4.3 BBB-crossing bsabs suunniteltu yhden domeenin vasta-aineilla
sdAbs ovat pieniä (15 kDa), monomeerisiä antigeenejä sitovia vasta-ainepartikkeleita, jotka tarjoavat erilaisia etuja muihin vasta-ainepartikkeleihin verrattuna bsabs: n ”rakennusosina”. Ne esiintyvät luonnossa raskasketjuisten vasta-aineiden antigeenia sitovana osana kamelilajeilla (nimeltään VHH) ja rustokaloilla (nimeltään vnar) tai voidaan tuottaa tavanomaisista IgG: istä hankkimalla tai suunnittelemalla monomeerisia, stabiileja VH-tai VL-domeeneja (Hamers-Casterman et al., 1993; Hussack ym., 2012; Kim et al., 2014; Nuttall, 2012; Ward, Güssow, Griffiths, Jones, & Winter, 1989). sdab: t ovat erittäin stabiileja ja kompakteja, ja ne pääsevät käsiksi syvennettyihin epitooppeihin proteiineissa, kuten reseptoreiden onteloihin tai entsyymien aktiivisiin kohtiin, jotka ovat usein ”piilossa” tavanomaisilta IgG: ltä ja voivat saavuttaa tavoitesitoutumisvaikutuksia, jotka ovat verrattavissa tavanomaisiin vasta-aineisiin (Lauwereys et al., 1998; Staus et al., 2014). Nämä monomeeriset antigeenisidontayksiköt eivät Parita kevyiden ketjujen kanssa, mikä tekee niistä erinomaisia rakennuspalikoita heterodimerisoiduille bsab: ille, koska ne välttävät vääränlaisen valoketjuparituksen (Hamers-Casterman et al., 1993; Saerens, Ghassabeh, & Muyldermans, 2008). Heterodimeerisiä bsab-haaroja voidaan luoda siten, että toinen tai molemmat ”käsivarret” ovat SDA-haaroja, joista jälkimmäinen muistuttaa rakenteeltaan kamelien raskasketjuisia vasta-aineita (Fig. 3 E). sdab: tä voidaan käyttää myös erilaisissa mono-, bi-tai tetravalenteissa fuusioissa tavanomaisten terapeuttisten vasta-aineiden tai Fabs: n kanssa (Fig. 3E), jolloin syntyy yleensä pienempiä, vähemmän monimutkaisia molekyylejä verrattuna niihin, joiden rakenneosina on scFvs tai Fabs, jotka ovat yleensä biofyysisesti hyvin käyttäytyviä ja helposti tuotettavia (Holliger & Hudson, 2005). Vhhs: n humanisointi sekä sdabs: n suunnittelu on hyvin kuvattu, mikä mahdollistaa helposti ihmisen(ized) sdab: iden tuottamisen optimaalisella kohdeaffiniteetilla ja poikkeuksellisilla biofysikaalisilla ominaisuuksilla (Vincke et al., 2009).
kamelidi VHH FC5: n mahdollisen käytön arvioimiseksi BBB: n kantajana keskushermostoon kohdistuvien BISPECIFIC CNS-kohdistuvien vasta – aineiden sisällä FC5: n monovalentteja ja bivalentteja fuusioita (n-ja C-terminus) ihmisen Fc: n kanssa suunniteltiin ja arvioitiin in vitro ja In vivo (Farrington et al., 2014). Bivalentin FC5Fc-fuusion näennäinen sitoutumisaffiniteetti (kdapp) rotalle oli 75 nM, kun taas monovalentti FC5Fc-sitoutuminen oli mikromolaarisella alueella. Analyysit näennäisestä transmigraationopeudesta (Papp) in vitro BBB-mallissa, systeemisesti annettujen vasta – ainerakenteiden seerumin/aivo-selkäydinnesteen farmakokinetiikasta ja farmakologisista vasteista, jotka johtuvat kemiallisesti konjugoituneista BBB-läpäisemättömistä neuroaktiivisista peptideistä Hargreaves-kipumallissa, edellyttäen, että näiden FC5: n välittämien suurten (75 kDa) vasta-ainemolekyylien lisääntyneestä BBB-kuljetuksesta: (1) in vitro Papp-arvot olivat ~ 200 cm/min sekä mono-että bivalenteilla n-terminaalisilla Fc-fuusiomolekyyleillä (FC5Fc)) verrattuna 4-8 cm/min ohjaukseen vhh A20.1Fc – tai EG2Fc-fuusiot; (2) fc5fc–fuusion näennäinen KESKUSHERMOSTOALTISTUS oli 30-kertainen kontrollialueen vasta–aine-Fc-fuusioihin verrattuna; (3) fc5fc-konjugaattien systeeminen farmakologinen teho neuropeptidien dalarginin tai galaniinin kanssa Hargreaves inflammatory pain model-tutkimuksessa oli jopa 60-kertainen monomeerisiin FC5-neuropeptidikonjugaatteihin verrattuna. Tämä tulos johtui fc5fc: n pitkästä verenkierron puoliintumisajasta (~ 96 h) verrattuna FC5-neuropeptidikonjugaatteihin; (4) eri kontrollien VHH–Fc-neuropeptidikonjugaateissa ei havaittu systeemistä tehoa; (5) FC5: n yhdistäminen Fc: n C-päätepisteeseen johti heikentyneeseen BBB-risteyskapasiteettiin. Toisin kuin TFR: ään kohdistuvilla BBB-kantajaproteiineilla, sekä mono-että bivalenteilla fc5fc-fuusioproteiineilla oli sama transkytoosin esiintymistiheys in vitro, samanlaiset plasman/aivo-selkäydinnesteen farmakokineettiset profiilit ja samanlainen systeeminen teho farmakodynamiikkamallissa in vivo huolimatta eroavaisuuksista ilmeisessä sitoutumisaffiniteetissa ja valenssissa (Farrington ym., 2014). Nämä tutkimukset osoittivat, että BBB-crossing yhden domeenin vasta FC5 voidaan käyttää alustan BBB kantajana molemmissa, heterodimerized ”puoli-vasta” ja helpommin skaalautuva bi-tai tetravalent fuusio tavanomaisiin IgGs (Farrington et al., 2014).
toinen vhhs: n potentiaalinen etu BBB: n kantajina on niiden luonnollinen vastustuskyky äärimmäisiä biofyysisiä haasteita, kuten lämpötilaa ja pH: ta, sekä proteaasin hajoamista vastaan (Kim et al., 2014), joita tavataan usein erilaisissa endosyyttisissä osastoissa transkytoosin aikana. Sekä FC5 – että FC5Fc-fuusiot sisäistyvät BEC: ksi klatriinipäällysteisten rakkuloiden kautta ja lajiutuvat varhaisiin endosomeihin. Mielenkiintoista on, että FC5: n havaittiin myös stimuloivan solunulkoisten mikrovesiikkelien (eksosomien) irtoamista BEC: stä (Haqqani, Caram-Salas, et al., 2013; Haqqani, Delaney, et al., 2013), jossa sekä FC5 että sen putatiivisen reseptorin cdc50a: n kohonneet tasot havaittiin Western blotilla ja kohdennetulla massaspektrometrialla. Tämä tutkimus osoitti, että shed eksosomit voi olla viimeinen rakkula RMT reitin vapautuu abluminal pinta kuljettaa reseptori-vasta-aine monimutkainen (kaavamaisesti esitetty Fig. 4). RMT-reitillä ja eksosomin muodostumisella on joitakin merkittäviä yhtäläisyyksiä. Kuten ensimmäisessä eksosomien löydössä hahmoteltiin, anti-TfR-vasta-ainetta jäljitettiin elektronimikroskopialla retikulosyyteissä (Théry, 2011) solujen pinnalta, klatriinipäällysteisiin kuoppiin, varhaisten endosomien sisälle, multivesikulaaristen endosomien sisäisten rakkuloiden pinnalle ja lopuksi vapautuneisiin eksosomeihin sen jälkeen, kun multivesikulaariset endosomit fuusioitiin plasmakalvoon (Kuva. 4). RMT näyttää kehittyvän samalla tavalla ja Bec-solunulkoisten mikrovesikkeleiden on osoitettu sisältävän useita reseptoreita, joiden tiedetään kuljettavan makromolekyylejä BBB: n läpi RMT: n kautta, mukaan lukien TfR, LRPs, LDLR ja IR (Haqqani, Delaney, et al., 2013).
kuvattujen tutkimusten perusteella pitäisi olla selvää, että keskushermostoon kohdistuvan BSAB: n BBB-kantohaara vaatii huolellista optimointia jokaiselle RMT-reseptorille. Seuraavassa käsitellään tärkeitä näkökohtia keskushermostoon kohdistuvien BSAB: iden suunnittelussa ottaen huomioon TFR-BACE1 bsab: n kehitystyöstä ja omasta työstämme FC5: n kanssa BBB-kantajan vasta-aineena.