keskustelu
tuloksemme osoittavat, että huolellisen suunnittelun, koulutuksen ja reagenssien ja protokollien standardoinnin avulla kansainvälinen laboratorioverkosto pystyy tuottamaan yhdenmukaisia ja vertailukelpoisia HAI-määritystuloksia. Tutkimukseen osallistuneet viisi kansanterveyslaboratoriota ja akateemista laboratoriota olivat osa PCIRN: ää, joka kehitettiin lisäämään Kanadan kansallista valmiutta tukea rokote-ja muuta influenssatutkimusta pandemian sattuessa. Pandemiatilanteessa, jossa tehdään suuria määriä, korkeapaineisia ja maantieteellisesti hajanaisia influenssatestejä, HAI-määrityksen standardointi on ensiarvoisen tärkeää tulosten vertailtavuuden varmistamiseksi laboratorioiden välillä. PCIRN-laboratoriot osoittivat laboratorionsisäisen uusittavuuden korkean tason, 99,8%: n toistotarkkuudella (99.2 – 100% laboratoriota kohti), 97, 8% tittereistä 2-kertaisella vaihteluvälillä toistettujen määrityspäivien aikana (93, 3-100% laboratoriota kohti) ja 91, 1% testiseerumista, joissa titterin uusittavuus ilmeni jokaisen kuuden määritysprotokollan uusinnan aikana (60-100% laboratoriota kohti). Myös laboratorioiden välinen uusittavuus oli korkea, ja mediaanititterit kaikissa neljän vertailulaboratorion rinnakkaisnäytteissä olivat 2 – kertaiset verrattuna vertailulaboratorioon 100-prosenttisesti testatuista seerumeista. Laboratoriokohtaisesti titterit ovat 94,3% ja 98%.9% näytteistä, jotka on kvantifioitu vertailulaboratorion yhden laimennoksen sisällä, ja konsensustitterit (vaihteluväli 85-100% ja 95-100%). Nämä prosenttiosuudet täyttävät HAI-määrityksen vaihtelevuuden tyypilliset hyväksyttävyysrajat (eli vähintään 80 prosenttia näytteistä saa olla enintään 1 nimellisarvojen laimennoksen ja/tai all-assay GMT-määrityksen rajoissa ). HAI-määrityksen spesifisyys (100%) ja herkkyys (87, 5% – 100%) PCIRN-laboratorioissa täyttyivät samoin hyvin aiempien tutkimusten hyväksymiskriteereissä (ts. Negatiivisista näytteistä 100 prosenttia on kvantifioitava alle määritystason ja vähintään 80 prosenttia positiivisista näytteistä on kvantifioitava positiivisina).
HAI-määrityksen vaihtelun intralaboratorisen komponentin toistettavuus PCIRN-laboratorioissa näyttää samanlaiselta kuin muissa tutkimuksissa (5, 22). Yksi varoitus näistä aiemmista tutkimuksista oli, että enintään kolme toistoa tutkittiin, vaikka immuunimäärityksen validointikäytännöt olivat yleisiä, kun tutkittiin kuutta tai useampaa toistuvaa määritystä (24-27). Näin ollen ei ole selvää, ovatko heidän tietonsa suoraan verrannollisia tämän tutkimuksen kuuden määrityksen tuloksiin. Siitä huolimatta havaintomme 0-6, 7% (mediaani 0%) määrityksistä, joiden tulokset poikkeavat yli 2-kertaisesti muiden määritysten tuloksista, näyttävät olevan verrattavissa aiemmin yhdessä laboratoriossa (22) todettuun 4, 8-7, 1%: iin ja yhdeksässä laboratoriossa (5) todettuun 0-15%: iin (mediaani 2%).
havaintomme korkean HAI-titterin toistettavuudesta maantieteellisesti hajallaan olevien PCIRN-laboratorioiden välillä ovat ristiriidassa aiempien raporttien kanssa, jotka osoittavat merkittävää vaihtelua tätä määritystä suorittavien kansainvälisten laboratorioiden välillä (5, 6, 9-12). Esimerkiksi laajasta yhteistyössä tehdystä tutkimuksesta (11 laboratoriota) saadut tiedot, joissa GCV: tä näytettä kohti todettiin 84-803% (mediaani GCV virusta kohti 138%, 155% ja 261%). Muissa tutkimuksissa H1N1-ja H5N1-näytteiden GCVs-arvot olivat 95-345% (11) ja 22-582% (6), ja GMT-arvot erosivat laboratorioiden välillä jopa 80-kertaisesti (11) tai 128-kertaisesti (9). Aiemmissa raporteissa oli usein enemmän osallistuvia laboratorioita kuin nykyisessä tutkimuksessa, mutta silloinkin kun vain kuusi laboratoriota toimitti tietoja, laboratorioiden välisen ylimmän LABORATORIOARVON mediaani oli 83% viidestä H1N1-näytteestä, ja 80% niistä ylitti 4-kertaisen eron laboratorioiden välillä (11). Tämänhetkinen tutkimus sen sijaan osoitti, että GCVs: n mediaani virusta kohti oli vain 39% ja 17%, ja 95% näytteistä oli 4-kertainen ero laboratorioiden välillä. Yksi näyte ylitti nelinkertaisen eron; titteriä ei voitu kvantifioida tämän näytteen osalta yhdessä laboratoriossa, joten alin arvo määritettiin eikä mitattu. Jos tämä otos jätettäisiin pois analyyseistä, ylempänä korkeampana kasvutekijänä olisi 75,5 prosenttia, mikä merkitsisi alhaisempaa arvoa kuin muiden tutkimusten ylempänä korkeana kasvutekijänä käytettävä vähimmäisarvo. Vaikka kyseisessä näytteessä vaihtelu oli suurempaa kuin muissa, tämä Matala mittausalue näytti yleisesti ottaen epätarkemmalta kuin korkeammat vaihteluvälit. Esimerkiksi ylemmät VIRUSMÄÄRÄT vaihtelivat 43,4 prosentista 156,4 prosenttiin 10-80 titterissä, kun taas 11,1 prosentista 53,1 prosenttiin korkeammilla tittereillä (Kuva. 3). Aiemmin on myös kuvattu suurempaa vaihtelua alemman titterin näytteissä (23), ja se todennäköisesti vaikutti ristiriitaisiin serosuojaluokituksiin nykyisessä tutkimuksessa kolmen H1N1-näytteen osalta, joiden titterit olivat lähimpänä kynnysarvoa 40 (konsensustitterit 22, 24 ja 43). Tästä huolimatta serosuojauksen diagnostinen tarkkuus PCIRN-laboratorioissa pysyi yleisesti ottaen korkeana (93, 6%, Kun serosuojauksen määrittelyssä käytettiin konsensustittereitä, ja 89, 5% vertailulaboratorioarvoihin verrattuna).
pcirn-laboratorioiden laboratorioiden HAI-tiittereiden suuri yksimielisyys voi liittyä HAI-määritysmenetelmien ja reagenssien huolelliseen yhdenmukaistamiseen koko PCIRN-alueella. Aikaisempien tutkimusten osallistujat, jotka osoittivat suurta laboratorioiden välistä vaihtelua, käyttivät yleensä HAI-määritysmenetelmiä, jotka vaihtelivat laboratorioiden välillä. Määritysmuuttujat, joiden arveltiin vaikuttavan tulosten vaihteluun, sisälsivät lisätyn viruksen määrän, virusviljelyjärjestelmän (esim., alkioon otetut kananmunat vs. kudosviljelmä), RDE-hoidon kesto, ensimmäinen seerumilaimennos, Käytettyjen punasolujen tyyppi ja ikä sekä punasolujen asettumiseen varattu aika (5, 11, 12). Yllättävää kuitenkin, kun Wood et al. edellyttäen, että kausi-influenssarokotteiden testaukseen Euroopassa osallistuvilla kaupallisilla ja julkisilla laboratorioilla oli käytössään yksityiskohtainen standarditoimintamenettely ja yhteiset reagenssit/materiaalit, ne ilmoittivat, että laboratorioiden välinen vaihtelu ei merkittävästi parantunut (10). Kirjoittajat arvelivat, että jatkuvat ”paikalliset TEKNISET vaihtelut” sekä erilaiset RBC-toimittajat saattoivat vaikuttaa laboratorioiden väliseen uusittavuuteen, mutta totesivat, että standardoinnin jatkaminen ylitti niiden tutkimuksen toteutettavuuden rajat. Myöhemmissä julkaisuissa nämä havainnot tulkittiin siten, että HAI-määrityksen standardointi laboratorioiden välillä ei yleensä ole toteuttamiskelpoinen lähestymistapa HAI-tulosten yhdenmukaistamiseksi eri laboratorioissa (8, 12), ja ainakin yksi ryhmä on yrittänyt kehittää muokattua ja vankempaa HAI-määritystä luotettavampien ja toistettavissa olevien tietojen tuottamiseksi (22).
nykyisessä tutkimuksessa PCIRN-laboratoriot noudattivat tiukasti Maailman terveysjärjestön hai-määritysprotokollaa, jossa teknisistä tai tulkinnallisista muutoksista johtuvat kohdat yhdenmukaistettiin laboratorioiden välillä ennen tutkimuksen aloittamista. Keskeiset reagenssit (esim.RDE, RBC, virusvarastot) saatiin samoilta toimittajilta niin paljon kuin mahdollista. Lisäksi testauksen rajoittaminen yhteen tekniikkaan kussakin testipaikassa mahdollisti standardoinnin lisäämisen. Tässä tutkimuksessa ei selvitetty, onko mahdollista, että kussakin laboratoriossa käytetään useita työntekijöitä. Vaikka useiden toimijoiden käyttö voisi mahdollisesti lisätä vaihtelua, ainoassa tutkimuksessa, jossa tarkasteltiin tätä mahdollisuutta HAI-testaukseen, ei havaittu merkittävää eroa kahden toimijan saman laboratorion tulosten välillä (22).
testiin kasvatettujen viruskantojen mahdolliset vaihtelut laboratorioiden välillä minimoitiin PCIRN-laboratorioiden välillä käyttämällä yhdestä lähteestä peräisin olevia, samassa solulinjassa samanlaisissa olosuhteissa kaikissa laboratorioissa kasvatettuja virussiemenkantoja. Arvelemme, että laboratorioiden välinen uusittavuus voisi olla vielä parannettavissa, jos viruskäyttövarastot tuotettaisiin keskitetysti ja jaettaisiin osallistuviin laboratorioihin. Viruskannan vaihtelujen merkitystä HAI: n päätetittereissä kuvaa hyvin se, että eräässä tutkimuksessa osoitettiin 2-3 kertaa pienemmät titterit, kun HAI-määrityksessä käytettiin A/Cal pH1N1-kantaa verrattuna x179a-reassortanttiin, jolla oli vielä vastaavat hemagglutiniinit ja neuraminidaasit (11). Valitettavasti varastoja ei jaksotettu osana tätä tutkimusta, joten emme voi varmistaa, että kaikissa laboratorioissa käytettiin viruksia, joissa oli identtiset hemagglutiniinisekvenssit. Vaikka viruskantojen paikallinen leviäminen olisikin tuonut mukanaan pieniä sekvenssivaihteluja, tässä tutkimuksessa laboratorioiden välinen vaihtelu oli pientä, joten on vaikea kuvitella, miten sellaisten kantojen käyttö, joissa on samanlaiset HA-sekvenssit, vähentäisi vaihtelua entisestään. Vaikka erot eivät ylittäneetkään 2-kertaisia tässä pienessä näytejoukossa, viruskantojen paikallisen lisääntymisen aiheuttamat pienet HA-sekvenssin vaihtelut voivat olla yksi mahdollinen selitys H1N1-titterien aliarviointiin ja H3N2-titterien yliarviointiin.
useat tutkimukset ovat raportoineet HAI-tiittereiden välisen vaihtelun vähentyneen kalibroimalla tuloksia kansainvälisten standardien (6, 11-13) perusteella; tällaisia standardeja ei kuitenkaan ole olemassa nykyisille kausi-influenssa B-ja influenssa A H3N2-viruskannoille, ja kausikantojen jatkuva antigeeninen kulkeutuminen, joka johtaa rokotteiden vuosittaiseen uudelleenmuotoiluun, saattaa hyvinkin edellyttää uusien standardien jatkuvaa kehittämistä ja validointia. Tässä tutkimuksessa laboratorioiden välinen vertailtavuus näyttää olevan parempi kuin tehokkaimpienkin kalibrointistandardien avulla saavutettu. Esimerkiksi kalibroinnin jälkeen on 09/194, Wood et al. (11) ilmoitti, että GMT: iden väliset enimmäistasoerot eri laboratorioissa pienenivät 80-64-kertaisiksi (eli arvo on edelleen huomattavasti suurempi kuin nykyisen tutkimuksen maksimiarvo 11-kertainen) ja että ylimmän GCV: n vaihteluvälit laboratorioiden välillä pienenivät 95—345-34-231-34-231-34-231-prosentteina (mediaani 109-109-prosentteina) – eli selvästi yli 0-156-156-prosenttisen (mediaani 27%) tässä tutkimuksessa. Samoin korvaavan aineen käyttö on 10/202 vähentänyt ylempänä lämpöarvona laboratorioiden välillä 108-157%: sta 24-144%: iin viidessä näytteessä ja suurimmat erot laboratorioiden välillä 43-kertaisesta 21-kertaiseen (13), ja 07/150-standardia käyttäen Stephenson et al. (6) vähensi 15 NIBRG-14 H5N1-kladi-1-kladin mediaania 125%: sta (vaihteluväli 31%: sta 582%: iin) 61%: iin (34%: sta 535%: iin).
vaikka tarkkaa syytä(syitä) PCIRN-laboratorioiden aikaisempiin tutkimuksiin verrattuna ei voida selvittää, onnistumistamme helpotti se, että meillä oli kansallisena verkostona kannustin pyrkiä yhteiseen tavoitteeseen luoda toistettavissa olevia prosesseja. Yksityiskohtainen ja tiukka prosessi ja reagenssin yhdenmukaistaminen laitosten välillä on ehkä ainoa” uusi ” näkökohta, jonka toimme tähän tutkimukseen, verrattuna pitkään jatkuneeseen kirjallisuuteen, joka osoittaa huonoa HAI-toistettavuutta laboratorioiden välillä. Tietomme viittaavat kuitenkin siihen, että huolellisella standardoinnilla HAI-tiittereiden väliset laboratoriovaihtelut voidaan vähentää samansuuruisiksi kuin yksittäisissä laboratorioissa. Mahdollisia seuraavia toimia HAI-titterien vaihtelun minimoimiseksi laboratorioissa maailmanlaajuisesti ovat verkostojen/konsortioiden mobilisointi, standardimenetelmien ja reagenssien käyttöä koskevien ohjeiden ja/tai sääntelyvaatimusten täytäntöönpano, standardoitu koulutus uusittavuuden varmistamiseksi sekä tuen ja/tai kannustimien tarjoaminen laboratorioille standardoinnin käsitteen omaksumiseksi.