9 proteiinien rooli Spliseosomaalisessa Katalyyttiytimessä
verrattaessa snRNAs: n kokoa paljon suurempiin II-ryhmän introneihin herättää mahdollisuuden, että useita II-ryhmän intronidomeeneja on saattanut evoluution aikana korvautua proteiineilla spliseosomeissa, mikä on synnyttänyt nykyaikaisen ribonukleoproteiinin (RNP) eukaryoottiset silmukointikoneet. Vaikka yhden ja yhden välistä vastaavuutta ei vielä ole, on helppo tunnistaa reliseosomaaliset proteiinit, jotka suorittavat ryhmän II intronien RNA-alkuaineiden välittämää tehtävää. Esimerkiksi joukko U2: een liittyviä proteiineja toimii U2: n snRNA–haarakohdan vuorovaikutuksen käynnistämisessä ja stabiloinnissa (Kuva. 6.3).5,85 ryhmän II introneissa U2-ekvivalentti (osa domain VI: ta) on kovalenttisesti yhteydessä haarapaikkaan hyperstabiilin hiusneulasilmukan kautta järjestelyssä, joka varmistaa niiden vuorovaikutuksen muodostumisen ja vakauden (Fig. 6.2). Tästä evolutionaarisesta näkökulmasta ei ole yllättävää, että suuri osa spliseosomaalisista proteiineista liittyy suoraan snRNA: han ja avustaa sitä usein sen toiminnassa.5,85 monet spliseosomaaliset proteiinit osallistuvat kuitenkin säätelytoimintoihin, joita ei tarvita itsesulautuvan intronin yhteydessä, ja ne ovat todennäköisesti myöhempiä lisäyksiä spliseosomaaliseen proteiinikomplementtiin.
kuten edellä mainittiin, arvellaan eukaryoottien viimeisellä yhteisellä esi-isällä olleen Pitkälle kehittynyt, täysin toimiva splikeosomi, joka muistutti nykyisissä eukaryooteissa esiintyviä.1.2 vaikka tämä silmukkaelementti sisälsi todennäköisesti huomattavasti vähemmän komponentteja verrattuna pienimpiinkin nykyisiin silmukkaelementteihin, tiedot osoittavat, että suurin osa keskeisistä komponenteista oli mukana varhaisimmissa osakomponenteissa.1-4 itse asiassa osajoukossa, joka sisältää katalyyttiseen ytimeen liittyvät proteiinit, esiintyy merkittävää säilyvyyttä eri eukaryoottisten lajien keskuudessa, ja useat spliseosomaaliset proteiinit ovat kaikkein säilyneimpiä soluproteiineja.85,86
kuten edellä mainittiin, monet hyvin tunnetut ribotsyymit liittyvät proteiineihin in vivo, jotka parantavat niiden katalyyttistä aktiivisuutta useilla tunnetuilla mekanismeilla.83 näitä ovat RNAS: n funktionaalisen rakenteen vakauttaminen, substraattien sitominen ja paikannus sekä toiminnallisesti tärkeiden metalli-ionien Sitominen. Suoraa osallistumista katalyysiin ei kuitenkaan ole toistaiseksi havaittu yhdelläkään tutkituista ribotsyymiin liittyvistä proteiineista.83,87 jos oletetaan, että spliseosomi on RNA-entsyymi, spliseosomaaliset snrnat ovat monessa suhteessa epätavallisia ribotsyymejä. Ehkä tärkeintä on, että ne ovat harvinaisen pieniä ribotsyymille, joka katalysoi fosfodiesterisidoksen pilkkoutumista ei-adjacent-nukleofiilin aktivoinnin kautta. Muut tällaisia reaktioita katalysoivat luonnolliset ribotsyymit eli ryhmän I ja II intronit ja RNaasi P ovat vähintään kaksi kertaa pidempiä kuin ihmisen U6 ja U2 snrnojen yhteenlaskettu pituus. Nämä ribotsyymit ovat myös paljon suurempia kuin nukleolyyttiset ribotsyymit, jotka aktivoivat viereisen 2′-hydroksyylinukleofiilin fosfodiesterisidoksen pilkkoutumiseen.24,88,89 suuremman koon uskotaan mahdollistavan näiden ribotsyymien taittumisen monimutkaisiksi rakenteiksi, joita stabiloivat useat tertiääriset vuorovaikutukset, mikä puolestaan mahdollistaa niiden kehittyneiden aktiivisten kohtien luomisen, jotka kykenevät tarkasti sijoittamaan katkaisukohdan, aktiivisen kohdan metalli-ionit ja etäisen nukleofiilin in-line-nukleofiiliseen hyökkäykseen. On mahdollista, että U6 ja U2 snrnat lyhyen pituutensa vuoksi muodostavat parhaimmillaankin tehottoman saumaavan ribotsyymin, joka vaatii muita spliseosomaalisia tekijöitä aktiivisen kohdan alkuaineiden ja reagoivien ryhmien stabiiliin sijoittamiseen.
Prp8: lla, joka on säilynein spliseosomaalinen proteiini, arvellaan olevan tällainen rooli spliseosomaalisessa aktiivisessa kohdassa. Prp8 on luultavasti kiinnostavin spliseosomaalisista proteiineista, koska se on epätavallisen säilynyt 61% identiteetillä hiivan ja ihmisen välillä.86 sillä on kuitenkin vain vähän selvästi erottuvia funktionaalisia motiiveja sen ~ 2300 aminohapon pituudessa, ja funktionaaliset verkkotunnukset, jotka on tähän mennessä havaittu, ovat degeneroituneita ja todennäköisesti suorittavat toimintoja, jotka eivät liity alkuperäisen perustusmotiivin solurooliin.86 toisaalta prp8: lla on selvästi erittäin kriittinen rooli spliseosomaalisessa aktiivisessa kohdassa. Se on ristikytketty 5′ ja 3 ’ – liitoskohtiin ja premessenger RNAs: n haarapaikkaan U5: n ja U6: n snRNAs: n lisäksi, mikä osoittaa, että se on läsnä spliseosomaalisessa katalyyttisessä ytimessä ja on suoraan yhteydessä kriittisiin pelaajiin liitosreaktiossa.86,90 lisäksi on osoitettu, että Prp8 vuorovaikuttaa useiden keskeisten spliseosomaalisten proteiinien, kuten Snu114: n ja Brr2: n kanssa (ks.jäljempänä).86,91,92
Prp8: n mutaatioihin liittyy laaja kirjo spliseosomien vikoja, mukaan lukien muutokset spliseosomien kyvyssä hylätä suboptimaalisia liitoskohtia ja mutaatioiden aiheuttamat viat tukahdutetaan muissa spliseosomisissa tekijöissä, kuten Prp28: ssa, Brr2: ssa, U4: ssä ja U6: ssa.86,93,94 Prp8-mutanttien osajoukko moduloi selektiivisesti joko ensimmäisen tai toisen liitosvaiheen tehokkuutta erityisesti suboptimaalisilla substraateilla.58,86,95 – 97 nämä havainnot selittyvät parhaiten hypoteesilla, jonka mukaan Prp8 osallistuu sellaisten vaihtoehtoisten, toisensa poissulkevien aktiivisten kohtien konformaatioiden vakautumiseen, jotka ovat joko valmiita liitoksen ensimmäisen tai toisen vaiheen katalyysiin, ja että tietyt Prp8-mutantit saattavat johtaa jonkin näistä tiloista valikoivaan hyperstabiloitumiseen.58,96,98 vaikka merkittävä näyttö viittaa siihen, että Prp8 todennäköisesti osallistuu substraattien sijoittamiseen ja aktiivisen kohdan stabilointiin, tällä hetkellä ei ole olemassa suoria todisteita, jotka osoittaisivat tai kiistäisivät sen ylimääräisen osallistumisen metalli-ionien koordinointiin tai suoran osallistumisen spliseosomaaliseen katalyysiin.
tämä epävarmuus johtuu siitä, että prp8: n tavasta hoitaa tehtävänsä tiedetään hyvin vähän. Innovatiivinen transposonivälitteinen seulontamenetelmä osoitti, että suuret alueet Prp8: sta ovat erittäin herkkiä transposonien lisäämiselle ja toimivat todennäköisesti yhtenä rakenteellisena yksikkönä, vaikka transposonit voitiin lisätä tai jopa jakaa kahteen osaan useissa muissa kohdissa elinkelpoisuuden menettämättä.90,92 lukuun ottamatta degeneroitunutta ydinlokalisaatiosignaalia lähellä sen n-päätepistettä ja degeneroitunutta RRM (RNA recognition motif) – motiivia proteiinin keskellä, vain kaksi muuta funktionaalista domeenia on tunnistettu tässä ~ 2300 aminohapon pituisessa proteiinissa.86
prp8: n C-terminaalin läheltä löytyy MPN/Jab1-domeenin degeneroitunut muunnos, joka liittyy deubikvitinoiviin entsyymeihin.86 tämän domeenin sisältävän prp8: n fragmentin korkean resoluution rakenteen analyysi on osoittanut, että isopeptidaasikeskuksen metalli-ionisitoutumiskohta on heikentynyt, joten se ei todennäköisesti toimi deubikvitinoivana entsyyminä.Tämän domeenin sisältävä prp8-fragmentti saattoi sitoutua ubikitiiniin suoraan in vitro affiniteetilla, joka oli verrattavissa muihin tunnettuihin ubikitiinia sitoviin proteiineihin.101 useat tunnetut prp8-mutaatiot, jotka häiritsivät silmukointia, häiritsivät myös ubikitiinin sitoutumista in vitro, jolloin ubikitinaation funktionaalisen roolin mahdollisuus lisääntyi silmukoinnin säätelyssä. Tärkeää on, että proteomiset analyysit ovat osoittaneet, että useat spliseosomaaliset tekijät, mukaan lukien Sad1, Snu114, Rse1 ja Prp8 itse, ovat ubikitinoituneita in vivo, ja lisäksi spliseosomaalinen ydinproteiini Prp19 osoittaa E3 ubikitiiniligaasiaktiivisuutta in vitro.101-105 ubikitiinilla on myös rooli tri-snRNP: n muodostumisessa ja ylläpidossa, mahdollisesti moduloimalla Prp8-välitteistä brr2.102: n funktion säätelyä vaihtoehtoisesti on myös mahdollista, että MPN/Jab1–domeeni toimii proteiini-proteiini-vuorovaikutusalustana. Useat prp8: n mutaatiot,jotka kuuluvat tähän alaan, johtavat perinnölliseen sokeuteen retinitis pigmentosa, 86 ja nämä mutaatiot heikensivät prp8: n vuorovaikutusta Brr2: n ja Snu114: n kanssa.99
toisen prp8: n kappaleen korkean resoluution rakenne on määritetty siten, että se käsittää hyvin säilyneen alueen (69% aminohappoidentiteetti hiivan ja ihmisen välillä), joka sijaitsee lähellä sen C-terminaalista domeenia. Rakenteen analyysi paljasti β-hiusneulan sormen muistuttavan ribosomaalisten proteiinien ja degeneroituneen RNaasi H: n kaltaisen domeenin.106-108 vaikka RNaasi H: n kaltaisen Motifin yleinen geometria sekundäärisen ja tertiäärisen rakenteen tasolla säilyi hyvin, primaarijakso osoitti paljon vähäisempää säilymistä ja vain yksi kolmesta katalyyttijäännöksestä on läsnä aktiivisessa kohdassa. Säilyvä jäännös, aspartaatti, osallistuu kahden katalyyttisen metalli-ionin koordinointiin kanonisten RNaasi H-domeenien aktiivisessa kohdassa. Eräässä tutkimuksessa tämän jäämän mutaatio hiivassa prp8: ssa ei johtanut havaittavaan kasvuvirheeseen, mikä voisi viitata redundanssiin tai kriittisen toiminnon puuttumiseen.108 toisessa tutkimuksessa sen vaikutusta ei voitu tutkia, koska mutaatio aiheutti proteiinifragmentin sekoittumisen.107 RNaasi-h-domeenin aktiivista kohtaa vastaavalla alueella ei havaittu metalli-ionisidontaa, kun kiteitä kasvatettiin jopa 200 mM MgCl2: ssa, mikä viittaa siihen, että degeneroituneessa aktiivisessa kohdassa ei ole metalli-ionisidontakykyä. Tämän domeenin sisältävän prp8: n fragmentin RNA: n sitoutumiskyky oli hyvin heikko, Kd 20-200 µM riippuen testatuista RNA-lajeista.106-108 vaikka fragmentti osoitti hyvin alhaisen affiniteetin sitovaan RNAs: iin, se osoitti mieltymystä sitovaan duplex RNAs: iin, joka sisältää nelitie-liittymiä.108 aktivoiduissa ihmisen spliseosomeissa U2: n ja U6: n snrnojen ennustetaan muodostavan tällaisen rakenteen.53,69 tästä RNaasi H: n kaltaisesta domeenista teki erityisen mielenkiintoisen se, että sen aktiivista kohtaa Vastaavat aminohapot sijaitsevat prp8: n jäämien vieressä, joiden on aiemmin osoitettu risteytyvän prekatalyyttisissä spliseosomeissa 5′: n liitoskohtaan.109 tämän ristikytkennän muodostumisen tehokkuus kuitenkin heikkeni prekatalyyttisten spliseosomien edetessä katalyyttisesti aktiivisiksi spliseosomikomplekseiksi.Havaitun ristisidontatehon heikkenemisen voidaan tulkita osoittavan, että tämä yhteisvaikutus häiriintyy aktivoiduissa splikeosomeissa. Vaihtoehtoisesti vuorovaikutus voi säilyä, mutta itse ristiinlinkin muodostuminen lakkaa, koska ristiinlinkittyjen jäämien ympäristössä tapahtuu pieni muutos. Jos tämä degeneroitunut RNaasi H-kaltainen domeeni on todellakin sijoitettu 5′: n liitoskohdan läheisyyteen katalyyttisesti aktiivisissa liitoskohdissa, on mahdollista, että se voi osallistua snrnas: n aktiivisen konformaation stabilointiin, substraattien sijoittamiseen aktiivisessa kohdassa ja/tai katalyyttisten metalli-ionien koordinointiin. Vaikka domeeni ei itsessään pysty sitomaan RNA: ta tai metalli-ioneja, on mahdollista, että muiden aktiivisten kohtioalkuaineiden läsnä ollessa se voi muodostaa osan substraatista tai metalli-ioneja sitovista taskuista. Näistä kiehtovista mahdollisuuksista huolimatta prp8: n rooli spliseosomaalisessa katalyysissä on edelleen epävarma.