- Mioblasti adottare una forma allungata di differenziarsi e di regolare la loro actina rete per l’area di diffusione
- L’organizzazione spaziale della rete di actina e del nucleo è diretta dalla morfologia del mioblasto
- L’allungamento delle cellule migliora la contrattilità del mioblasto
- La contrattilità delle coppie cellulari è aumentata dopo la loro fusione e si alza su micropatterne allungate
- La contrattilità dell’actomyosina promuove la differenziazione dei miotubi
- Myoblast allungamento trigger YAP esportazione nucleare, che è essenziale per la differenziazione dei mioblasti in myotubes
Mioblasti adottare una forma allungata di differenziarsi e di regolare la loro actina rete per l’area di diffusione
Per valutare la relazione tra la forma della cellula, actina rete e adesioni focali, abbiamo colto mioblasti C2C12 in uno strato omogeneo di fibronectina (FN). Dopo 24 ore in coltura, i mioblasti sono stati fissati e colorati per l’actina per determinare i loro parametri morfologici (Fig. 1 BIS). I substrati rivestiti di FN hanno permesso l’instaurazione di specifiche interazioni cellula-substrato reclutando specifiche integrine transmembrana. Infatti, diverse subunità dell’integrina α che si combinano con la subunità β1 sono espresse durante la miogenesi scheletrica, essendo importanti nella migrazione cellulare miogenica, nella fusione del mioblasto,nella maturazione delle fibre muscolari o nel mantenimento dell’integrità muscolare32, 33. Ulteriori esperimenti eseguiti su substrati rivestiti di laminina(LAM) hanno indicato che entrambi i parametri morfologici (indice di forma cellulare, perimetro cellulare e area cellulare, Fig. 1A) e interazioni cellula-substrato (numero e area di aderenze focali, Fig. 1B) erano statisticamente simili su FN e LAM, convalidando il rivestimento FN per studiare in vitro le morfologie dei mioblasti C2C12 durante il processo di fusione/differenziazione.
I mioblasti adottano una forma allungata per differenziare e regolare la loro rete di actina nell’area di diffusione. (A) Immagini di epifluorescenza codificate a colori di mioblasti individuali tipici di C2C12 che presentano vari indici di forma cellulare (CSI) in vitro. Le cellule sono state colorate con falloidina per actina. Le barre di scala sono 20 µm. L’analisi morfologica di (B) il CSI (R2 = 0,80), (C) il perimetro cellulare (R2 = 0,97) e (D) l’area cellulare (R2 = 0.82) indicano che le cellule C2C12 coltivate in vitro hanno mostrato un’area media di 2057 ± 618 µm2 e un CSI medio di 0,37 ± 0,15 (n = 101 per B, C e D). Le curve rosse sono attacchi gaussiani. E) Evoluzione lineare dell’intensità di fluorescenza dell’actina in funzione dell’area cellulare (R2 = 0,748, n = 28). Evoluzione dell’area totale della vinculina in funzione di (F) dell’area cellulare (R2 = 0,783, n = 28) e (G) e dell’intensità della F-actina (n = 28). (H) Linea temporale di proliferazione (in giallo) e differenziazione (in rosso) dei mioblasti C2C12 in vitro. La freccia nera indica la sostituzione dei supporti di proliferazione con supporti di differenziazione. (I, J) Rapporto di aspetto dei mioblasti a P0, P2 (stadi di proliferazione, media = 0,40 ± 0,16 a P0, n = 150 per entrambi) e D2 (stadio di differenziazione, media = 0,24 ± 0,07, n = 100).
Abbiamo quantificato il cell shape index (CSI) che ha caratterizzato la morfologia dei mioblasti fornendo informazioni sull’allungamento cellulare. Le cellule arrotondate hanno un CSI vicino a 1, mentre le cellule allungate hanno un CSI vicino a 0. Abbiamo trovato CSI che vanno da 0.1 a 0.8 con un valore medio di 0.37 ± 0,15 (n = 101), suggerendo una grande variabilità nelle morfologie cellulari (Fig. 1 TER). I mioblasti mostravano un perimetro medio di 259 ± 82 µm (Fig. 1C, n = 101) e un’ampia gamma di aree di diffusione (da ~1000 a ~ 4000 µm2), con un valore medio di 2057 ± 618 µm2 (Fig. 1D, n = 101). Questi risultati ottenuti su mioblasti C2C12 sono stati rafforzati eseguendo ulteriori misurazioni morfologiche (CSI, perimetro cellulare e area cellulare) su mioblasti umani primari (16UBic, Fig supplementare. 2A) che provengono dal bicipite di un paziente non influenzato dall’FSHD (cioè a cui è stata confermata la mancanza di una cancellazione 4qA). Come mostrato in Fig. supplementare. 2B-D, i nostri risultati dimostrano che il CSI dei mioblasti 16ubici variava da 0,14 a 0,86 con un valore medio di 0,44 ± 0,17 (n = 90), suggerendo una grande variabilità nelle morfologie cellulari per i mioblasti umani, come osservato per le cellule C2C12. Presi insieme, i nostri risultati dimostrano che la variabilità delle morfologie cellulari non dipende dal tipo di cellula o da qualsiasi artefatto della coltura cellulare.
Abbiamo quindi studiato la distribuzione dei filamenti di actina in una popolazione di mioblasti C2C12 per capire se le aree di diffusione della variabilità possono modulare il citoscheletro di actina. I nostri risultati hanno mostrato che l’intensità di fluorescenza totale della rete F-actina era linearmente correlata all’area cellulare (Fig. 1E, n = 31, R2 = 0,748), suggerendo che più grande è la diffusione del mioblasto, più si formano i filamenti di actina. Come mostrato in Fig. supplementare. 3, abbiamo successivamente caratterizzato la distribuzione delle aderenze contenute nella vinculina per determinare in che modo le variazioni della forma cellulare influenzano le interazioni cellula-substrato nei mioblasti C2C12. Abbiamo scoperto che l’area totale delle aderenze del substrato cellulare per cellula aumentava con l’area cellulare (Fig. 1F, n = 31, R2 = 0,783) e con l’intensità della fluorescenza di F-actina (Fig. 1G). I nostri risultati indicano che i mioblasti C2C12 assumono una varietà di forme cellulari e aree di diffusione, ma a loro volta adattano sia la quantità di filamenti di actina che le aderenze di vinculina alla loro diffusione. Per ottenere maggiori informazioni sul ruolo della forma cellulare per la differenziazione del mioblasto, consideriamo successivamente l’evoluzione del rapporto di aspetto cellulare durante gli stadi di proliferazione (P0 a 6 ore e P2 a 48 ore) e differenziazione (D2 a 96 ore) (Fig. 1H). Come mostrato in Fig. 1I, J, i nostri risultati mostrano che i mioblasti hanno aumentato il loro rapporto di aspetto da 0,40 ± 0,16 (P0) a 0,36 ± 0,09 (P2) e 0,24 ± 0,07 (D2), suggerendo che i mioblasti si allungano in modo significativo e adottano un rapporto di aspetto di 1:4 per differenziarsi. Inoltre, i nostri risultati hanno indicato che le fibre di stress di actina erano altamente orientate a D2 (Fig. 4A, B), corrispondente anche ad allungamenti nucleari significativi (Fig. 4 QUATER). Presi insieme, i nostri risultati mostrano che la rete di F-actina è modulata da modifiche della morfologia del mioblasto e indicano che la differenziazione dei mioblasti richiedeva un allungamento cellulare fino a un rapporto di aspetto di 1:4.
L’organizzazione spaziale della rete di actina e del nucleo è diretta dalla morfologia del mioblasto
Abbiamo controllato la variabilità intrinseca nelle morfologie del mioblasto utilizzando micropattern adesivi per standardizzare le loro aree di diffusione e controllare le loro forme. Utilizzando una tecnica di stampa a microcontatto20, abbiamo creato micromodelli adesivi di fibronectina (FN) con un’area costante di 1600 µm2 e geometrie diverse. Abbiamo usato arrotondato (CSI = 1), quadrato (CSI = 0,79), triangolare (CSI = 0,60) e diversi rapporti di aspetto di rettangolare (CSI = 0,50 e 0,34 per 1: 4 e 1:7 proporzioni, rispettivamente) FN micropatterns alla coltura mioblasti individuali (Fig. 2 BIS). Queste diverse geometrie di micropattern hanno permesso di standardizzare in vitro la forma del mioblasto su un ampio intervallo e di controllarne l’area di diffusione.
L’organizzazione spaziale della rete di actina e del nucleo è diretta dalla morfologia del mioblasto. (A) Immagini di epifluorescenza di cellule C2C12 coltivate su micropattern di fibronectina (FN) di 1600 µm2 e immunostained per F-actina (verde), nuclei (blu) e vinculina (rosso). I micropattern circolari, quadrati, triangolari e rettangolari (proporzioni 1:4 e 1:7) corrispondono a CSI = 1, 0,79, 0,60, 0,50 e 0,34, rispettivamente. Le barre di scala sono 20 µm. (B) Esempi tipici dell’organizzazione spaziale dei filamenti di actina in cellule C2C12 micromodellate che sono codificate a colori secondo i loro orientamenti. Le barre di scala sono 20 µm. (C) Orientamento della rete di actina in arrotondato (n = 12 in nero), quadrato (n = 11 in rosso), triangolare (n = 19 in blu) e 1:4 (n = 18 in verde) o 1:7 (n = 11 in rosa) mioblasti micropatterned rettangolari. Evoluzione di (D) il rapporto di aspetto nucleare e (E) l’orientamento nucleare per diverse geometrie di mioblasti (10 ≤ n ≤ 15 per ogni CSI).
Per determinare quantitativamente il ruolo della geometria cellulare sull’organizzazione spaziale del citoscheletro di actina, abbiamo determinato l’orientamento dei filamenti di actina per ogni forma cellulare34,35. I filamenti di actina macchiati con falloidina erano codificati a colori in funzione del loro orientamento con una sfumatura di colore che andava dal blu chiaro quando i filamenti di actina erano organizzati paralleli (0°) all’asse orizzontale e rossi (+90°) o arancioni (-90°) per quelli organizzati perpendicolarmente all’asse orizzontale (Fig. 2 TER). Abbiamo osservato che i filamenti di actina nelle cellule arrotondate sono stati distribuiti in modo casuale, con orientamenti che vanno da -90° a +90°. Le cellule quadrate mostravano filamenti di actina organizzati in tre domini angolari principali: da 0° a 25°, da 50° a 90° e da -50° a -90°, mentre le cellule triangolari mostravano filamenti di actina principalmente organizzati secondo i tre lati del modello a 0°, 60° e -60°. È interessante notare che i filamenti di actina erano altamente orientati parallelamente all’asse delle cellule lunghe (0°) per le cellule rettangolari di proporzioni 1:4 (CSI = 0,50) e 1:7 (CSI = 0,34). La quantificazione delle aderenze contenenti vinculina non ha indicato differenze statistiche di aree di adesione tra morfologie cellulari (Fig. 5A-C), mentre l’orientamento delle aderenze focali è stato modulato dalla forma cellulare (Fig. 5D, E), come osservato per i filamenti di actina. I nostri risultati mostrano che sia i mioblasti rettangolari 1:4 che 1:7 consentono una più forte organizzazione del citoscheletro di actina (Fig. 2C) e aderenze focali, suggerendo che l’allungamento del mioblasto porta alla formazione di dipoli contrattili.
Considerando il ruolo del nucleo cellulare nella differenziazione dei mioblasti nei miotubi, abbiamo successivamente studiato se i cambiamenti nella forma cellulare e nell’architettura del citoscheletro possono modulare la forma e l’orientamento del nucleo36. Abbiamo scoperto che il rapporto di aspetto nucleare è aumentato significativamente con l’abbassamento del CSI (Fig. 2D). Infatti, le cellule arrotondate (CSI = 1) su micropatterne circolari mostravano un nucleo arrotondato caratterizzato da un rapporto di aspetto medio di 1,11 ± 0,06, mentre le cellule rettangolari con un rapporto di aspetto di 1:4 (CSI = 0,50) e 1:7 (CSI = 0,34) mostravano grandi deformazioni nucleari con rapporti di aspetto di 1,39 ± 0,21 e 2,19 ± 0,23, rispettivamente. Abbiamo anche notato che l’orientamento del nucleo è stato modulato dalla morfologia cellulare (Fig. 2E). Abbiamo scoperto che l’orientamento del nucleo in celle arrotondate, quadrate e triangolari copriva una vasta gamma di angoli (da ~15° a ~60°), con un orientamento medio di ~40° (circolare, n = 11), ~33° (quadrato, n = 14) e ~43° (triangolo, n = 10) rispetto all’asse orizzontale. Per le celle rettangolari, i nostri risultati hanno indicato che il nucleo era orientato parallelamente all’asse della cella con un angolo medio di ~14° (1:4, n = 15) e ~2° (1:7, n = 10).
L’allungamento delle cellule migliora la contrattilità del mioblasto
La prossima domanda che abbiamo affrontato è stata come i cambiamenti nella forma delle cellule influenzano la contrattilità del mioblasto. Per rispondere a questa domanda, abbiamo usato la microscopia della forza di trazione (TFM) per determinare le sollecitazioni di trazione esercitate dai mioblasti micropatterned. Come mostrato in Fig. 3A abbiamo osservato che le sollecitazioni massime sono state esercitate alle estremità dei mioblasti micropatternati, indipendentemente dalla forma cellulare. Come osservato in precedenza su altri tipi di cellule37, lo stress contrattile si accumulava preferenzialmente negli angoli (quadrati e triangoli) o ad entrambe le estremità (rettangoli 1:4 e 1:7) dei mioblasti micropatternati. Abbiamo quantificato lo stress totale esercitato dai singoli mioblasti micropatternati per determinare se la morfologia cellulare modula la contrattilità cellulare. Come mostrato in Fig. 3B, le celle arrotondate (CSI = 1) hanno esercitato una sollecitazione totale di 170,7 ± 46,4 N/m2, mentre le celle rettangolari (CSI = 0,34, aspect ratio 1:7) hanno esercitato una maggiore quantità totale di sollecitazione (295,9 ± 156.8 N / m2), suggerendo che le forme delle cellule allungate portano ad un aumento delle sollecitazioni di trazione. Inoltre, abbiamo scoperto che le celle di forma rettangolare (CSI = 0,34, aspect ratio 1: 7) mostravano il valore massimo di stress più grande (684,3 ± 257,8 Pa, Fig. 3C), mentre i mioblasti arrotondati hanno mostrato il valore di stress massimo più basso (351,5 ± 123,6 Pa). Considerando che le sollecitazioni contrattili sono state esercitate alla periferia della cellula e che l’abbassamento del CSI porta ad un aumento delle sollecitazioni di trazione, abbiamo tracciato il valore massimo di stress in funzione della distanza dal centro di massa all’estremità della cellula (Fig. 3D), che rappresenta 22,6 µm (CSI = 1), 28,28 µm (CSI = 0,79), 33,98 µm (CSI = 0,60), 41,23 µm (CSI = 0,50) e 53,45 µm (CSI = 0,34). Come mostrato in Fig. 3D, abbiamo scoperto che lo stress contrattile massimo aumentava linearmente con la distanza dal centroide all’estremità della cellula (R2 = 0,958, n = 65), suggerendo che le morfologie allungate dei mioblasti esercitano più forze di trazioni.
Al fine di determinare il contributo della rete di actomiosina nello stabilimento di forze contrattili nei mioblasti, le cellule C2C12 sono state trattate con il farmaco sequestrante G-actina Latrunculina B (LatB) e con l’inibitore della miosina II Blebbistatina (Bleb). I mioblasti immunostained con falloidina hanno indicato che le cellule trattate con LatB e Bleb mostravano una rete diffusa di actina (Fig. 3E), dimostrando che entrambi i farmaci hanno influenzato significativamente l’organizzazione della F-actina. Abbiamo usato TFM su mioblasti micropatterned trattati con entrambi i farmaci per determinare il ruolo della rete actomyosin nella creazione di forze contrattili in mioblasti di diverse geometrie. I nostri risultati indicano che il trattamento con LatB ha indotto una significativa perdita di contrattilità, che è aumentata con l’allungamento cellulare. Infatti, le cellule arrotondate hanno mostrato una perdita di stress contrattile di ~62%, mentre le cellule rettangolari 1: 4 e 1: 7 trattate con LatB erano caratterizzate da una perdita di stress contrattile di ~88% e ~86%, rispettivamente (Fig. 3 SEPTIES). Inoltre, abbiamo scoperto che lo stress contrattile di 1:4 celle rettangolari trattate con Bleb sono state caratterizzate da una perdita di ~80% della forza contrattile, dimostrando che i motori molecolari della miosina II sono attori chiave delle forze contrattili del mioblasto.
Presi insieme, questi risultati indicano che la contrattilità della rete di actomiosina è migliorata nei mioblasti allungati attraverso la creazione di una fitta rete di fibre di actomiosina parallele.
La contrattilità delle coppie cellulari è aumentata dopo la loro fusione e si alza su micropatterne allungate
Per capire come la morfologia del mioblasto può influenzare le proprietà contrattili dei miotubi, consideriamo un modello minimo di due mioblasti. Per prima cosa abbiamo determinato le forze di trazione esercitate dai doppietti cellulari a P1 (24 h nei mezzi di proliferazione) placcati su micropattern di varie forme (Fig. 6 BIS). Non c’erano differenze statistiche di stress contrattile tra l’ampia gamma di CSI (Fig. 6B), nonostante un orientamento ben definito della rete di actina (Fig. 6C) e i nuclei (Fig. 6D, E) su micropattern rettangolari 1:4 e 1:7. Sulla base di questa osservazione, abbiamo quindi quantificato lo stress contrattile esercitato dai doppietti cellulari coltivati su micropattern FN circolari (CSI = 1) e rettangolari (CSI = 0,50, 1:7 aspect ratio) durante cinque giorni aggiuntivi (D5, Fig. 1H) nel mezzo di differenziazione. Abbiamo usato MitoTracker Red CMXRos (ThermoFisher Scientific), una colorazione mitocondriale dal vivo, per garantire che i doppietti mioblasti fossero fusi (Fig. 4 BIS) 38. Come mostrato in Fig. 4B, C, abbiamo scoperto che lo stress contrattile totale era leggermente aumentato nei doppietti cellulari fusi cresciuti su micropatterne circolari (267 ± 64 Pa) rispetto ai doppietti cellulari non fusi (157 ± 37 Pa), mentre i doppietti allungati fusi erano più di due volte più contrattili (543 ± 193 Pa) rispetto ai doppietti allungati non fusi (211 ± 73 Pa). Questi risultati indicano che la contrattilità cellulare è aumentata dopo la fusione cellulare ed è stata significativamente migliorata per morfologie allungate.
La contrattilità delle cellule coppie aumentata dopo la loro fusione e aumentare allungata sulla microdisegni. (A) Immagini di epifluorescenza di coppie di cellule C2C12 non condensate (D) e fuse (FD) su micropattern FN circolari e rettangolari (1:7 aspect ratio) e colorate per i mitocondri con Mito Tracker. Le barre di scala sono 20 µm. (B) Mappe rappresentative della sollecitazione contrattile esercitata da coppie di cellule C2C12 fuse su micromodelli FN circolari e rettangolari. C) Evoluzione della sollecitazione totale per coppie di celle non condensate (D), (barre semplici) e fuse (FD, barre con hash) C2C12 su micropattern FN circolari (in grigio) e rettangolari (in viola). Cerchio D: n = 8; Cerchio FD: n = 5; rettangolo D: n = 6 e rettangolo FD: n = 8. ** p < 0.01.
La contrattilità dell’actomyosina promuove la differenziazione dei miotubi
Abbiamo quindi chiesto se la contrattilità dell’actomyosina dei mioblasti potesse influenzare la differenziazione dei miotubi. I mioblasti C2C12 sono stati coltivati su substrati rivestiti di FN in terreni di proliferazione per 2 giorni (P2, Fig. 1H) per raggiungere la confluenza cellulare. Quindi, LatB o Bleb sono stati aggiunti per 30 minuti e il mezzo di proliferazione è stato sostituito da un mezzo di coltura di differenziazione. Dopo 4 giorni in mezzo di differenziazione (D4, Fig. 1H), le cellule C2C12 sono state fissate e colorate per DNA e TroponinT, un marker di differenziazione (Fig. 5). Abbiamo valutato l’effetto dei trattamenti LatB e Bleb colorando alfa actinina sui miotubi di controllo (CTRL) e miotubi trattati con Latrunculina B (+LatB) e blebbistatina (+Bleb). Come osservato in Fig. supplementare. 7, i miotubi di controllo presentano modelli tipici della banda Z striata, mentre i trattamenti LatB e Bleb disturbano i modelli di striatura nei miotubi. I miotubi di controllo (CTRL)erano caratterizzati da un rapporto di aspetto medio di 7,99 ± 3,38 (Fig. 5A) e un’area positiva di Troponina T del 51,7 ± 5,6% (Fig. 5 TER). I nostri risultati indicano che i trattamenti LatB e Bleb hanno ridotto la frazione dell’area della troponina T a 44,9 ± 5,2% e 44,4 ± 5,1%, rispettivamente. Inoltre, abbiamo scoperto che l’indice di fusione era statisticamente inferiore per le cellule LatB (27 ± 3%) e trattate con Blebb (29 ± 3%) rispetto alle cellule di controllo (38 ± 5%), rafforzando il ruolo della contrattilità dell’actomiosina nella differenziazione del mioblasto (Fig. 5 QUATER). Presi insieme, questi risultati hanno indicato che la contrattilità dell’actomiosina dei mioblasti promuove la differenziazione dei miotubi.
La contrattilità dell’actomiosina favorisce la differenziazione dei miotubi. (A) Distribuzione del rapporto di aspetto del miotubo dopo 4 giorni in supporti di differenziazione (n = 114, R2 = 0,915). Evoluzione di (B) la percentuale di area positiva per la troponina T e (C) l’indice di fusione nelle cellule di controllo (CTRL), LATB e cellule trattate con Bleb (n = 20 per ciascuna). (D) Tipiche immagini di epifluorescenza di miotubi di controllo (Ctrl), LatB e miotubi trattati con Bleb formati dopo 4 giorni in supporti di differenziazione. I miotubi sono stati immunostenuti per il DNA (blu) e la troponina T (rossa). Le barre di scala sono 100 µm. *p <0.05, **p< 0.01 e n.s. non significativo.
Myoblast allungamento trigger YAP esportazione nucleare, che è essenziale per la differenziazione dei mioblasti in myotubes
Per capire meglio i meccanismi intracellulari che il controllo myotube differenziazione, riteniamo che il ruolo di YAP determinando la sua localizzazione nel citoplasma o il nucleo di mioblasti, dove si lega e attiva il TEAD trascrizione factors39. A tal fine, abbiamo quantificato il rapporto YAP citoplasmatico/nucleare nei mioblasti micropatternati (Fig. 6A e supplementari Fig. 8). Allungamento delle cellule su 1:4 e 1: 7 micropattern rettangolari hanno aumentato il rapporto YAP citosolico / nucleare (Fig. 6B), suggerendo che l’allungamento cellulare innesca l’esportazione nucleare di YAP attraverso forze di compressione nucleari esercitate dalla rete di actomyosin40. Per verificare se la localizzazione di YAP nel citoplasma o nel nucleo è correlata a fasi specifiche del processo di differenziazione, abbiamo colorato YAP in cellule C2C12 dopo 24 h (P1) e 48 h (P2) della fase di proliferazione e a 96 h (D2) e 264 h (D9) della fase di differenziazione (Fig. 6C e supplementari Fig. 9). È interessante notare che i nostri risultati hanno indicato che il rapporto YAP citoplasmatico / nucleare è aumentato da 0,37 ± 0,07 a P1 a 0,68 ± 0,06 a P2 e 0,67 ± 0,06 a D2 e quindi è diminuito a 0,42 ± 0,10 a D9 (Fig. 6D). È interessante notare che il rapporto YAP citoplasmatico/nucleare a D9 è stato trovato statisticamente non diverso dai valori P1, suggerendo che il rapporto YAP citoplasmatico/nucleare nei miotubi differenziati è simile a quello dei mioblasti. Per verificare questi risultati, abbiamo raccolto mioblasti allo stadio di proliferazione P1 (24 h) e allo stadio di differenziazione D2 (96 h) e abbiamo isolato i loro materiali citoplasmatici e nucleari. Abbiamo effettuato un test di proteine dell’acido bicinchoninico (BCA) e le proteine contenute nelle estrazioni citoplasmatiche e nucleari sono state analizzate mediante elettroforesi (Fig. 6 E). I nostri risultati Western blot hanno indicato che il rapporto YAP citoplasmatico / nucleare è aumentato da 0,62 ± 0,08 a P1 a 0,87 ± 0,24 a D2 (Fig. 6 SEPTIES). Questa quantificazione biochimica di YAP ha dimostrato una significativa esportazione nucleare YAP nel differenziare le cellule C2C12 e rafforzare i nostri risultati.
L’allungamento del mioblasto innesca l’esportazione nucleare YAP, che è essenziale per la differenziazione dei mioblasti in miotubi. (A) Immagini di epifluorescenza di cellule C2C12 coltivate su micropatterns FN di 1600 µm2 e immunostained per YAP. Le barre di scala sono 20 µm. (B) Rapporto citoplasmatico / nucleare YAP per le diverse morfologie del mioblasto (n = 10 per ciascuna). (C) Immagini di epifluorescenza di cellule C2C12 confluenti immunostenute per YAP al giorno 1 (P1, 24 h) dello stadio di proliferazione e al giorno 2 (D2, 96 h) e al giorno 9 (D9, 264 h) dello stadio di differenziazione. Le barre di scala sono 100 µm. (D) Rapporto citoplasmatico / nucleare YAP a P1 (n = 50), P2 (n = 30), D2 (n = 30) e D9 (n = 30). (E) Analisi Western blot dell’espressione YAP (65 kDa) nella proliferazione e differenziazione C2C12. (F) Razione YAP da citoplasmatica a nucleare (media ± S. D.) durante la proliferazione e la differenziazione (3 repliche per ogni condizione con 20.106 cellule/replicare). (G) Rapporto citoplasmatico / nucleare YAP a D2 e (H) indice di fusione per cellule trattate con controllo (CTRL) e leptomicina (LMB) a D4. **p <0.01, ****p< 0.0001 e n.s non significativo.
Sulla base di questi risultati, abbiamo valutato il ruolo di YAP utilizzando la leptomicina B per bloccare l’esportazione attiva dal nucleo legandosi direttamente a exportin141. In effetti, Alberto Elosegui-Artola e colleghi hanno dimostrato recentemente che la leptomicina B (LMB) può essere utilizzata in modo efficiente per studiare come le forze contrattili esercitate dal citoscheletro guidano la traslocazione nucleare YAP39. Trattando i mioblasti C2C12 a P2 (48 h) con LMB, abbiamo scoperto che il rapporto citoplasmatico / nucleare YAP era significativamente più basso nelle cellule trattate con LMB a D2 (96 h, Fig. 6G), suggerendo che YAP è principalmente concentrato all’interno del nucleo quando l’esportazione nucleare è inibita. Inoltre, i nostri risultati hanno indicato che l’indice di fusione a D4 delle cellule trattate con LMB (Fig. 6H) era molto bassa (3,8 ± 1.5%) rispetto alle celle di controllo (42,4 ± 9,1%), dimostrando che l’esportazione nucleare attiva è necessaria per la differenziazione C2C12.