Päätutkija: Zuben E. Sauna, PhD
Office / Division / Lab: OTAT / DPPT / HB
yleiskuvaus
proteiinipohjaisten hoitojen suuri ongelma on niiden immunogeenisuus eli taipumus laukaista ei-toivottu immuunivaste itseään vastaan. Yksi immuunivasteen muoto on B-solujen aktivaatio, joka tuottaa vasta-aineita, jotka sitoutuvat proteiineihin ja vähentävät tai poistavat niiden terapeuttisia vaikutuksia. Tällaiset vasta-aineet voivat myös aiheuttaa komplikaatioita, jotka voivat olla hengenvaarallisia. Siksi tärkeä osa proteiinipohjaisten terapeuttisten valmisteiden kliinisen turvallisuuden ja tehokkuuden määrittämistä on niiden taipumuksen mittaaminen vasta-ainemuodostuksen käynnistämiseksi.
immuunivaste proteiinipohjaisille terapeuteille sisältää myös T-soluja, jotka auttavat aktivoimaan B-soluja niin, että ne tuottavat vasta-aineita, mukaan lukien ne, jotka estävät proteiinihoitoja. Näin käy, jos elimistön tuottama luonnollinen proteiini on jollain tavalla viallinen. Tällöin T-solut reagoivat normaaliin, keinotekoiseen proteiiniin, joka on terapeuttisesti kuin vieras, koska se on erilainen kuin viallinen, luonnollinen proteiini. Tällainen T-soluvasteen epäsuhta ilmenee joskus hyytymistekijä VIII: n proteiinissa, joka on elintärkeä elimistön kyvylle muodostaa verihyytymiä verenvuodon tyrehdyttämiseksi. Ihmisillä, joilla ei ole riittävää määrää hyytymistekijä VIII: a tai joiden hyytymistekijä VIII on jollakin tavalla viallinen, on hemofilia A, sairaus, jossa veren hyytyminen on puutteellista ja johtaa liialliseen verenvuotoon. Viallisen FVIII: n ongelma perustuu geneettisesti. Vaikka hemofilia A: han ei ole parannuskeinoa, hyytymistekijä VIII: n terapeuttisen proteiinin infuusio on ollut yksi onnistuneimmista esimerkeistä kroonisen sairauden hoidossa. Valitettavasti vasta-aineiden kehittyminen infusoitua hyytymistekijä VIII: aa vastaan on merkittävä este tälle strategialle. Immuunivasteen kehittävien potilaiden hoito on monimutkaisempaa, tehottomampaa ja erittäin kallista. Nyt näyttää siltä, että yksilölliset vaihtelut lääkkeen vasta-aineiden kehittymistaipumuksessa voivat perustua myös geneettisiin eroihin. Tämä käy ilmi kliinisestä havainnosta, jonka mukaan mustafrikkalaista syntyperää olevat hemofilia A: ta sairastavat henkilöt tuottavat korvaushoitona hyytymistekijä VIII: n proteiinien vasta-aineita kaksi kertaa todennäköisemmin kuin eurooppalaista valkoihoista syntyperää olevat potilaat.
yksi strategia luonnollisen hyytymistekijä VIII: n ja korvaavan hyytymistekijä VIII: n välisten yhteensopimattomuuksien ehkäisemiseksi on geneettisesti muunnettujen hyytymistekijä VIII: n proteiinien suunnittelu siten, että ne eivät aiheuta immuunireaktioita. Ihmisten immuunijärjestelmissä on kuitenkin niin paljon eroja, että ei ole todennäköistä, että tutkijat pystyisivät suunnittelemaan FVIII-proteiinia, joka on turvallinen heille kaikille. Siksi ehdotamme yksilöllistä lähestymistapaa immuunivasteiden ennustamiseen–ja välttämiseen–hyytymistekijä VIII: n proteiineille. Pitkän aikavälin tavoitteemme on kehittää geenipohjainen lähestymistapa sellaisten henkilöiden tunnistamiseen, joiden immuunijärjestelmä todennäköisesti reagoi geenimuunneltujen terapeuttisten proteiinien tiettyihin versioihin, jotta näitä potilaita voidaan hoitaa näiden proteiinien versioilla, jotka eivät todennäköisesti aiheuta immuunivastetta.
käsittelemme myös ongelmaa, joka liittyy proteiinilääkkeiden ja luonnollisten proteiinien kolmiulotteisten rakenteiden eroihin, jotka laukaisevat B-solut tuottamaan vasta-aineita terapeuttisia proteiineja vastaan. Nykyinen menetelmä sen ennustamiseksi, käynnistävätkö tällaisten proteiinien tietyt osat vasta-ainemuodostusta, on haastava ja kallis. Siksi käytämme pieniä DNA: n kaltaisia molekyylejä, aptameereja, tutkiaksemme proteiineja ja määrittääksemme niiden tarkan muodon. Aptameerit koostuvat nukleiinihapoiksi kutsuttujen molekyylien naruista, jotka taittuvat tiettyihin muotoihin, jotka riippuvat siitä, mitkä nukleiinihapot ovat läsnä ja missä järjestyksessä ne esiintyvät aptameerissa. Siksi tunnistamalla, mikä aptameeri sitoutuu tiukasti tiettyyn molekyylin osaan, voimme ennustaa molekyylin kyseisen osan muodon, vähän kuin ennustaisimme lukon muodon tietämällä avaimen muodon, joka sopii siihen.
käytämme nyt tätä tekniikkaa määrittääksemme sekä FVIII: n muodot että pernaruttotoksiinin suojaavan antigeenin osan. Jos aptameeri menettää kykynsä sitoutua esimerkiksi hyytymistekijä VIII: aan, se viittaa siihen, että osa tästä veren hyytymistä aiheuttavasta proteiinista on muuttunut, mikä lisää todennäköisyyttä sille, että se käynnistää immuunireaktion, joka vähentää sen terapeuttista aktiivisuutta. Käytämme tätä lähestymistapaa selvittääksemme, onko terapeuttisissa proteiineissa muotoja, jotka käynnistävät vasta-ainetuotannon. Ja teemme yhteistyötä Center for Drug Evaluation and Research-keskuksen kanssa mukauttaaksemme tätä teknologiaa analysoimaan uusia proteiinituotteita, jotka on kehitetty kopioina olemassa olevista, hyväksytyistä proteiinilääkkeistä (biosimilaareista) varmistaakseen, että ne ovat turvallisia ja tehokkaita.
Tieteellinen yleiskatsaus
1) T-solujen epitooppien yhteisvaikutusten ennustaminen tiettyjen MHC-luokan II antigeenien kanssa.
tekijä VIII (tekijä VIII) on olennainen osa hyytymistekijää, ja henkilöillä, joilla ei ole hyytymistekijöitä, esiintyy elinikäisiä verenvuotohäiriöitä. Immunogeenisuuden kehittyminen hyytymistekijä VIII: n terapeuttisia (infusoituja) versioita vastaan on merkittävä este hemofiliapotilaiden hoidon onnistumiselle.
noin 50% hemofilia A-tapauksista johtuu F-geenin eksonien 1-22 inversiosta, jolloin syntyy polypeptidi, joka edustaa näitä eksoneja, mutta ei 23-26. F8-promoottorin sisällä on kuitenkin sisäkkäinen geeni, joka kääntää eksonit 23-26. 1-22-inversio tarkoittaa kuitenkin sitä, että tästä proteiinista syntyvät päällekkäiset peptidit eivät sisällä 1-22: n ja 23-26: n välistä liitosta. Infusoidusta LÄÄKEAINEPROTEIINI hyytymistekijä VIII: sta peräisin olevat peptidit, jotka peittävät tämän liitoskohdan, olisivat siten vieraita potilaan immuunijärjestelmälle, mutta ne eivät yleensä ole immunogeenisia. Endogeenisen ja infusoidun hyytymistekijä VIII: n eroista johtuva immunogeenisuus johtuu todennäköisesti monista seikoista, erityisesti yksittäisten nukleotidien polymorfismeista (SNP), mutta myös puuttuvista mutaatioista ja deleetioista, nonsense-mutaatioista sekä inversioista,
siksi ihanteellinen (mutta ei todennäköinen) ratkaisu infusoidun hyytymistekijä VIII: n immunogeenisuusongelmaan olisi suunnitella hyytymistekijä VIII: n korvaukset, jotka vastaavat kunkin potilaan haplotyyppiä ja HLA-tyyppiä, jotta immuunivastetta ei synny. Vaikka tällaisten biologisten lääkkeiden suunnittelu vastaamaan jokaista potilasta ei ole käytännöllistä, se voi olla mahdollista tapauksissa, joissa tiettyjen väestöryhmien välillä on selviä ja merkittäviä eroja (esim.Euroopan valkoihoisen ja mustan afrikkalaisen syntyperän välillä). Tällaisissa tapauksissa olisi suotavaa mukauttaa endogeenisen hyytymistekijä VIII: n malleja kuhunkin ryhmään sen varmistamiseksi, että yksi populaatio ei saa suhteetonta osuutta yhden hyytymistekijä VIII: n version hyödyistä, kun taas toinen populaatio kantaa suhteetonta osuutta saman infusoidun hyytymistekijä VIII: n riskeistä.
nykytekniikka mahdollistaa hyytymistekijä VIII: n haplotyyppien taustojen tunnistamisen sekä ainakin rajoitetun valikoiman yksilöllisiä hyytymistekijä VIII-lääkeaineita kehittämisen. Siksi lyhyen aikavälin tavoitteemme on määrittää 1) eri haplotyyppien (SNP) kvantitatiivinen jakautuminen eurooppalais-Kaukasialaisissa ja musta-afrikkalaisissa yksilöissä; 2) MHC-luokan II antigeenien jakautuminen näissä populaatioissa; 3) lääkeaineina käytettävän hyytymistekijä VIII: n koostumus; ja 4) tautia aiheuttava mutaatio, deleetio tai inversio yksittäisten potilaiden F8-geenissä (FVIII). Käytämme näitä tietoja ENNUSTAAKSEMME yksittäisten tekijä VIII: n valmisteiden immunogeenisuuden eri populaatioissa ja/tai yksittäisissä potilaissa.
2) aptameerien kehittäminen apuvälineeksi proteiinin ja lääkkeen konformaation epitooppien tutkimiseen.
Aptamerit, nukleiinihapot, jotka kykenevät muodostamaan monimutkaisia konformaatioita, ovat potentiaalisia työkaluja proteiinien konformaation kartoittamiseen, immunogeenisten kohtien tunnistamiseen ja ennustamiseen sekä immunogeenisuuden kiertämiseen. Laboratoriomme kehittää yksijuosteisia DNA-aptameerejä rekombinanttiin ihmisen hyytymistekijä VIII: aan.
suunnittelimme naiivin DNA-kirjaston tuottamaan aptamereita käyttäen määriteltyjä 5 ja 3 aluetta PCR: lle, joka reunustaa satunnaistettua 60-pohjaista aluetta. Naãven DNA-kirjasto denaturoitiin ja ssDNA-segmentit saivat taittua ainutlaatuisiksi 3-ulotteisiksi muodoiksi. (60 satunnaista emästä johtaisi teoreettisesti 460 ainutlaatuiseen konformiin.) Inkuboimme taitettua ssDNA-allasta FVIII: lla ja iteratiivisten SELEX-syklien (systemaattinen ligandien evoluutio eksponentiaalisen rikastuksen avulla) avulla pystyimme valitsemaan proteiineja sitovia aptameereja.
laboratoriomme valitsi näytteen yksittäisistä aptamereista jaksoissa 3, 5 ja 8 ja kloonasi ja sekvensoi ne. Käytämme näitä klooneja tunnistamaan aptamerit analysoimalla ennustettua 3D-rakennetta, sidontaominaisuuksia ja vaikutusta hyytymistekijä VIII: n aktiivisuuteen. Lisäksi teemme silico vertailuja näiden kloonien seurata kehitystä aptamers.
3) erilaisten analyyttisten menetelmien käyttö immunogeenisuuden kanssa mahdollisesti korreloivien proteiinien ominaisuuksien arvioimiseksi.
yhteistyössä Drs. Mansoor Khan ja Rakhi Shah (Division of Product Quality, CDER) analysoimme lääkeaineiden apuainevuorovaikutukset käyttäen lämpömenetelmiä (differentiaaliskannauskalorimetria, mikrokalorimetria, termogravimetrinen analyysi), spektroskooppisia tekniikoita (Fourier-muunnos infra-red, near infra-red, Raman), kristallografiaa (Röntgendiffraktio) ja ydinmagneettista resonanssia.
4) konformaatioherkkien vasta-aineiden Luonnehdinta.
vaihtoehtoinen menetelmä terapeuttisesti tärkeiden proteiinien konformaatioepitooppien tutkimiselle on konformaatiomuutoksille herkkien vasta-aineiden kehittäminen ja luonnehtiminen. Yhteistyössä Dr. Chava Kimchi-Sarfaty (CBER) olemme määrittäneet useita vasta-aineita, jotka ovat herkkiä konformaatio sinkkimetalloproteaasin ADAMTS13, multi-domeeni proteiini, joka cleaves von Willebrand tekijä ja liittyy tromboottinen trombosytopeeninen purppura. Tuloksemme viittaavat siihen, että nämä vasta-aineet saattavat olla hyödyllisiä reagensseja toiminnallisten ja ei-toiminnallisten ADAMTS13: n erottamiseen ja konformaatiomuutosten analysointiin katalyyttisen syklin aikana.
Publications
Int J Mol Sci 2020 May 20;21(10):e3598
Role of microRNAs in hemofilia and thromboos in humans.
Jankowska KI, Sauna ZE, Atreya CD
verensiirto 2020 Feb;60(2):401-13
hemofilia A: n kliininen ilmentymä ilman mutaatioita F8-geenissä, joka koodaa FVIII: micrornasin roolia.
Jankowska KI, McGill J, Pezeshkpoor B, Oldenburg J, Atreya CD, Sauna ZE
j Thromb Haemost 2020 Jan;18(1):201-16
Quantitative HLA-class-II/Factor VIII (tekijä VIII) peptidomic variation in Dendritic cells correlates with the immunogenic potential of therapeutic FVIII proteins in hemophilia A.
Diego VP, Luu BW, Hofmann M, Dinh LV, Almeida M, Powell JS, Rajalingam R, Peralta JM, Kumar s, Curran je, sauna ze, Kellerman R, Park y, Key ns, Escobar ma, huynh h, Verhagen am, Williams-BLANGERO s, Lehmann PV, MARASKOVSKY e, blangero J, Howard te
front immunol 2019 Dec 20;10:2894
SampPick:populaation HLA-jakaumaa vastaavan kohortin valinta.
McGill JR, Yogurtcu ON, Verthelyi D, Yang H, Sauna ZE
Sci Rep 2019 Oct 29;9(1):15449
Effects of codon optimization on cagulant factor IX translation and structure: implications for protein and gene therapies.
Alexaki a, Hettiarachchi GK, Athey JC, Katneni UK, Simhadri V, Hamasaki-Katagiri N, Nanavaty P, Lin B, Takeda K, Freedberg D, Monroe D, McGill JR, Peters R, Kames JM, Holcomb DD, Hunt RC, Sauna ZE, Gelinas a, Janjic N, DiCuccio M, Bar H, Komar AA, Kimchi-Sarfaty c
Blood Adv 2019 Sep 10;3(17):2668-78
mitigation of T-cell dependent Immunogenicity by Reengineering Factor viia Analogue.
Jankowski W, McGill J, Lagasse HAD, Surov s, Bembridge G, Bunce C, Cloake E, Fogg MH, Jankowska KI, Khan A, Marcotrigiano J, Ovanesov MV, Sauna ZE
AAPS J 2019 Aug 2;21(5):96
TCPro: in silico risk assessment tool for biotherapeuttic protein immunogenicity.
Yogurtcu ON, Sauna ZE, McGill JR, Tegenge MA, Yang H
Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 2019 Jun 1;316(6):G720-34
Translational and transcriptional responses in human primary hepatocytes under hypoxy.
Hettiarachchi GK, Katneni UK, Hunt RC, Kames JM, Athey JC, Bar H, Sauna ZE, McGill JR, Ibla JC, Kimchi-Sarfaty c
Blood Adv 2019 May 14;3(9):1429-40
peptidit identified on monocyte-derived dendritic cells: a marker for clinical immunogenicity to FVIII products.
Jankowski W, Park Y, McGill J, Maraskovsky E, Hofmann M, Diego VP, Luu BW, Howard TE, Kellerman R, Key NS, Sauna ze
AAPS J 2019 May 6;21(4):62
Fc-Fuusiolääkkeillä on FcgammaR/C1q sitovia ja signaloivia ominaisuuksia, jotka voivat vaikuttaa niiden immunogeenisuuteen.
Lagasse HAD, Hengel H, Golding B, Sauna ZE
Trends Biotechnol 2018 Oct;36(10):1068-84
Evaluating and mitigating the immunogenicity of therapeutic proteins.
Sauna ZE, Lagasse D, Pedras-Vasconcelos J, Golding B, Rosenberg AS
Hum Immunol 2018 loka;79(Suppl.):103-4
terveiltä luovuttajilta ja hemofilia-A (HA) – potilailta, joilla oli tai ei ollut tekijä VIII: n (hyytymistekijä VIII: n) estäjiä, saatujen hlacii-peptidomien analyysi sen jälkeen, kun eri terapeuttisia hyytymistekijä VIII: n proteiineja (tFVIIIs) on ex vivo annettu.
Howard TE, Diego VP, Hofmann M, Almeida M, Luu BW, Dinh LV, Rajalingam R, Escobar M, Curran J, Williams-Blangero S, Powell J, Blangero J, Maraskovsky E, Key NS, Sauna ZE
Mol Ther Methods Clin Dev 2018 Jun 15;10:105-12
Prevalence of pre-existing vasta-aineet to CRISPR-associated nuclease Cas9 in the Yhdysvaltain väkiluku.
Simhadri VL, McGill J, McMahon s, Wang J, Jiang H, Sauna ZE
j Pharm Pharmacol 2018 May;70(5):584-94
Immunogenicity assessment during the development of protein therapeutics.
Rosenberg AS, Sauna ZE
verensiirto 2017 loka;15(6):568-76
Summary report of The First International Conference on inhibitors in hemofilia A.
Lacroix-Desmazes S, Scott DW, Goudemand J, Van Den Berg M, Makris M, Van Velzen AS, Santagostino E, Lillicrap D, Rosendaal FR, Hilger a, Sauna ZE, Oldenburg J, Mantovani L, Mancuso ME, Kessler C, Hay CR, Knoebl P, Di Minno G, Hoots K, Bok A, Brooker M, Buoso E, Mannucci PM, Peyvandi F
J Med Genet 2017 May;54(5):338-45
yksittäinen tekijä IX: n synonyymi mutaatio muuttaa proteiinin ominaisuuksia ja aiheuttaa hemofilia B: n.
Simhadri VL, Hamasaki-Katagiri N, lin BC, Hunt R, Jha s, Tseng SC, Wu A, Bentley AA, Zichel R, Lu Q, Zhu L, Freedberg DI, Monroe DM, Sauna ZE, Peters R, Komar AA, Kimchi-Sarfaty c
j Thromb Haemost 2017 Apr;15(4):721-34
tekijä IX: n immunogeenisuuden modulointi fuusioimalla immunoglobuliiniin FC domain: tutkimus, jossa käytettiin hemofilia B-hiirimallia.
Levin D, Lagasse HA, Burch E, Strome s, Tan s, Jiang H, Sauna ZE, Golding b
f1000res 2017 Feb 7;6:113
Recent advances in (therapeutic protein) drug development.
Lagasse HA, Alexaki A, Simhadri VL, Katagiri NH, Jankowski W, Sauna ZE, Kimchi-Sarfaty c
Sci Transl Med 2017 Jan 11;9(372):aag1286
post hoc assessment of the immunogenicity of bioengineered factor VIIa demonstrating the use of Prekliiniset työkalut.
Lamberth K, Reedtz-Runge SL, Simon J, Klementyeva K, Pandey GS, Padkjær SB, Pascal V, León IR, Gudme CN, Buus s, Sauna ZE
Biomed Res Int 2015;2015:456348
Muscular dystrofy: disease mechanisms and therapies.
Pandey SN, Kesari A, Yokota T, Pandey GS
per Med 2015; 12 (4):403-15
yksilöityjä lähestymistapoja hemofilia A:n ja B: n hoitoon
Simhadri VL, Banerjee AS, Simon J, Kimchi-Sarfaty C, Sauna ZE
PLoS One 2015 heinä 15;10(7): E0132433
Small ncrna expression-profilointi hemofilia A-potilaiden verestä tunnistaa mir-1246: n mahdolliseksi ffctor 8-geenin säätelijäksi.
Sarachana T, Dahiya N, Simhadri VL, Pandey GS, Saini s, Guelcher C, Guerrera MF, Kimchi-Sarfaty C, Sauna ZE, Atreya CD
Nucleic Acids res 2015 Jul 13;43(12):5699-707
suuren mittakaavan analyysi ht-SELEXIN mutaatiomaisemasta parantaa aptamerin löytymistä.
Hoinka J, Berezhnoy A, Dao P, Sauna ZE, Gilboa E, Przytycka TM
Blood 2015 Jan 8;125(2):223-8
intron-22-Käänteinen F8-lokus mahdollistaa solunsisäisen hyytymistekijä VIII: n synteesin, mikä selittää sen alhaisen inhibiittoririskin ja viittaa farmakogenomiikan rooliin.
Sauna ZE, Lozier JN, Kasper CK, Yanover C, Nichols T, Howard TE
Trends Biotechnol 2015 Jan;33(1):27-34
Fc fusion as a platform technology: potential for modulating immunogenicity.
Levin D, Golding B, Strome SE, Sauna ZE