biotiinia ja sen sidoskumppania avidiinia käytetään nykyään yleisesti molekyylibiologiassa useiden eri tekniikoiden ja protokollien osalta. Tässä postauksessa käsitellään biotiinin luonnollista roolia, biotinylaatiota, biotiini-avidiini-vuorovaikutuksen löytämistä ja biotinylaation käyttöä molekyylibiologiassa!
tietoa bakteerien fuusioproteiinien in vivo biotinylaatiosta
biotiini on välttämätön elämälle
vaikka biotiini tunnetaan yleisimmin roolistaan molekyylibiologiassa, biotiini (H-vitamiini tai B7-vitamiini) on ensin välttämätön koentsyymi, jota kaikki eliöt tarvitsevat elääkseen. Biotiinia syntetisoivat vain kasvit, useimmat bakteerit ja jotkut sienet, joten nisäkkäiden on saatava vitamiini ulkoisista lähteistä. Ihmiset imevät suurimman osan tarvitsemastaan biotiinista ohutsuolessa siellä asuvasta mikrobistosta.
biotiini on kofaktori, joka aktiivisessa muodossaan kiinnittyy kovalenttisesti keskeisten metaboliaentsyymien kuten biotiinikarboksylaasin ja dekarboksylaasien aktiiviseen kohtaan. Nämä entsyymit katalysoivat karboksyyliryhmien siirtymistä orgaanisiin happoihin tärkeiden solumetaboliittien tuottamiseksi. Biotiini toimii karboksyylinkantajana yhdisteestä toiseen. Nämä biotiiniriippuvaiset entsyymit ovat välttämättömiä prosesseissa, kuten glukoneogeneesissä, lipogeneesissä, aminohappoaineenvaihdunnassa ja energian transduktiossa.
Biotinylaatio on yleinen prosessi, jolla biotiinia lisätään proteiiniin tai makromolekyyliin. Biotiinia voidaan lisätä entsymaattisesti tai kemiallisesti. Entsymaattinen biotinylaatio tapahtuu luonnollisesti soluissa ja on prosessi, jossa biotiini sitoutuu kovalenttisesti tiettyyn lysiiniin juuri syntetisoidun entsyymin aktiivisessa kohdassa. Biotiiniproteiiniligaasi (BPL) on vastuussa tästä erittäin spesifisestä translaation jälkeisestä proteiinin modifikaatiosta. Useimmilla eliöillä on koko proteomissa alle viisi entsyymiä, jotka ovat biotinyloituja. Esimerkiksi E. coli-bakteerissa BPL, BirA, on vastuussa vain yhden lysiinin biotinyloimisesta koko eliössä biotiinikarboksyylikantajaproteiinille (bccp).
biotiini-avidiini-yhteisvaikutuksen löytyminen
1930-luvun lopulla havaittiin, että pääasiassa munanvalkuaisista ravinnokseen syöneille eläimille kehittyisi ihovaurioita ja muita hirvittäviä terveysongelmia. Tämä sairaus oli nimeltään ”munanvalkuainen vahinko” ja määritettiin johtuvan puutos H-vitamiinin myöhemmin nimetty Vitamiini B7/biotiini. Munanvalkuaisvaurio vaivaisi näitä eläimiä, vaikka niiden ruokavaliota täydennettäisiin biotiinilla. Näin jokin munanvalkuaisessa esti biotiinia imeytymästä. Vuonna 1940 Esmond E. Snell onnistui puhdistamaan biotiinin sitomisesta vastaavan proteiinin, avidiinin. Avidin sai osuvasti nimensä kanasta,” Avian ” – munasta, josta se puhdistettiin. Snell vahvisti myöhemmin, että avidin oli todellakin syyllinen munanvalkuaisvaurioon ruokkimalla rottia puhdistettua avidinia (Kresege et al., 2004). Avidiini on glykoproteiini, joka koostuu neljästä identtisestä alayksiköstä, jotka voivat kukin sitoa yhden biotiinimolekyylin.
biotiinilla ja avidiinilla on erittäin voimakas affiniteetti toisiinsa. Itse asiassa niiden välinen sidos on yksi voimakkaimmista luonnossa esiintyvistä ei-kovalenttisista proteiini-ligandien välisistä vuorovaikutuksista. Kun sidos on muodostettu, siihen eivät vaikuta pH: n, lämpötilan tai orgaanisten liuottimien muutokset.
biotiinin käyttö molekyylibiologiassa
biotiini on suhteellisen pieni, vesiliukoinen molekyyli, joka ei häiritse niitä makromolekyylejä, joihin se on lisätty. Biotiinilla on myös altistunut sivuketju, jota voidaan helposti manipuloida tekemään reaktiivisia lajeja vaikuttamatta avidiinin sitoutumiskohtaan. Kaikkien näiden ominaisuuksien ansiosta ei ole yllättävää, että tutkijat alkoivat hyödyntää biotiinia ja sen voimakasta vuorovaikutusta avidiinin kanssa molekyylibiologian ja bioteknologian tarkoituksiin.
kun polypeptidi on biotinyloitu (lisää tästä alla), se voidaan inkuboida tai ilmaista yhdessä avidiinin tai rakenteellisesti samanlaisen proteiinin kanssa, joka löydettiin 1960-luvulla, strepavidiinin kanssa. Biotiini-avidin-kompleksia voidaan sitten käyttää ja / tai manipuloida tiedemiehen aiottuun tarkoitukseen. Kaksi yleisintä käyttöä biotinylaation laboratoriossa ovat proteiinin puhdistus ja immunoprecipitation kokeet. Biotinyloidut proteiinit tai kompleksit voidaan helposti puhdistaa avidiinilla päällystettyjen kolonnien tai helmien avulla.
biotiini-avidiini-yhteisvaikutusta on myös mukautettu käytettäväksi immunohistokemiassa ja vasta-ainemerkinnöissä. Näissä kokeissa biotiini lisätään primaariseen tai sekundaariseen vasta-aineeseen, joka kohdistuu kiinnostavaan proteiiniin tai primaariseen vasta-aineeseen. Toimittajaan sidottu Avidin lisätään sitten reaktioon, jotta se olisi helppo havaita. Avidiinissa olevat useat biotiinisitoutumispaikat ovat myös ihanteellisia signaalin vahvistamiseen näiden kokeiden aikana. Havaitsemisen aikana näytteeseen voidaan lisätä biotinyloitua reporter-entsyymiä, joka on esiinkuboitu vapaalla avidiinilla. Kaikki tämän kompleksin vapaat biotiinisitoutumiskohdat voivat sitoutua biotinyloituun vasta-aineeseesi. Tämä luo suuren metalliseoksen biotiini-avidin-komplekseja sitoutuneena kiinnostavaan proteiiniisi, mikä johtaa toimittajan signaalin vahvistumiseen ja helpompaan havaitsemiseen. Tätä strategiaa kutsutaan Avidin-Biotiinikompleksiksi (ABC) immunohistokemiaksi (IHC). Lisätietoja ABC: stä ja IHC: stä löytyy Thermo Fisher Scientificin oppaasta.
biotiinille ja avidiinille on olemassa joukko muita molekyylibiologian sovelluksia. Alla on lyhyt luettelo joistakin muista yleisistä sovelluksista ja linkit asiaankuuluviin asiakirjoihin ja verkkosivuihin.
- EMSA (Electrophoretic Mobility Shift Assays)
- ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay)
- Southern/Northern Blotting
- Cell surface labelling
- Attaching polypeptides to a substrate
- Flow cytometry/fluorescence-activated cell sorting (FACS)
- In situ hybridization
Methods for biotinylating your macromolecule of interest
To utilize the natural binding of biotiini ja avidiini, kiinnostavat makromolekyylit on ensin biotinyloitava. Tutkijat ovat kehittäneet useita menetelmiä makromolekyylien kemialliseen biotinylointiin sekä in vitro että In vivo.
Biotinylointireagenssit:
biotiinin altistunut sivuketju voidaan ristisidostaa aminohappofunktionaalisiin ryhmiin in vivo erikoistuneiden kemikaalien (biotinylointireagenssien) avulla. On olemassa erilaisia biotinylointireagensseja, jotka eroavat toisistaan niiden kohteena olevien funktionaalisten ryhmien tai jäämien sekä niiden liukoisuuden suhteen, ja siten erilaiset reagenssit ovat hyödyllisiä biotinylaatiossa eri mikroympäristöissä. On myös palautuvia ja tarttuvia biotinylointireagensseja, jotka auttavat biotinyloitujen proteiinien spesifisessä eluoinnissa. Apua määritettäessä, mitä biotinylointireagenssia käytetään, tutustu Thermo Fisher Scientificin Biotinylointireagenssien Valintatyökaluun.
AviTag ja BirA:
proteiineja voidaan biotinyloida myös hyödyntämällä E: n spesifisyyttä.coli BPL, BirA. Jos muistat, BirA biotinyloi vain yhden lysiinin koko E. coli-proteomiin. Tämän tiedon avulla tutkijat tunnistivat BirA-tunnistukseen ja biotinylaatioon tarvittavan 13 aminohapon sekvenssin. Tätä 13 aminohapon sekvenssiä kutsutaan Avitagiksi. Avitagin avulla voidaan merkitä kiinnostava proteiini biotiiniin yksinkertaisesti luomalla fuusio, jossa AviTag lisätään joko proteiinin N-tai C-terminukseen. Biran on osoitettu tehokkaasti biotinyloivan avitag-proteiineja bakteeri -, hiiva -, hyönteis-ja nisäkässoluissa. Katso Kay et al., 2009 for methods on biotinylating proteins with BirA.
Addgenesta löytyy plasmideja, jotka sisältävät sekä Avitagia että Biraa!
Oligonukleotidimerkintä:
biotiinia voidaan lisätä DNA-sekvenssin kumpaankin päätepisteeseen polymeraasiketjureaktion (PCR) aikana biotinyloidun primerin avulla. Biotiini voidaan myös sisällyttää entsymaattisesti PCR: n aikana käyttämällä dutp-merkittyä biotiinia. Oligonukleotidiin voidaan lisätä monentyyppisiä biotiinimerkintöjä riippuen siitä, miten sitä käytetään loppupäässä. Biotiinimerkittyjä oligonukleotideja voidaan käyttää lukuisissa sovelluksissa, muun muassa in situ-hybridisaatiossa, blottauksessa (pohjoinen ja eteläinen) ja affiniteettisidonnassa.
Fotobiotinylaatio:
Fotobiotiinia voidaan käyttää DNA: n ja RNA: n ei-selektiiviseen merkitsemiseen. Fotobiotiiniasetaatti koostuu fotoreaktiiviseen aryyliatsidiryhmään kiinnittyneestä biotiinimolekyylistä. Voimakkaassa näkyvässä valossa aryyliatsidiryhmä muuttuu reaktiiviseksi ja muodostaa yhteyden läheisiin nukleiinihappoihin (McInnes et al., 1990). Fotobiotinylaatio on joskus helpompaa ja halvempaa kuin muut entsymaattiset menetelmät. Tutkijat ovat yleisesti käyttäneet tätä menetelmää proteiinien tai polypeptidien liittämiseksi kiinteään substraattiin (Holden and Cremer, 2003).
1. Chapman-Smith, A., & Cronan, J. E. ”Molecular Biology of Biotin Attachment to Proteins; Symposium: Nutrition, Biochemistry and Molecular Biology of Biotin” J. Nutr, 129 (2009a): 477-484. PubMed PMID: 10064313.
2. Chapman-Smith, A., & Cronan, J. E. ” The enzymatic biotinylation of proteins: a post-translational modification of exceptional specificity.”Trends in Biochemical Sciences, 24.9 (1999b): 359–363. PubMed PMID: 10470036.
3. Said, H. M. ” biotiini: unohdettu vitamiini.”American Journal of Clinical Nutrition 75.2 (2002): 179-180. PubMed PMID: 11815306.
4. Nicole Kresge, R. D. S. ja R. L. H. ” the Discovery of Avidin by Esmond E. Snell.”J Biol Chem 279.e5 (2004). PubMed PMID: 20353954.
5. Kay, B., Thai, S., & Volgina, V. ” suuritehoinen proteiinien Biotinylaatio.”Methods Mol Biol, 498 (2009): 185-196. PubMed PMID: 18988027. PubMed Central Pmcid: PMC3223083.
6. McInnes, J. L., Forster, A. C., Skingle, D. C., & Symons, R. H. ” fotobiotiinin valmistus ja käyttö.”Methods in Enzymology 184 (1990): 588-600. PubMed PMID: 2388593
7. Holden, M. A., & Cremer, P. S. ” värileimattujen molekyylien Valoaktivoitu kuviointi pinnoilla.”Journal of the American Chemical Society 125.27 (2003): 8074-8075. PubMed PMID: 12837056.
8. Pan, J. feng, Liu, N. Hua, Shu, L. yuan, & Sun, H. ””Journal of Nanobiotechnology 13.1 (2015): 1–14. PubMed PMID: 25980573. PubMed Central Pmcid: PMC4461904.
9. Huang, Q., Mao, Z., Li, S., Hu, J., & Zhu, Y. ”a non-radioactive method for small RNA detection by northern blotting. Rice 7.1 (2014): 1-7. PubMed PMID: 26224555. PubMed Central Pmcid: PMC4884002.
10. Boer, E. de, Rodriguez, P., Bonte, E., Krijgsveld, J., Katsantoni, E., Heck, A., … Strouboulis, J. ”Efficient biotinylation and single-step purification of tagged transkription factors in mammalian cells and transgenic mice.”PNAS 100.13 (2003):7480-5. PubMed PMID:12802011. PubMed Central Pmcid: PMC164612.
11. Liou, Y.-R., Wang, Y.-H., Lee, C.-Y., & Li, P.-C.”PLoS ONE 10,5 (2015). PubMed PMID: 25993512. PubMed Central Pmcid: PMC4439073.
12. Ludwig, L. B., Hughes, B. J., & Schwartz, S. A.”Nucleic Acids Research, 23.18 (1995): 3792-3793. PubMed PMID: 7479014. PubMed Central Pmcid: PMC307283.
13. Howarth, M., & Ting, A. Y. ” Imaging proteins in live mammalian cells with biotin ligase and monovalent streptavidine.”Nature Protocols 3.3 (2008): 534-545. PubMed PMID: 18323822. PubMed Central Pmcid: PMC2671200.
14. Bloch, B. ” Biotinylated probes for in situ hybridization histochemistry: use for mRNA detection.”Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society, 41.12 (1993): 1751-1754.PubMed PMID: 8245422.
lisäaineistoa Addgene-blogissa
- in vivo biotinylaatio bakteerien fuusioproteiineissa
- Opi, miten biotiinia käytetään Split-Bioidissa: parannettu menetelmä proteiinien ja proteiinien vuorovaikutusten tutkimiseen
- Opi, miten biotiinia voidaan käyttää CRISPR: n kanssa