α-emolisina da Escherichia coli utilizza l’amplificazione endogena attraverso l’attivazione del recettore P2X per indurre l’emolisi

Risultati

L’emolisi indotta da HlyA richiede l’attivazione dei recettori purinergici.

Il surnatante del ceppo ARD6 che produce E. coli α-emolisina (HlyA) lisizza gli eritrociti equini, umani e murini (Fig. 1). La figura 1 mostra l’emolisi indotta da HlyA in funzione del tempo. Esperimenti time-lapse con eritrociti murini e umani attaccati ai coprioggetti hanno rivelato che l’emolisi indotta da HlyA è un processo sequenziale. Entro i primi 20 minuti, HlyA ha indotto la crenazione dei globuli rossi a seguito del restringimento delle cellule, seguito da un graduale aumento del volume e infine dalla lisi delle cellule (Fig. 1A e 1B, Film S1). Questo restringimento sequenziale e gonfiore si applica anche a livello unicellulare. Quindi, non sono diverse popolazioni di globuli rossi che si restringono o si gonfiano, ma, piuttosto, che un singolo eritrocita prima si restringe e poi si gonfia come conseguenza dell’applicazione di HlyA. La sospensione di eritrociti (1,25%) è stata incubata con surnatante diluito di E. coli (50 µl · ml−1). Gli eritrociti delle tre specie testate hanno mostrato una marcata differenza nella reattività all’HlyA (Fig. 1C) con la sensibilità più bassa a HlyA in erythrocytes umano. In tutti i seguenti esperimenti, la quantità di surnatante di E. coli aggiunto è stata regolata per produrre ≈50% di emolisi dopo 60 minuti di incubazione.

Generalmente utilizziamo il surnatante filtrato di E. coli (ARD6) per indurre l’emolisi se non diversamente indicato. Questo approccio è stato scelto per garantire che i nostri risultati si applichino anche in vivo dove HlyA viene rilasciato da E. coli insieme a vari altri componenti. Quando abbiamo scelto questo approccio, abbiamo, tuttavia, dovuto verificare che l’emolisi indotta da E. coli che produce HlyA potesse in realtà essere ascritta a HlyA. Pertanto, abbiamo purificato HlyA dalla nostra cultura ARD6. Dopo la purificazione, una sospensione dell’HlyA purificato è stata separata su un gel di sodio dodecil solfato (SDS) al 5-15%. Una singola banda da 100 kDa apparve dopo la colorazione di Coomassie R e la spettroscopia di massa identificò la banda come HlyA (Fig. S1 A e B). Come controllo aggiuntivo abbiamo usato il surnatante del ceppo di E. coli D2103, un ceppo di laboratorio non patologico di E. coli che non produce HlyA. Il surnatante di questi batteri non ha indotto emolisi negli eritrociti umani, murini o equini (Fig. S1D). Inoltre, abbiamo confrontato i nostri risultati con HlyA gentilmente fornito dal Prof. Sucharit Bhakdi, Università di Magonza, Germania (con l’attività di 10 ng * ml-1 per ≈50% emolisi, Fig. S2). Di seguito, quando viene menzionato HlyA purificato, è con riferimento a questa preparazione. Durante i nostri test iniziali sull’attività biologica di HlyA, abbiamo scoperto che l’apirasi ATP-scavenger ha completamente inibito l’emolisi indotta da HlyA degli eritrociti equini. Questa scoperta è stata davvero sorprendente, in quanto implicava ATP extracellulare necessario per l’emolisi inflitta da E. coli che produce HlyA. Poiché l’ATP extracellulare è una molecola di segnalazione che attiva i recettori P2, i nostri risultati potrebbero suggerire che il modello prevalente dei pori per l’emolisi indotta da HlyA potrebbe essere una semplificazione. Pertanto, abbiamo testato l’effetto dello scavenging dell’ATP in modo più approfondito. Abbiamo scoperto che l’apirasi ha completamente inibito l’emolisi non solo degli eritrociti equini ma anche murini e umani (Fig. 2 BIS). Inoltre, l’esochinasi, che degrada rapidamente l’adenosina trifosfato (ATP) in adenosina difosfato (ADP), ha ridotto in modo simile l’emolisi indotta da HlyA nei globuli rossi di origine murina e umana in modo dipendente dalla concentrazione (Fig. 2 TER). Questa scoperta è stata verificata da HLYA purificato (Fig. 2B, inserto). Vale la pena notare che, negli eritrociti umani, sia l’apirasi che l’esochinasi hanno potenziato l’emolisi indotta da HlyA a concentrazioni inferiori. La distinzione potrebbe suggerire una differenza nel modello di espressione del recettore P2 sui globuli rossi tra le specie.

Per convalidare la rilevanza di questa scoperta, era importante sapere se gli antagonisti del recettore P2 influenzassero l’emolisi indotta da HlyA. L’antagonista non selettivo del recettore P2 PPADS è diminuito in modo dipendente dalla concentrazione dell’emolisi indotta da E. coli che produce HlyA negli eritrociti equini, murini e umani (Fig. 2 QUATER). Il valore EC50 per PPADS era 520 µM, 400 µM e 180 µM per eritrociti umani, murini ed equini, rispettivamente. Questo risultato è stato confermato per l’intera gamma di concentrazioni di HlyA (Fig. 2D) testato in eritrociti umani esposti a HlyA purificato. La relazione concentrazione–risposta era compatibile con l’antagonismo competitivo e va notato che l’effetto delle concentrazioni massime di tossine è stato ridotto dal bloccante del recettore P2. Pertanto, l’attivazione del recettore P2 sembra essere coinvolta nell’emolisi indotta da HlyA. L’antagonista non selettivo del recettore P2 suramin ha anche diminuito l’emolisi indotta da HlyA in modo dipendente dalla concentrazione in tutte e tre le specie (dati non mostrati). In concentrazioni più elevate suramin, tuttavia, causa un drammatico restringimento degli eritrociti e quindi potrebbe non essere adatto per valutare l’implicazione del recettore P2 negli eritrociti.

Per valutare se l’effetto dell’antagonista purinergico sull’emolisi fosse semplicemente il risultato di una maggiore osmolalità, abbiamo testato l’effetto del saccarosio extracellulare sull’emolisi indotta da HlyA (dati non mostrati). Il saccarosio (1 mm) ha ridotto solo leggermente l’emolisi (5,1% ± 1,7%), mentre il saccarosio di 10 mm e 75 mm ha ridotto notevolmente l’emolisi (28.5% ± 5.0%, 82.8% ± 5.2%). Dato che le concentrazioni degli antagonisti e delle ATPasi utilizzate in questo studio non hanno mai superato 1 mm, l’effetto non può essere il risultato di una maggiore osmolarità. Né i nostri risultati riflettono il legame non selettivo tra gli antagonisti e la tossina. Questo è stato testato in eritrociti equini, che sono stati preincubati con HlyA per 10-15 minuti a 37 ° C o per 30 minuti a 4 ° C, accuratamente lavati e ri-sospesi con o senza gli antagonisti. Poiché HlyA è incorporato nella membrana durante la preincubazione, gli eritrociti hanno proceduto alla lisi in assenza di HlyA libero. Fico. S2 mostra che vari interventi farmacologici hanno ridotto l’emolisi dopo che HlyA è stato prebound agli eritrociti. Gli antagonisti erano, tuttavia, meno efficienti quando aggiunti agli eritrociti lavati in cui il processo litico era già iniziato.

Quale recettore P2 è coinvolto nell’emolisi indotta da HlyA?

Gli eritrociti esprimono vari tipi di recettori P2. I recettori P2 che sono stati segnalati per essere espressi in eritrociti umani maturi includono P2Y1 (14), P2Y2 (15), P2Y13 (15), P2X1 (15) e P2X7 (16), mentre P2Y1, P2X1, P2X4 e P2X7 sembrano essere presenti nelle cellule progenitrici eritroidi (17). Per testare quale di questi recettori purinergici partecipa all’emolisi indotta da HlyA, abbiamo affrontato i recettori in questione individualmente. Poiché il recettore P2Y1 è implicato nell’emolisi indotta da sorbitolo di eritrociti umani e murini infetti da plasmodio (14), abbiamo testato se questo recettore fosse responsabile dell’emolisi indotta da HlyA. L’antagonista del recettore P2Y1 MRS2179 non ha influenzato l’emolisi indotta da HlyA (Fig. S3A) a concentrazioni (fino a 500 µM) oltre quanto necessario per inibire l’emolisi negli eritrociti infettati da Plasmodium berghei (14). Poiché non ci sono antagonisti specifici per i recettori P2Y2, abbiamo esaminato l’effetto di HlyA nei topi transgenici. L’emolisi indotta da HlyA era simile negli eritrociti da topi P2Y2 – / – e P2Y2+ / + (Fig. S3B). Nel caso del P2Y13 abbiamo testato l’antagonista MRS2211, che è stato segnalato per mostrare una certa selettività verso il recettore P2Y13 (18). MRS2211 ha diminuito significativamente l’emolisi indotta da HlyA negli eritrociti umani e murini (Fig. S3C). Questa scoperta contraddice i nostri risultati con l’esochinasi (degradante ATP ad ADP), che dovrebbe stimolare piuttosto che inibire il recettore P2Y13 sensibile all’ADP. Pertanto, esochinasi e MRS2211 dovrebbero dare risultati opposti se il recettore P2Y13 è coinvolto. Poiché questo non è il caso, il recettore P2Y13 è un candidato improbabile per il recettore P2 coinvolto nell’emolisi indotta da HlyA. Non possiamo escludere la possibilità che l’inibizione prodotta da MRS2211 sia mediata attraverso un altro recettore P2.

In linea di principio, questo lascia solo i recettori P2X da considerare. Fico. 3A mostra che il bloccante non selettivo dei recettori P2X Evans blue ha ridotto potentemente l’emolisi indotta da HlyA, suggerendo che un recettore P2X è coinvolto in questa emolisi. Dei recettori P2X espressi negli eritrociti, abbiamo considerato il P2X7 come il più probabile mediatore dell’emolisi indotta da HlyA per i seguenti motivi. I recettori P2X7 sono noti per subire una transizione verso uno stato di permeabilità maggiore, che alla fine porta alla lisi in alcune cellule (12). È stato riportato che il recettore P2X7 interagisce con la proteina del canale pannexin1 (12) e il complesso crea un poro consistente permeabile a molecole più grandi come il bromuro di etidio (13). Pannexin1 è espresso nei globuli rossi umani (19) ed è stato recentemente suggerito come canale di rilascio di ATP negli eritrociti (20). Per verificare se i recettori P2X7 partecipano all’emolisi indotta da HlyA, abbiamo usato antagonisti con selettività relativa per P2X7: Blu brillante G (BBG), ATP-2′,3′-dialdeide (OxATP) e KN-62 (21). Tutti gli antagonisti concentrazione-dipendente diminuita emolisi in equino, murino, e eritrociti umani (Fig. 3). Gli eritrociti equini e umani erano più sensibili a tutte le sostanze testate rispetto agli eritrociti murini. In questo contesto, va detto che il recettore murino P2X7 è noto per essere meno sensibile a KN-62 rispetto al recettore umano (22). La protezione contro l’emolisi da parte dell’antagonismo del recettore P2X è stata nuovamente dimostrata per l’intero intervallo di concentrazione di HlyA purificato negli eritrociti umani usando BBG come esempio di un antagonista P2X7 (Fig. 3D). Ancora una volta l’antagonista mostra un effetto sostanziale sull’emolisi indotta da HlyA anche sotto le concentrazioni di HlyA che hanno prodotto l’emolisi massima. L’inibizione dell’emolisi da parte di OxATP è stata verificata utilizzando HlyA purificato negli eritrociti murini e umani (Fig. 3E, inserto). Il nuovo antagonista selettivo e competitivo del recettore P2X7 A438079 ha ridotto l’emolisi negli eritrociti umani, ma era meno efficiente negli eritrociti murini (Fig. 3 SEPTIES). Immunoblots di membrana plasmatica-frazioni per il recettore P2X7 confermano che gli eritrociti umani e murini esprimono una proteina di dimensioni rilevanti (66 kDa, Fig. 3G, e per intero in Fig. S4B). Richiederà ulteriori indagini per stabilire completamente il contributo relativo dei recettori P2X nell’emolisi indotta da HlyA. Con i nostri strumenti attuali, non possiamo escludere la possibilità di contributi da altri recettori P2X nell’emolisi indotta da HlyA in nessuna delle specie studiate.

Fig. S4A mostra l’emolisi indotta da HlyA negli eritrociti murini (P2X7+/+ e P2X7 -/ -). Gli eritrociti murini mostrano un grado simile di emolisi in risposta a HlyA indipendentemente dal loro genotipo. I topi P2X7−/ – e P2X7 + / + sono stati originariamente generati da Pfizer e sono stati backcrossed in BALB / c sfondo. Non abbiamo rilevato alcuna discrepanza tra la sensibilità all’emolisi indotta da HlyA negli eritrociti isolati da topi BALB/c e C57BL/6 (dati non mostrati), anche se il ceppo C57BL/6 è noto per avere una variazione genetica nel terminale C del recettore P2X7 (23). Questi dati sono coerenti con l’effetto minuscolo di A438079 sugli eritrociti murini e la bassa espressione proteica del recettore P2X7 negli eritrociti murini (Fig. 3F e 3G).

Questi risultati implicano che c’è almeno un recettore P2 aggiuntivo coinvolto nell’emolisi indotta da HlyA negli eritrociti murini. Poiché P2X1 e P2X7 condividono profili inibitori simili per BBG, KN-62 e OxATP (24), abbiamo testato gli antagonisti P2X1 MRS2159 e NF449. MRS2159 emolisi inibita in modo dipendente dalla concentrazione negli eritrociti da cavallo (EC50: 150 µM) e topo (EC50: ≈250 µM). Gli eritrociti umani erano relativamente insensibili all’antagonista, ma a una concentrazione superiore a 250 µM, abbiamo visto una riduzione piccola e statisticamente significativa (Fig. 4 BIS). Questo effetto era molto più pronunciato se veniva usato HlyA purificato (Fig. 4 QUATER). Ciò implica che potrebbero esserci differenze nella risposta cellulare rispetto al fatto che siano sottoposti a HlyA in forma pura o in combinazione con altri costituenti di E. coli. NF449 inibisce in modo dipendente dalla concentrazione l’emolisi indotta da HlyA nell’uomo (Fig. 4 TER). NF449 era molto meno efficiente negli eritrociti murini in accordo con il recettore murino P2X1 che era relativamente resistente a questo inibitore (25). Va sottolineato che anche se NF449 è un derivato della suramina, non ha provocato gli stessi cambiamenti di volume negli eritrociti della suramina. Immunoblots del recettore P2X1 sono noti per mostrare fino a 4 bande in vari tessuti; un 45 kDa non glicosilato, un 60 kDa glicosilato e una banda 95/120 kDa che potrebbe essere la forma polimerizzata del recettore (26, 27). Nelle nostre mani l’anticorpo del recettore P2X1 ha costantemente riconosciuto una banda di 45 KD e una banda di 60 kDa molto debole in macchie di membrane plasmatiche da eritrociti murini e umani (Fig. 4D). È interessante notare che abbiamo scoperto che il livello di espressione 60 banda kDa era molto più alto nei topi P2X7−/− rispetto ai controlli (simile in tre preparazioni, Fig. 4D). In questo immunoblot i livelli di proteine sono regolati per evitare il sovraccarico delle bande dai topi P2X7−/−, che lascia la banda 60 kDa quasi inosservabile nei topi P2X7+/+. Questa apparente up-regolazione del recettore P2X1 potrebbe potenzialmente nascondere un fenotipo emolitico nei topi carenti del recettore P2X7. Presi insieme, questi dati supportano l’ipotesi che sia il recettore P2X1 che P2X7 siano rilevanti per l’emolisi indotta da HlyA. I nostri risultati indicano variazioni interspecie significative, in cui il recettore P2X7 è più importante per l’emolisi negli eritrociti umani.

L’emolisi indotta da HlyA è prevenuta dagli antagonisti di Pannexin1.

Carbenoxolone (28), meflochina e probenecid (30) sono stati usati come antagonisti con relativa selettività per pannexin1. Carbenoxolone ha ridotto significativamente il livello di emolisi in tutte e tre le specie con sensibilità simile (Fig. 5 BIS). L’effetto del carbenoxolone è stato nuovamente testato per l’intera gamma di concentrazioni di HlyA (tossina purificata, Fig. 5B), mostrando anche effetti considerevoli sotto concentrazioni massime di HlyA. Meflochina e probenecide sono stati testati solo in eritrociti murini e umani. La EC50 per la meflochina era di 25 µM negli eritrociti umani e di 18 µM negli eritrociti murini. Probenecid ha inibito l’emolisi negli eritrociti umani, con EC50 di 2 mm, ma è risultato meno efficace negli eritociti murini. Recentemente, gli antagonisti noti del canale Cl–NPPB e l’acido niflumico hanno dimostrato di inibire anche i canali pannexin (31). Entrambe le sostanze hanno ridotto l’emolisi indotta da HlyA, con un effetto sostanzialmente più pronunciato sugli eritrociti umani (Fig. S5).