Discussion
tässä työssä ehdotettu image cytometry-menetelmä osoittaa kyvyn analysoida nopeasti ja tehokkaasti autofagiaa elävissä soluissa sellaisten mahdollisten lääkkeiden seulomiseksi, jotka voivat indusoida tai estää autofagisia toimintoja, kuten edistää neurodegeneraatioon liittyvien väärin sidottujen proteiinien puhdistumaa tai estää syöpään liittyvää lääkeresistenssiä. Nykyisten menetelmien rajoitukset voidaan poistaa kuvasytometrialla ja ainutlaatuisilla reagensseilla, jotta voidaan kehittää uudenlainen menetelmä autofagian havaitsemiseksi. Solumittarinäköä on aiemmin käytetty fluoresoivissa solupohjaisissa määrityksissä (Chan et al., 2011, 2012b; Robey et al., 2011), ja Cyto-ID autophagy-väriaineen on osoitettu erityisesti värjäävän autofagosomeja elävissä soluissa. Tässä työssä Cyto-ID-väriaineen on osoitettu kolokalisoituvan RFP-LC3: lla nälkiintyneissä HeLa-soluissa, mikä vahvistaa edelleen väriaineen spesifisyyttä. Kehitettyä kuvapohjaista autophagy detection-menetelmää verrataan standardivirtaussytometriaan vertaamalla autofagia-aktiivisuustuloksia ravinteiden näännyttämissä Jurkat-soluissa. Tulokset osoittivat fluoresoivan intensiteetin lisääntyvän ravinneköyhissä soluissa ja vähentyvän talteen otetuissa Jurkat-soluissa. Kuvasytometrian mitatut AAF-arvot ovat kuitenkin huomattavasti virtaussytometriaa korkeammat, mikä voi johtua instrumentoinnin ja menetelmien eroista. Cellometer Vision image cytometer käyttää varauskytkettyä laitetta fluoresenssin mittaukseen, kun taas FACS Calibur flow cytometer käyttää valokertoimiputkea (PMT). Lisäksi fluoresoivien intensiteettien analysointimenetelmä erosi näiden kahden järjestelmän välillä. Virtaussytometri mittaa jokaisen solun kokonaisfluoresenssisignaalit, kun taas kuvapohjainen järjestelmä hankkii kuvia ja analysoi solujen sisällä fluoresoivasti värjättyjä autofagosomeja, mikä voi antaa tarkempia autofagiaktiivisuuden mittauksia. Solumittariohjelmisto voi analysoida solujen fluoresenssia laskemalla yhteen kunkin solun fluoresoivien pikselien kokonaismäärän tai mittaamalla vain kunkin solun autofagosomien suuren fluoresoivan intensiteetin pikseleitä. Toinen ero voi johtua virtaussytometrian leikkausjännityksestä, joka vaikuttaa kohdesolujen elinkelpoisuuteen (Robey et al., 2011).
Autofaginen flux on myös tärkeä määritys uudenlaisen havaitsemismenetelmän kehittämisessä. CQ: ta käytetään estämään autofagosomien lysosomaalista hajoamista, jossa autofaginen aktiivisuus olisi suurin ravinteiden nälkiintyneissä Jurkat-soluissa CQ: n läsnä ollessa hoitojen välisen synergistisen vuorovaikutuksen vuoksi. Seuraavaksi korkein olisi jurkat solut nälkään ilman CQ. JURKAT-solut, joilla on vain CQ, lisäisivät autofagista aktiivisuutta vain hieman verrattuna kontrolliin, koska basaaliset autofagolysosomit kertyvät. Molemmista instrumenteista saadut autofagiset vuon tulokset osoittivat samansuuntaisia suuntauksia, mutta kuvasytometriassa mitatut AAF-arvot ovat huomattavasti korkeammat. Nämä tulokset osoittivat, että kuvasytometrinen detektiomenetelmä voitaisiin helposti ottaa käyttöön autofagian aktiivisuuden tutkimiseksi, vaikka AAF-arvojen kvantitatiiviset erot saattavat olla instrumenttikohtaisia.
sen osoittamiseksi, että kuvasytometria voi olla mahdollinen huumelöydösten seulontatekniikka, on testattava kyky analysoida näytteitä useissa olosuhteissa. Kuvasytometriaa käytetään Rapamysiinillä käsiteltyjen Jurkatin solujen autofagisen aktiivisuuden mittaamiseen eri pitoisuuksina, jotta voidaan osoittaa kuvasytometrian kyky mitata annos-vastevaikutuksia aikajaksotutkimuksessa. Tämän seurauksena kuvapohjainen sytometria pystyy havaitsemaan autofagisen aktiivisuuden erot eri koeolosuhteissa. Kuvassa. 8.6, autofaginen aktiivisuus (AAF-arvoilla mitattuna) on suurin 18 tunnin inkubaation jälkeen. AAF-arvojen lievä lasku näkyy 8-4 tunnin inkubaation välillä, mikä voi johtua siitä, että solut eivät pääse täysin palautumaan alkuperäisen lääkehoidon jälkeen. Lisäksi kiinni olevia soluja, kuten ihmisen eturauhassyöpäsolulinjaa (PC-3), voidaan mitata myös kuvasytometriamenetelmällä. Cellometer Visionin kuvantamisresoluutiolla voidaan analysoida fluoresenssilla merkittyjä autofagosomeja (puncta), joita havaitaan sekä fluoresoivissa kuvissa että fluoresenssin intensiteettihistogrammeissa.
on myös tärkeää osoittaa kyky luonnehtia eri lääkeyhdisteitä vertaamalla niiden autofagista annos–vastevaikutusta huumeen löytökampanjoissa. Tamoksifeenin ja rapamysiinin annosvastevaikutuksia verrataan suoraan kuvasytometrialla. Tulokset 18 tunnin inkubaatiossa osoittivat, että rapamysiini indusoi suuremman autofagiaktiivisuuden kuin tamoksifeeni. On tärkeää huomata, että tamoksifeeni on 100 µM: n pitoisuuksina erittäin sytotoksinen, mikä johtaa Jurkatin solujen kuolemaan ja hajoamiseen 18 tunnin inkubaation jälkeen. Tamoksifeenin sytotoksisuusvaikutuksen kuvantamisperusteinen todentaminen suurina pitoisuuksina voi olla erittäin hyödyllinen, jotta voidaan poistaa epävarmuustekijät pelkästä hajontakuvastosta ja histogrammituloksista.
Kuvasytometria on osoittanut vertailukelpoiset tulokset fluoresoivan solupohjaisen analyysin standardivirtaussytometriaan (Chan et al., 2011; Robey et al., 2011). Kuvapohjainen sytometriamenetelmä voi tarjota useita etuja virtaussytometriaan verrattuna. Esimerkiksi kutakin näytettä varten tarvittavien solujen määrä (10-20 µL) on huomattavasti pienempi kuin tavanomainen virtaussytometri (300-500 µL). Virtaussytometrin alkuasetus edellyttää, että osaa kohdesolun näytteistä käytetään PMT-jännitteiden ja kompensaation säätöön. Toisaalta monet kuvasytometrit pipetoivat soluja laskentakammioon, joka voidaan tarkistaa useita kertoja. Siksi kohdesolunäytteitä ei tuhlata valotusajan säätämisen ja tarkennuksen alustavan optimoinnin aikana. Vielä tärkeämpää on, että Br-ja fluoresoivien kuvien hyödyntäminen antaa tutkijoille mahdollisuuden tarkistaa hankitut fluoresenssitiedot silmämääräisesti. Tämä voi auttaa tunnistamaan sytotoksisuuden autofagiaa aiheuttavan lääkehoidon komplisoivana sivuvaikutuksena.
autofluoresenssi voi tapahtua käyttämällä Cyto-ID vihreää autophagy-väriainetta, joka johtuu muovisesta laskentakammiosta, mutta ohjelmisto voi automaattisesti poistaa taustasignaalin saadakseen todellisen kohdefluoresenssin muuttamatta AAF-laskentaa. Lisäksi loisteputkien valonläpäisy solupohjaisissa määrityksissä on minimoitu, koska Solumittarin visio käyttää pienitehoisempia ledejä verrattuna muissa instrumenteissa käytettäviin suuritehoisiin lasereihin. Cellometer-kuvan sytometrin tuleva parannus olisi kehittää suurempi läpimenokykyinen automatisoitu järjestelmä, joka voi analysoida enemmän soluja parantaakseen tilastollista analyysiä sekä kykyä analysoida useita näytteitä samanaikaisesti, mikä helpottaa autofagian, apoptoosin, nekroosin ja muiden fysiologisten ilmiöiden estäjien ja aktivaattoreiden suuremman läpimenokyvyn solupohjaista huumeseulontaa.