POU5F1: n ja SOX2: n tehostajien interaktomit ihmisalkion kantasoluissa | Scientific Reports

Pou5f1: n ja SOX2: n tehostajien interaktomien tunnistaminen
pou5f1: n ja SOX2: n tehostajien interaktomit ovat päällekkäisiä varhaisten DNA: n replikaatioalueiden kanssa, mutta ei heterokromaattisten alueiden kanssa
tehostajien interaktomit ovat transkription aloituskohtien vieressä ja niillä on aktiivisia epigeneettisiä ominaisuuksia
Transkriptiotilanne POU5F1: n ja SOX2: n tehostajageenien välillä
Pou5f1–tehostajaan liittyvät distaaliset geenit osallistuvat pluripotenssin säätelypiiriin
useat transkriptiotekijän sitoutumispaikat rikastuvat POU5F1: ssä ja SOX2: n tehostajan interaktomit
RAD21 on mahdollisesti kompleksissa muiden transkriptiotekijöiden kanssa tehostavien interaktomien välittämiseksi

Pou5f1: n ja SOX2: n tehostajien interaktomien tunnistaminen

pou5f1: n ja SOX2: n tehostajien interaktomien tunnistaminen

pou5f1: n ja SOX2: n tehostajien interaktomit säilyvät evolutiivisesti selkärankaisilla (44 lajia), joiden aktiiviset tehostaja-signaalit määritellään epigeneettisillä merkeillä, kuten P300 histonilla asetyylitransferaasi ja H3K27AC, mutta ei H3k27me3, Hess7 ( täydentävä Kuva. 1 A ). Sovellimme 4C-tekniikkaa tunnistamaan pou5f1: n ja SOX2: n ”syötti” – oletuksen parantajien vuorovaikutuskumppanit pluripotentissa H9-solulinjassa. Lyhyesti, solut oli kiinnitetty ristiin kromosomit lähellä. Kromosomit sirpaloituivat sitten sonikaatiolla. Vuorovaikuttavat kromatiinifragmentit ligoituivat ja DNA-kappaleet puhdistettiin. ”Syötin” kanssa vuorovaikutuksessa olevat genomialueet monistettiin sitten sisäkkäisellä PCR: llä (Supplementary Fig. 1b, täydentävä Taulukko 1). Suunnittelimme käänteiset PCR-alukkeet pou5f1-ja SOX2-geenien oletuksellisiin tehostajiin. Rakennettu 4C-kirjasto voitiin visualisoida DNA-elektroforeesilla, kun taas kontrollissa ilman ligaatiota ei ollut juuri lainkaan PCR-tuotteita (täydentävä Kuva. 1B), mikä osoittaa, että 4C-kirjasto oli monistettu ligaatiotuotteista.

suoritimme seuraavan sukupolven DNA-sekvensoinnin käyttäen Illumina HiSeq-sekvensseriä ja luokittelimme tunnistetut 4C-interaktiot joko proksimaalisiksi tai distaalisiksi interaktioiksi (KS. Distaalisia interaktioita ovat kromosomien väliset interaktiot ja kromosomien sisäiset interaktiot yli 20 kb: n genomietäisyyksillä, kun taas proksimaaliset interaktiot kattavat kromosomien sisäiset alueet, joiden genomietäisyydet ovat 300 bp: n ja 20 kb: n välillä. Yhdenmukaisesti 3C–pohjaisten tutkimusten tulosten kanssa distaalinen vuorovaikutus lukee vain pienen osan kokonaisvuorovaikutuksista, noin 10% ~ 20% 4C-kirjastoille (täydentävä Taulukko 2 ). Käytimme kahta eri erää H9-soluja 4C-kirjastojen rakentamiseen POU5F1: lle ja SOX2: lle itsenäisesti seuraavan sukupolven sekvensointia varten. POU5F1: n ja SOX2: n distaalisten vuorovaikutusten kaksi toisintoa limittyvät 35%: lla ja 25%: lla. Tämä on yhdenmukaista sen kanssa, että CTCF–välitteisten kromatiin interaktomien biologisissa toisinnoissa havaittiin Kohtalaista päällekkäisyyttä hiiren ES-soluissa27, ja se saattaa heijastaa tehostavien vuorovaikutusten monimuotoisuutta ja dynamiikkaa, ligaatiotehokkuutta, PCR-monistuksen monimutkaisuutta sekä sekvensoinnin syvyyttä. Suodattaa pois vuorovaikutukset, jotka todennäköisesti johtuvat stokastisia vaikutuksia, käytimme false discovery rate (FDR)-pohjainen tilastollinen malli tunnistaa rikastettu vuorovaikutuksessa verkkotunnuksia koko genomin. Yhdistimme edelleen rikastetut vuorovaikutteiset verkkotunnukset, jotka ovat päällekkäisiä biologisten kopioiden välillä korkean luottamuksen toistuvina vuorovaikutteisina verkkotunnuksina. POU5F1-ja SOX2-interaktomeille tunnistettiin yhteensä 23 ja SOX2-interaktomeille 9 korkean luottamuksen toistuvaa vuorovaikutusaluetta ( Kuva 1, täydentävä Taulukko 3 ja 4), ja useimmat niistä ovat kromosomien välisiä vuorovaikutuksia, joihin liittyy geenirikkaita alueita, samoin kuin E4C-tulokset20.

pou5f1: n ja SOX2: n tehostajien interaktomit ovat päällekkäisiä varhaisten DNA: n replikaatioalueiden kanssa, mutta ei heterokromaattisten alueiden kanssa

seuraavaksi tutkimme, onko POU5F1: n ja SOX2: n tehostajien vuorovaikutusalueilla (koko vaihtelee 1 Mb: stä 4 Mb: iin, täydentävä Taulukko 3, 4 ) ainutlaatuisia epigeneettisiä ominaisuuksia. As Ryba et al. 28: n mukaan DNA: n replikaation ajoitus korreloi kromatiinin spatiaalisen läheisyyden kanssa Hi-c-analyysillä mitattuna, mikä viittaa siihen, että DNA: n varhainen ja myöhäinen replikaatio tapahtuvat tuman spatiaalisesti erillisissä lokeroissa. Huomasimme, että POU5F1 ja SOX2 geeni loci ovat varhaisessa DNA replikaatio verkkotunnuksia hESCs ja pohdimme, onko niiden vuorovaikutuksessa verkkotunnuksia on samanlainen DNA replikaatio ajoitus. Kuten kuvassa 2a esitetään , POU5F1 ja SOX2 tehostaja vuorovaikutuksessa verkkotunnuksia pääasiassa päällekkäisiä varhaisen DNA replikaatio verkkotunnuksia HECS. Määritettyjen replikaation ajoitusarvojen jakautuminen tunnistettuja POU5F1 – ja SOX2-tehostaja-vuorovaikutuspaikkoja ympäröivillä genomialueilla (50 kb-alue) osoittaa siirtymistä positiivisiin arvoihin verrattuna genomin laajuisiin array-arvoihin (p < 2.2 × 10-16 molemmille parittamattomalla Wilcoxon rank-sum-testillä; Kuva 2B ). Tämä havainto paljasti mielenkiintoisen epigeneettisen piirteen, että pou5f1-ja SOX2-tehostajia ympäröivissä korkeamman asteen rakenteissa on synkronoitu DNA: n replikaation ajoitus. Koska varhaiset DNA-replikaatiodomeenit on yhdistetty aktiiviseen geenien transkriptioon hess28: ssa, on todennäköistä, että POU5F1-ja SOX2-tehostajien vuorovaikutuksilla tunnistettujen distaalisten alueiden kanssa on toiminnallista merkitystä. Tämä havainto on yhdenmukainen sen kanssa, mitä olemme nähneet pou5f1-tehostajan interaktomissa hiiren es-soluissa (tietoja ei näy). Myös kuvassa 2a, POU5F1 ja SOX2 interacting domeenit eivät ole päällekkäisiä heterokromaattisten alueiden merkitty vahva H3K9me3 signaalit hecs29, mikä viittaa siihen, että interactomes ovat aktiivisen osan genomin kannalta geenisäätelyn. Lisäksi tutkimme mahdollista suhdetta ihmisen kromosomien lamina-yhdisteisiin (LADs) 30, mutta emme havainneet mitään yhteyttä, mahdollisesti siksi, että pojat määritettiin ihmisen fibroblasteista.

tehostajien interaktomit ovat transkription aloituskohtien vieressä ja niillä on aktiivisia epigeneettisiä ominaisuuksia

tutkiaksemme pou5f1-ja SOX2-tehostajien interaktomien korrelaatiota, johon on liitetty huomautus geenien sijainnista, analysoimme tehostajan interaktiokohtien genomietäisyyden jakautumista lähimpään geenin transkription aloituskohtaan (TSS) ( kuva 3 a ). Sekä POU5F1: n että SOX2 enhancer–vuorovaikutteisten sivustojen ytimen tiheysjonot osoittavat selvästi terävän huipun, joka on keskitetty TSS: ään. Verrattuna satunnaisesti simuloitujen kohtien jakautumishuippuun koko genomissa, tehostaja-interaktomeissa havaitut huiput ovat huomattavasti korkeammat kapeassa ikkunassa TSS: n ympärillä (P = 0, 0018, P = 0, 0047, vastaavasti Kolmogorov-Smirnov-testi). TSS: n ympärillä olevien vuorovaikutuspaikkojen rikastuminen viittaa siihen, että POU5F1-ja SOX2-tehostajat suosivat vuorovaikutusta geenejä sisältävien genomialueiden kanssa. Tutkimme edelleen pou5f1: n ja SOX2: n tehostaja–vuorovaikutuskohteiden jakautumista eri genomialueilla 31. Kuvassa 3B esitetyt geenien promoottorijaksot ovat yksi rikastetuista alueista sekä POU5F1-että SOX2-tehostajien interaktomeille. Lisäksi distaalisten intergeenisten alueiden osuus vähenee jatkuvasti näiden kahden interaktomien osalta. Siksi havaintomme viittaa siihen, että aktiivisia tehostajia ympäröivä korkeamman kertaluvun kromosomirakenne saattaa olla suoraan osallisena geenien säätelyssä. On myös huomattava, että kun satunnaiset paikat DNA: n varhaisilla replikaatioalueilla (KS.tarkemmat menetelmät) valitaan vertaamaan etäisyysjakaumaa TSS: ään, POU5F1-ja SOX2-interaktomit ovat vielä rikastuneempia TSS: n ympärillä,vaikka tilastollisesti ne eivät ole merkittäviä (P = 0.390, 1 P = 0.2098, vastaavasti, Kolmogorov-Smirnov-testi, täydentävä Kuva. 2 ).

Histonin modifikaation tiedetään osallistuvan transkription säätelyyn dekondensoimalla kompakteja kromatiinirakenteita transkriptiokertoimen sitomiseksi. 3C-pohjaisissa genomin laajuisissa interaktomitutkimuksissa on tunnistettu tumassa olevia aktiivisia ja inaktiivisia kromatiiniosastoja, joissa on geenien transkriptiota aktivoivia histonimerkkejä, kuten H3K9ac32. Kysyimme siksi, ovatko pou5f1: n ja SOX2: n aktiiviset tehostajat selektiivisessä vuorovaikutuksessa distaalisten alueiden kanssa, joissa esiintyy aktiivista geenien transkriptiota. ChIP-Seq-tunnisteprofiileja h3k27me3, H3K4me1, H3K4me2, H3K27ac, H3K9ac, H4K20me1 ja h3k36me3 H1 ES-solulinjassa 33 käytettiin interaktomeihin liittyvien histonikuvioiden analysointiin. ChIP-Seq-tagit tehostajan vuorovaikutussivustojen ympärillä laskettiin ja normalisoitiin 34 ja visualisoitiin boxplotiksi. Kuten todettiin, POU5F1-ja SOX2-interaktomeilla on korkeammat intensiteettiprofiilit H3K4me1, H3K4me2 ja H4K20me1, jotka ovat merkkejä geenin aktiivisesta säätelystä ( Kuva 4A ). DNA: n varhaisen replikaation alueiden satunnaisiin kohtiin verrattuna tutkitut histonimerkit ovat yleensä rikastuneempia POU5F1-interaktomissa kuin SOX2-interaktomissa, sillä h3k4me1 ja H3K9ac ovat merkittävimmin rikastuneet POU5F1-interaktomissa (p < 2.2 × 10-16 molemmille merkeille, pariton Wilcoxon rank-sum-testi). Mielenkiintoista on, että Polysombivälitteinen geenin hiljentämismerkki H3K36me335 ei rikastu kummassakaan interaktomissa (P = 0,485, P = 0,922, vastaavasti). Tutkimme myös POU5F1: n ja SOX2: n tehostajien interaktomien suhdetta 5-hydroksimetyylisytosiinin (5-hmC) sijainteihin genomissa. Kuten aiemmassa tutkimuksessa kävi ilmi, genomiset 5-hmC-sivustot rikastuvat aktiivisilla tehostajilla hess36: ssa. Koska pou5f1 ja SOX2 ylävirtauksen tehostajat ovat 5-HMC-kohteiden vieressä (5 kb: n sisällä), kysyimme, rikastetaanko tehostajien interaktomeja myös 5-hmC-alueilla. Kuvassa 4B esitetään, että 5-hmC-alueet rikastuvat POU5F1-ja SOX2-interaktomien läheisyydessä verrattuna satunnaisiin paikkoihin DNA: n varhaisen replikaation alueilla (p < 2, 2 × 10-16, P = 0, 047, vastaavasti Kolmogorov-Smirnov-testi). Näin ollen hESCs: n kahdella tehostajan interaktomilla on aktiivisten tehostajien epigeneettisiä ominaisuuksia, jotka voivat helpottaa geenien transkription aktiivista säätelyä.

Transkriptiotilanne POU5F1: n ja SOX2: n tehostajageenien välillä

ymmärtääksemme POU5F1: n ja SOX2: n tehostajiin liittyvien geenien transkriptiotilaa analysoimme RNA-Seq–transkriptiotietoja hESCs: ssä ja sikiön keuhkofibroblasteissa37 keskittyen geeneihin, joilla on TSS: n sisällä 10 KB tehostaja-vuorovaikutuksessa sivustoja. HECS: ssä POU5F1: n ja SOX2: n tehostajageenien ilmentyminen on huomattavasti suurempi kuin kaikkien geenien ilmentyminen HECS: ssä (P = 7,5 × 10-6 ja P = 1.2 × 10-6, vastaavasti parittamattomalla Wilcoxon rank-sum-testillä; Kuva 5A), mikä osoittaa, että interaktomit rikastuvat aktiivisesti transkriboiduilla geeneillä. Näin ollen aktiiviset POU5F1 – ja SOX2-tehostajat voisivat olla mukana välittämässä siihen liittyvien distaalisten geenien transkriptiota. RNA-Seq-transkriptomian analyysi paljasti myös, että geenit, jotka alun perin liittyivät aktiivisiin POU5F1-ja SOX2-tehostajiin HECS: ssä, ovat alaspäin säädeltyjä erilaistuneissa keuhkojen fibroblasteissa (P = 1, 2 × 10-5 ja P = 0, 013, vastaavasti paritetulla Wilcoxon rank-sum-testillä; Kuva 5b ). Nämä tulokset osoittavat, että näiden kahden stemnessiin liittyvän geenin tehostajat vuorovaikuttavat geeniryhmän kanssa, joka ilmenee voimakkaasti heksissä mutta tukahdutetaan fibroblasteissa.

Pou5f1–tehostajaan liittyvät distaaliset geenit osallistuvat pluripotenssin säätelypiiriin

selvittääksemme, edistävätkö POU5F1-ja SOX2-tehostaja-vuorovaikutusgeenit HECS: n itsensä uusiutumista ja pluripotenssia, analysoimme genomin laajuisen RNA-interferenssin näytön dataa käyttäen pou5f1 promoottori reporter-määritystä hecs38: ssa. Transgeenisen POU5F1-GFP-ilmentymän interferenssiä kvantifioidaan Fav-arvoilla, jotka heijastavat GFP-fluoresenssin intensiteettiä, joka kuvaa taipumusta olla stemness-suhteessa ( Kuva 6A ). Verrattuna kaikkiin seulottuihin geeneihin, POU5F1 enhancer-interacting geenit (geenit lähimpänä vuorovaikutuksessa sivustoja, genomien etäisyys TSS vuorovaikutuksessa sivustoja alle 10 kb) osoittavat suuntaus laskevan Fav arvot, vaikka tilastollisesti ei merkitsevä (p = 0.08, unpaired Wilcoxon rank-sum testi). Sox2-kohdisteisilla geeneillä Fav-arvot ovat kuitenkin samanlaiset kuin kaikilla seulotuilla geeneillä (P = 0.98, unpaired Wilcoxon rank-sum test). Näiden tietojen perusteella POU5F1-interaktomin geenit näyttävätkin olevan kantasolujen pluripotenssin kannalta tärkeämpiä kuin sox2-interaktomin geenit.

39 POU5F1–vuorovaikutuksessa olevien geenien ja 20 SOX2–vuorovaikutuksessa olevien geenien Gene ontologiaanalysis39 paljasti, että merkittävä osa niistä osallistuu transkription säätelyyn (30, 8% POU5F1-interaktomeilla ja 35, 0% SOX2-interaktomeilla; Supplementary Table 5, 6) ja jaettu 8 ja 4 eri vuorovaikutuksessa verkkotunnuksia POU5F1 ja SOX2 interactomes, vastaavasti, jossa on enintään 3 geenejä yhdessä vuorovaikutuksessa verkkotunnuksen. Näiden transkriptiosäätelijöiden differentiaaliekspressioanalyysi HECS: ssä ja sikiön keuhkojen fibroblasteissa paljasti 9 pou5f1-interaktomissa (11: llä 12 tunnistetusta transkriptiosäätelijästä on RNA-Seq-data) olevan korkeampi ilmentymä HECS: ssä ( kuva 6B ), mikä viittaa näiden geenien aktiivisiin rooleihin pluripotenssisäätelyverkkoon HECS: ssä. SOX2-interaktomin transkriptiosäätelijöille 3/5 osoitti lisääntynyttä ilmentymistä HECS: ssä. Siksi POU5F1: n tehostajien interaktomilla voi olla suurempi merkitys kantasolujen pluripotenssissa kuin SOX2: n tehostajien interaktomilla.

useat transkriptiotekijän sitoutumispaikat rikastuvat POU5F1: ssä ja SOX2: n tehostajan interaktomit

transkriptiotekijän sitoutuminen on yksi tehostajien ominaisuuksista, ja se saattaa helpottaa tehostajan ja distaalisten geenien välisiä pitkäaikaisia kromatiini–kromatiini–interaktioita. POU5F1 – ja SOX2-putatiiviset tehostajat ovat tunnettuja hot spotteja useiden DNA: ta sitovien proteiinien yhdistymiselle hESCs: ssä. Ymmärtääksemme, rikastuvatko tietyt transkriptiotekijät pou5f1–ja SOX2 enhancer-vuorovaikutusalueilla, analysoimme systemaattisesti 32 DNA: ta sitovan proteiinin ChIP-Seq-profiilit HECS: ssä (KS.menetelmät). Normalisoitu ChIP-Seq tag laskee noin keskellä 4C vuorovaikutuksessa sivustoja laskettiin ja visualisoitiin käyttäen boxplot (Kuva 7A ). Kontrollina laskettiin myös alkuaikojen DNA-replikaatioalueiden satunnaispaikkojen keskipisteiden ympärillä olevat luvut. Tilastollisessa analyysissä tunnistetut atf3 -, CTCF -, GABPA -, JUND -, NANOG -, RAD21-ja YY1-alueet olivat eniten rikastettuja proteiineja kummassakin tehostereseraktomissa verrattuna kontrolliin (p < 0, 01, pariton Wilcox rank-sum-testi). Pluripotenssiin liittyvä transkriptiotekijä OCT4 ei kuitenkaan rikastu POU5F1-tai SOX2-interaktomissa. Siksi atf3, CTCF, GABPA, JUND, NANOG, RAD21 ja YY1 ovat tyypillisiä proteiineja pou5f1-ja SOX2-tehostajien interaktomeissa HECS: ssä, ja niiden esiintyminen voi olla toiminnallisesti tärkeää.

RAD21 on mahdollisesti kompleksissa muiden transkriptiotekijöiden kanssa tehostavien interaktomien välittämiseksi

kuten kuvassa 7A on esitetty , RAD21 on yksi rikastetuista proteiineista, jotka on tunnistettu POU5F1: ssä ja SOX2: n tehostavat interaktomit HECS: ssä. RAD21 on osa koheesiokompleksia, joka tunnetaan DNA-ketjujen ristikytkimenä. Koossiinin on osoitettu välittävän pou5f1-distaalisen tehostajan silmukointia pou5f1-geenin promoottorin kanssa hiiren es cells40: ssä. Aiemman raportin mukaan Rad21 tekee yhteistyötä Ctcf: n ja muiden transkriptiotekijöiden kanssa hiiren es-solujen tunnistamisen ylläpitämisessä40, rad21-alueet sekä POU5F1: n että sox2: n interaktomeissa hESCs: ssä ovat samanaikaisesti transkriptiotekijöiden kanssa. Aggregointikaaviot kuvaavat selvästi ATF3 -, CTCF -, GABPA -, JUND -, NANOG-ja YY1-sidontaprofiilien huippusignaaleja RAD21-kohteiden keskellä POU5F1-ja SOX2-interaktomeissa ( Kuva 7B ). Gabpa: n Knockdown hiiren ES-soluissa tiedetään vähentävän Okt3/4: n ilmentymistä, kun taas Gabpa: n yliekspressio ylläpitää Okt3/4: n ilmentymistä jopa ilman LIF: ää hiiren es-solukulttuurissa41. Genomin laajuisessa siRNA-seulonnassa hecss38: ssa useimpien rikastettujen proteiinien, kuten RAD21: n, CTCF: n, GABPA: n, JUNDIN, NANOG: n ja YY1: n, knockdown vähensi merkittävästi GFP: n toimittajaan liittyvän siirtogeenisen POU5F1-promoottorin ilmentymistä. -1.50421, -1.05828, -1.44161, -1.07731, -1.82749, -2.57204, vastaavasti (sisällä top 25% kaikista geeneistä seulotaan). Kromatiini-kromatiini-vuorovaikutusten ymmärtämiseksi sovellimme DNA: n fluoresoivaa in situ-hybridisaatiota (FISH) visualisoidaksemme kahden genomisen lokuksen rinnakkaislokalisoitumisen yksisolutasolla. Rarg-geenin lokus kromosomissa 12 on tunnistettu HECS: n pou5f1-interaktomissa. RARG: llä on hiljattain osoitettu olevan erittäin tärkeä rooli pluripotenssissa ja se voi tehostaa iPS-solujen induktiota kahdella magnitudilla42. Kontrollina käytettiin toista lokusta kromosomissa 12, joka ei kuulu POU5F1-interaktomiin. Rarg-lokuksen välinen yhteistoimintataajuus (chr12: 51751589-51956291) ja POU5F1-lokuksen (chr6: 31169844-31340561) todettiin olevan 1,67-kertainen verrattuna kontrollipaikan (chr12: 80380971-80564119) ja POU5F1-lokuksen (9,35% vs. 5,61%, p < 0, 05, täydentävä kuva. 3 A ). Suurempi kontakti taajuus välillä RARG ja POU5F1 loci on yhdenmukainen meidän sekvensointi tiedot ja viittaa siihen, että vakaampi vuorovaikutus muodostuu kahden loci. RARG: n ja valvontapaikkojen tutkiminen (täydentävä Kuva. 3B) paljasti, että RARG-lokuksessa on enemmän RAD21-ja muita transkriptiotekijän sitovia sivustoja, joilla on usein rinnakkaislokalisaatio. Kromosomien interaktiotiheyden yhteensattuma RAD21: tä sisältäviin sitoutumiskohtiin useiden transkriptiotekijöiden osalta viittaa siihen, että RAD21 voi tehdä yhteistyötä muiden transkriptiotekijöiden kanssa järjestääkseen pitkän kantaman kromatiini-kromatiini-interaktioita. Siten RAD21 yhdessä useiden transkriptiotekijöiden kanssa edistää todennäköisesti pou5f1: n ja SOX2: n tehostajia ympäröivää korkeamman kertaluvun kromosomirakennetta HECS: ssä osana pluripotenssiverkostoa. Tämän 4C-Seq-tutkimuksesta johdetun hypoteesin vahvistamiseksi tarvitaan kuitenkin lisää molekyylitutkimuksia.