: iin (P = 0, 013). Viljelyn jatkaminen IL-2: n läsnä ollessa 6 päivän ajan ilman uutta stimulaatiota CD4+CD25+Foxp3+ T-solut pysyivät aktivoimattomissa T-soluissa lähtötason yläpuolella (1% vs. 7%; P = 0, 031), kun taas CD8+CD25+Foxp3+ T-solut laskivat lähtötasolle (0, 6%). Nämä tulokset viittaavat siihen, että foxp3: n aktivaation aiheuttama ilmentyminen CD4+CD25+ T-soluissa on vakaampaa kuin CD8+CD25+ T-soluissa. T-solujen absoluuttinen määrä kasvoi 3 ja 6 päivää B/I-stimulaation ja laajenemisen jälkeen IL-2: n läsnä ollessa (Kuva. 1b). T-solujen aktivointi anti-CD3/CD28 Abs: n avulla kolmen päivän ajan tuotti samanlaiset tulokset kuin B/I-aktivaatiolla lisäämällä CD4+CD25+FoxP3+ T-soluja 0, 4%: sta 8, 7%: iin (Kuva. 1C). T-solujen fenotyyppianalyysit paljastivat CD44+ efektorin ja CD44+CD62L+ muistin fenotyypit ennen B/I-aktivaatiota ja 6 päivää sen jälkeen (kuva. 1D, yläpaneeli). Efektori CD4+ ja CD8+ T-solut vähenivät aktivoinnin jälkeen (18%: sta 9%: iin ja 21%: sta 13%: iin), kun taas muisti CD4+ – solut kasvoivat (82%: sta 91%: iin ja CD8+ T-solut 79%: sta 87%: iin). B / I-aktivaation yhteydessä CD4+ T-solujen foxp3-ekspressio lisääntyi 6-kertaisesti cd44+ -, CD62L+ – fenotyypeissä (CD44+: 2, 6% – 15%; CD62L+: 2% – 12%). Lisäksi sekä CD4+ – että CD8 + T-soluissa näkyi foxp3high-ilmentymä aktivoinnin jälkeen verrattuna foxp3low-lausekkeeseen päivänä 0 (Kuva. 1D, Keski-ja alapaneelit). Kaikki CD4+Foxp3 + T-solut ilmaisivat CD44: ää, joista 80% ilmaisi myös CD62L: ää (Kuva. 1D, keskimmäinen paneeli, äärioikealla). Nämä tiedot osoittavat, että 20% CD4+Foxp3+ T-soluista on efektoria ja 80% muistifenotyyppejä. Samanlainen fenotyyppinen suuntaus havaittiin CD8 + Foxp3+ T-soluilla, joista 100% oli CD44+ – soluja, joista 67% oli CD62L + T-soluja (Kuva. 1D, alapaneeli, äärioikealla). Nämä tulokset osoittavat, että 33% CD8+Foxp3+ T-soluista on efektoria ja 67% muistifenotyyppejä. Tiedot esitetään viikunoina. 1A-D viittaa siihen, että foxp3highin lisääntynyt ilmentyminen efektori – T-soluissa johtui solujen erilaistumisesta eikä solujen proliferaatiosta, koska cd44+CD62L-efektori-T-solujen suhteellinen prosenttiosuus väheni B/I-aktivaation jälkeen. Samanlainen mekanismi voi olla muisti-T-soluissa, koska foxp3high aktivaation jälkeen ilmenee verrattuna foxp3low ’ hun päivänä 0.
Foxp3-lauseke T-solujen aktivoitumisen jälkeen. T-solut eristettiin terveiltä vapaaehtoisilta ja jaettiin kahteen ryhmään. Kontrolliryhmä pysyi aktivoimattomana ja sitä viljeltiin IL-2: n läsnä ollessa 3 päivän ajan (a; yläpaneeli) ja toinen ryhmä aktivoitiin B/I: llä 16 tunnin ajan ja viljeltiin IL-2: n läsnä ollessa 3 päivän (a; keskipaneeli) tai 6 päivän (a; alapaneeli) ajan. CD4+-ja CD8+ T-solujen absoluuttiset määrät yhdistetyistä näytteistä määritettiin virtaussytometrianalyysillä (B) päivinä 0, 3 ja 6 viljelyn jälkeen. FoxP3: n ja CD25: n ilmentyminen määritettiin vasta eristetyissä CD4+ T-soluissa (päivä 0) ja 3 päivän anti-CD3/CD28 Abs (C) – stimulaation jälkeen. Vastaeristetyille ja B / I-aktivoiduille T-soluille tehtiin virtaussytometria T-solujen fenotyyppien määrittämiseksi (d; yläpaneeli); Foxp3+ efektori ja muisti T-solut määritettiin aidatuista CD4+Foxp3+ soluista tai aidatuista CD8+Foxp3+ soluista (D; alapaneeli). Kahdelta luovuttajalta on saatu edustavia tietoja päällekkäisissä kokeissa.
aktivaation indusoima FoxP3-ekspressio CD4+ T-soluissa ei kykene välittämään säätelytoimintaa in vitro
T-solut merkittiin CFE:llä ja stimuloitiin anti-CD3:lla (1 ug/ml) ja anti-CD28:lla (1 ug/ml) Abs: llä B/I-aktivoidun CD4+CD25: n läsnä ollessa tai ilman+foxp3+ T-solut (2: 1 ja 20: 1 vaste: vaimennussuhteet) 3 päivän ajan. Virtaussytometrian analyysi osoitti, että aidatuilla CD8+ T-soluilla oli samanlainen proliferaatio indusoituvien FoxP3+ T-solujen puuttuessa tai ollessa läsnä (Kuva. 2a, 60% vs. 61% ja 65%). CD3 / CD28-aktivaatio indusoi myös foxp3-ekspressiota vastaajien CD4+ T-soluissa. Aidatuilla CD4+FpxP3 + T-soluilla esiintyi myös 70-75% proliferaatiota aktivaation yhteydessä (Kuva. 2 A). T-solujen apoptoosin analyysi paljasti vastaavanlaisen apoptoosin esiintyvyyden vasteen saaneissa T-soluissa CD4+FoxP3+ T-solujen puuttuessa tai läsnä ollessa (Kuva. 2B, 57% vs. 57 ja 59%). Suurin osa B / I-aktivoiduista CD4+FoxP3 + T-soluista (74-76%) todettiin apoptoottisiksi anti-CD3/CD28-aktivaation aikana, kun niitä viljeltiin yhdessä vasteen saaneiden T-solujen kanssa.
T-solujen proliferaatio indusoituvien CD4+FoxP3+ T-solujen läsnä ollessa. Co-culture suppression assay-testin suorittamiseksi vaste-T-solut merkittiin CFE:llä ja niitä viljeltiin siten, että indusoituvia FoxP3+ T-soluja (20:1 ja 2: 1) ei ollut tai niissä oli erilaisia suhteita 3 päivän ajan anti-CD3/CD28 Abs-solujen läsnä ollessa. Aidatuilla CD8+ T-kennoilla näkyi CFSE-laimennus (a, vasen paneeli). Vastaajat CD4+ T-solut, jotka ilmaisivat FoxP3: n 3 päivän aktivaation vuoksi, myös aidattiin ja analysoitiin CFSE-laimennusta varten (A, oikea paneeli). Koeviljelmän suppressiotestillä (a, vasen paneeli) saadut solut värjättiin myös liitteen V osalta apoptoosin määrittämiseksi vasteen saaneissa CD8+ T-soluissa (B, vasen paneeli) ja B/I-aktivoiduissa CD4+FoxP3+ T-soluissa (B, oikea paneeli).
T-solujen allogeeninen aktivaatio MLR: n aikana indusoi Foxp3: n ilmentymistä CD4+CD25+ T-soluissa, mikä liittyy efektori/muisti-fenotyyppiin
suoritimme 8 päivää kestäneen allogeenisen MLR: n selvittääksemme, oliko Foxp3: n ilmentymisen induktio T-soluissa stabiili MLR: n aikana ja voisiko tällainen indusoitu Foxp3+ – ilmentymä estää Foxp3: n aktivoitumista CD4 + CD25 + T-soluissa.T-solujen lisääntyminen. Vaste-ja stimulaattorisoluja saatiin eri terveiltä luovuttajilta. Stimulaattorisoluja säteilytettiin (5000 rad) ja niitä viljeltiin vastesoluilla 8 päivän ajan 10 µM BrdU: n (BD Pharmingen) läsnä ollessa. Tämän jälkeen solut värjättiin asiaankuuluvalla Abs-aineella ja niille tehtiin virtaussytometriakoe. Kuten kuvassa. 3a (yläpaneeli) 86% CD4+CD25+ T-soluista ja 93% CD8+CD25+ T-soluista osoitti brdu: n inkorporoituvan solujen proliferaation seurauksena. Proliferaatiota ei havaittu pelkissä vaste-tai stimulaattorisoluissa (tietoja ei näy). Tällainen allogeeninen proliferaatio tapahtui aktivaation indusoiman Foxp3-ekspression läsnä ollessa CD4+ T-soluissa siten, että 8% CD4+ T-soluista oli CD25+Foxp3+ (Kuva. 3a, alapaneeli). CD8 + CD25 + T-solut sen sijaan eivät osoittaneet foxp3: n stabiilia ilmentymistä. Nämä tulokset ovat yhdenmukaisia havaintomme Fig. 1 osoittaa, että Foxp3: n ilmentyminen CD4+ T-soluissa on vakaampaa kuin CD8+ T-soluissa 6-8 päivää T-solujen aktivoitumisen jälkeen. Aiemmissa raporteissa tehtiin in vitro suppressiivisia määrityksiä, joissa CD4+CD25+ T-solujen (Tregs) suhde vastesoluihin oli suuri T-solujen aktivaation ja proliferaation suppressiivisen toiminnan määrittämiseksi. Tällainen CD4+CD25+ T-solujen ja vastetta saavien solujen välisen suhteen keinotekoinen lisääminen vähentäisi havainnon in vivo pätevyyttä. CD4 + CD25+ Foxp3 + T-solujen indusoitumistiheys MLR: n aikana oli 8%, minkä katsotaan olevan fysiologisesti merkityksellisellä alueella muiden ryhmien ilmoittamalla tavalla . Luonnossa esiintyvien Tregien esiintymistiheys hiirellä on myös tämän vaihteluvälin tuntumassa, mutta niillä on kuitenkin säänteleviä vaikutuksia autohimmuniteetin estoon. Jos CD4+ T-soluja ilmentävällä Foxp3: lla oli jokin säätelytehtävä, sen olisi pitänyt estää solujen proliferaatiota in vitro-viljelyn aikana. Samanlainen kuin B / I-indusoitu T-solujen aktivaatio, T-solujen fenotyypit MLR: ssä sisälsivät CD44+ efektoria (16%) ja CD44+CD62L+ muisti-T-soluja (84%) (Kuva. 3b). Jälleen kaikki CD4+Foxp3 + T-solut ilmaisivat CD44: ää, joista 90% ilmaisi myös CD62L: ää (Kuva. 2b). Nämä tiedot osoittavat, että 10% CD4+Foxp3+ T-soluista on efektoria ja 90% muistifenotyyppejä. Samanlainen fenotyyppinen suuntaus havaittiin CD8 + Foxp3+ T-soluilla, joista 100% oli CD44+ – soluja, joista 76% oli CD62L + T-soluja. Nämä tulokset osoittavat, että 24% CD8+Foxp3+ T-soluista on efektoria ja 76% muistifenotyyppejä. Näiden Foxp3+ T-solujen säätelytehtävien puuttuminen saattaa johtua niiden efektori / muisti-fenotyypistä, sillä on raportoitu, että Foxp3: n ilmentyminen ihmisen muisti-T-soluissa johti vaimentavan aktiivisuuden vähenemiseen . Lisäksi Treg type 1 (Tr1) – solut antavat vaimentimen toiminnan ilman FoxP3-lauseketta . Kun otetaan huomioon foxp3: n rooli Treg-sukulinjan sitoutumisen ja ylläpidon pääsääntelijänä hiiressä , sillä ei näytä olevan tällaista bona fide-sääntelytehtävää Treg-sukulinjan sitoutumiselle ihmisen T-soluissa.
Foxp3-lauseke allogeenisen MLR: n jälkeen. Solut analysoitiin virtaussytometrialla 8 päivän MLR: n jälkeen. Brdu: n inkorporaatio määritettiin aidatuilla CD4+CD25+ tai CD8+CD25+ T-soluilla (a; yläpaneeli). Aidatut CD4 + – tai CD8+ T-solut analysoitiin CD25+Foxp3+ – solujen havaitsemiseksi (a; alapaneeli). Aidatut CD4+ T-solut (B; yläpaneeli) tai CD8+ T-solut (B; alapaneeli) analysoitiin cd44: n, CD62L: n ja Foxp3: n ilmentymistä varten. CD44+ – ja CD62L+T-solut määritettiin porttaamalla CD4+ Foxp3+ – tai CD8+ Foxp3 + T-soluihin. Kahdelta luovuttajalta on saatu edustavia tietoja päällekkäisissä kokeissa.