batteri Solfato-riduttori in feci umane e la loro associazione con malattie infiammatorie intestinali

Abstract

Abbiamo cercato di batteri solfato-riduzione nelle feci di 41 soggetti sani e in 110 pazienti affetti da una patologia Epato-Gastroenterologia Unità utilizzando un liquido specifico medio (kit di Prova di Labège®, la Compagnie Française de Géothermie, Orléans, Francia). I 110 pazienti sono stati separati in 22 pazienti che presentavano malattie infiammatorie intestinali e 88 pazienti ospedalizzati per altre malattie del tratto digestivo inferiore (n=30) o superiore (n=58). I batteri solfato-riducenti sono stati isolati da 10 individui sani (24%), 15 pazienti che presentavano malattie infiammatorie intestinali (68%) e 33 pazienti con altri sintomi (37%). Una PCR multiplex è stata concepita per l’identificazione di Desulfovibrio piger (precedentemente Desulfomonas pigra), Desulfovibrio fairfieldensis e Desulfovibrio desulfuricans e applicata agli isolati di cui sopra. I ceppi di batteri solfato-riducenti consistevano in D. piger (39 isolati), D. fairfieldensis (19 isolati) e D. desulfuricans (un isolato). La prevalenza di D. piger è stata significativamente più elevata nei pazienti con malattia infiammatoria intestinale (55%) rispetto ai soggetti sani (12%) o ai pazienti con altri sintomi (25%) (P<0,05).

1 Introduzione

La malattia di Crohn (CD) e la colite ulcerosa (UC) sono malattie infiammatorie croniche intestinali (IBD) di eziologia sconosciuta, ma è probabile che si basino su fattori ambientali, genetici e immunitari . È stata proposta un’origine infettiva e molti microrganismi sono stati implicati in assenza di argomenti convincenti. Tuttavia, in entrambe le sindromi, l’infiammazione intestinale risponde all’antibiototerapia. Nei modelli animali di colite cronica, la flora luminal è un cofattore essenziale affinchè la malattia accada . Questo può spiegare il rinnovato interesse per il ruolo della flora intestinale come causa di questi disturbi .

I batteri che riducono il solfato (SRB) sono microrganismi anaerobici che conducono una riduzione dissimilatoria del solfato per ottenere energia, con conseguente rilascio di una grande quantità di solfuro. Sono comunemente isolati da fonti ambientali, ma sono presenti anche nel tratto digestivo degli animali e degli esseri umani. Come Desulfomonas pigra è stato riclassificato come Desulfovibrio piger comb. ov. , isolati umani di SRB consistono quasi esclusivamente di specie di Desulfovibrio . Recenti scoperte suggeriscono che SRB può avere un ruolo nelle malattie umane. Sono stati associati alla gravità clinica della parodontite umana e isolati da ascessi profondi (addominali o cerebrali), sangue o urina . In questi contesti, la maggior parte dei ceppi sono stati identificati come Desulfovibrio fairfieldensis , una nuova specie recentemente proposta, dal sequenziamento del gene RNA ribosomiale 16S (16S rDNA). Desulfovibrio desulfuricans, la specie tipo del genere Desulfovibrio, è stato anche isolato da esemplari umani . L’implicazione di SRB in IBD è stata suggerita come il loro prodotto finale metabolico, solfuro di idrogeno, è un composto citotossico . Questo composto può agire attraverso un’inibizione dell’ossidazione del butirrato, la principale fonte di energia per i colonociti. La compromissione delle funzioni dell’epitelio intestinale porterebbe alla morte cellulare e all’infiammazione cronica. Tuttavia, le specie di SRB associate a IBD non sono state ancora identificate. La loro identificazione consentirebbe di cercare fattori di virulenza e la loro suscettibilità agli agenti antimicrobici.

Nei laboratori medici, gli SRB sono raramente isolati da campioni umani a causa di una crescita lenta. Le colonie compaiono dopo più di 3 giorni di incubazione e non vengono notate, essendo invase dalla flora di accompagnamento, a meno che non siano la specie dominante o unica presente. Pertanto, la loro ricerca nelle feci è difficile a meno che non venga utilizzato un mezzo specifico. Tali mezzi di solito contengono un composto organico (donatore di elettroni e fonte di carbonio), solfato (accettore di elettroni), ferro e un agente riducente. La crescita di SRB in terreni di coltura specifici è facilmente rilevabile da un annerimento del mezzo dovuto alla produzione di idrogeno solforato (H2S) con conseguente formazione di un precipitato di solfuro ferroso. Una volta isolato da campioni clinici, l’identificazione a livello di specie può essere difficile. Ad esempio, non è possibile differenziare D. fairfieldensis e D. desulfuricans mediante test fenotipici. Pertanto, l’amplificazione genica è uno strumento prezioso per ottenere tale identificazione.

Lo scopo principale di questo studio era determinare quali specie di Desulfovibrio possono essere associate all’eventuale IBD. A tale scopo, un mezzo liquido specifico (Test-kit Labège®, Compagnie Française de Géothermie, Orléans, Francia) è stato utilizzato per la crescita del SRB dalle feci di individui sani e di pazienti ricoverati nell’Unità di Epato-Gastro-Enterologia del Centre Hospitalier et Universitaire de Nancy, Francia. È stata ideata una PCR multiplex per l’identificazione degli isolati a livello di specie.

2 Materiali e metodi

2.1 Pazienti

Feci di 41 individui sani (17 uomini e 24 donne; età media 38 anni, intervallo 1-101 anni) e 110 pazienti (67 uomini e 43 donne; età media 57 anni, intervallo 14-100 anni) dall’Unità di Epato-Gastro-Enterologia del Centre Hospitalier et Universitaire de Nancy, Francia, sono stati raccolti. Individui sani consultati consecutivamente per un controllo. Nessun microrganismo patogeno è stato trovato nelle loro feci. Individui e pazienti sani non hanno ricevuto alcuna somministrazione di antibiotici nel mese precedente l’ottenimento del campione. I pazienti sono stati separati in tre gruppi: la IBD (n=22) includeva 17 CD e cinque UC; altre malattie intestinali inferiori (n=30) includevano 23 pazienti che presentavano sintomi lievi o moderati come dolore addominale, problemi di transito intestinale e rettorragia e sette pazienti con cancro al colon; le malattie del tratto digestivo superiore (n=58) includevano calcoli biliari, cirrosi, carcinoma epato-cellulare, tumori gastrici e pancreatici. IBD sono stati diagnosticati su risultati clinici, endoscopici e istologici. La maggior parte dei pazienti con IBD presentava una malattia attiva (Tabella 1).

2.2 SRB detection and enumeration

Un grammo di feci è stato miscelato con 4 ml di tampone salina tampone fosfato e centrifugato (3000 rpm, 5 min). Un millilitro di surnatante è stato inoculato immediatamente in un mezzo liquido (Test-kit Labège®, Compagnie Française de Géothermie, Orléans, Francia) secondo le istruzioni del produttore. In breve, i Test-kit Labège ® sono costituiti da fiale contenenti 9 ml di un mezzo specifico (composti organici: lattato e acetato, agente riducente: citrato di titanio) condizionato anaerobicamente per il rilevamento SRB. Viene inoculato con una siringa attraverso un cappuccio di gomma. Questo mezzo limpido e incolore è stato originariamente ideato per la rilevazione di SRB da campioni ambientali. È stato confrontato con il terreno solido di Postgate comunemente usato E (composto organico: lattato, agenti riducenti: acido ascorbico e acido tioglicolico) , inoculato in parallelo sotto atmosfera anaerobica. Gli SRB sono stati enumerati utilizzando tubi lunghi e stretti riempiti con quest’ultimo mezzo e inoculati con diluizioni decimali delle feci. Tutti i mezzi inoculati sono stati incubati a 37°C per 2 mesi. La presenza di SRB è stata accertata dalla formazione di un precipitato nero (solfuro ferroso) nei mezzi liquidi e dalla comparsa di colonie nere nei mezzi solidi.

2.3 Progettazione di primer PCR

Le sequenze rDNA 16S di ceppi Desulfomonas e Desulfovibrio disponibili nel database GenBank sono state confrontate utilizzando il software Sequence Navigator, versione 1.0.1 (Applied Biosystems Inc., Foster City, CA, Stati Uniti d’America). Ha permesso di progettare sei primer per l’identificazione mediante PCR del SRB precedentemente isolato dall’uomo, relativo rispettivamente a D. piger (precedentemente Desulfomonas pigra) ATCC 29098T, D. desulfuricans Essex 6 ATCC 29577T, D. desulfuricans MB ATCC 27774 e D. fairfieldensis ATCC 700045. D. desulfuricans Essex 6 e D. desulfuricans MB sono stati differenziati in quanto le sequenze 16S rDNA di questi ceppi presentano una differenza del 3%. I primer sono stati 27K-F (5′-CTG CCT TTG ATA CTG CTT AG-3′), 27K-R (5′-GGG CAC CCT CTC GTT TCG GAG A-3′), nell’Essex, F (5′-CTA CGT TGT GCT AAT CAG CAG CGT AC-3′), Fiera-F (5′-TGA ATG AAC TTT TAG GGG AAA GAC-3′), Maiale-F (5′-CTA GGG TGT TCT AAT gatto GATTO CCT AC-3′), e P687-R (5′-GAT ATC TAC GGA TTT CAC TCC TAC ACC-3′) (Tabella 2). La specificità di questi primer è stata verificata su tutte le sequenze batteriche disponibili dal database GenBank utilizzando il programma Blast, versione 2.0 (National Center for Biotechnology Information, Bethesda, MD, USA).

2.4 SRB identification by multiplex PCR

Four collection strains (D. piger ATCC 29098T, D. desulfuricans Essex 6 ATCC 29577T, D. desulfuricans MB ATCC 27774, and D. fairfieldensis ATCC 700045) and 12 clinical strains (two strains related to D. desulfuricans Essex 6, due ceppi correlati a D. desulfuricans MB e otto ceppi identificati come D. fairfieldensis) sono stati utilizzati come controlli positivi. La sensibilità della PCR è stata valutata con diluizioni di sospensioni quantificate di ceppi batterici. La specificità della PCR è stata controllata con controlli negativi inclusi ceppi di tipo (Bilophila wadsworthia ATCC 49260T, Desulfovibrio gigas DSM 1382T, Desulfovibrio vulgaris DSM 644T) e ceppi clinici intestinali comuni appartenenti alle seguenti specie: Bacteroides fragile, Bacteroides merdae, Bacteroides thetaiotaomicron, Bacteroides uniforme, Bacteroides vulgatus, Campylobacter jejuni, Citrobacter freundii, Batteri innocui, Enterobacter impero romano, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Escherichia coli, Eubacterium piccolo, Eubacterium appiccicoso, Fusobacterium nucleatum, Copenaghen del canale, Klebsiella oxytoca, Klebsiella pneumoniae, il palermo ci morganii, Peptostreptococcus grande, Proteus meraviglioso, Proteus comune, Providencia stuartii, Pseudomonas aeruginosa, Serratia marcescens, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, e Streptococcus bovis.

Alla fine del tempo di incubazione, tutti i 151 Test-kit inoculati Labège® sono stati controllati utilizzando la PCR multiplex. Estratti di DNA sono stati ottenuti da 500 µl di terreno di coltura, dopo centrifugazione e risospensione in tampone TE (10 mM Tris–HCl, 1 mM EDTA, pH 8). In breve, le cellule sono state lisate utilizzando successivamente lisozima (3 mg ml−1), SDS (1%, p/v) e proteinasi K (0,25 mg ml−1). Dopo un’incubazione notturna a 37°C, il DNA è stato estratto con il metodo standard fenolo/cloroformio/alcool isoamilico. Ogni miscela PCR da 50 µl conteneva 5 µl di estratto di DNA (circa 50 ng di DNA) e quantità finali di 0,4 µM di ciascun primer, 0,8 mm di ciascun desossinucleoside trifosfato (Boehringer Mannheim Biochemicals, Mannheim, Germania), 0,4 mm di tampone Tris–HCl, 1,5 mm MgCl2 e 1,5 U di Taq DNA polimerasi (Gibco BRL Life Technologies, Paisley, UK). Tutte le reazioni sono state eseguite utilizzando il sistema GeneAmp PCR 2400 (Perkin-Elmer, Norwalk, CT, USA). Una fase iniziale di denaturazione di 94°C per 4 min è stata seguita da 30 cicli di denaturazione (94°C, 1 min), ricottura (55°C, 1 min) ed estensione (72°C, 2 min), e con un’estensione finale (72°C, 5 min). I controlli negativi (acqua invece dell’estratto di DNA) e positivi (estratto di DNA di D. fairfieldensis) sono stati inclusi in ogni esecuzione. I prodotti amplificati sono stati risolti mediante elettroforesi in gel di agarosio all ‘ 1,5% (p/v) contenenti bromuro di etidio (1,6 mg ml−1). Una scala del DNA di 100 bp è stata usata come indicatore di dimensione (Gibco BRL Life Technologies, Rockville, MD, USA). D. piger, D. desulfuricans Essex 6, D. desulfuricans MB e D. fairfieldensis sono stati identificati da una banda 255 -, 255 -, 396-e 534-bp, rispettivamente. D. piger e D. desulfuricans Essex 6 sono stati ulteriormente differenziati mediante saggi PCR separati utilizzando i rispettivi primer specifici. Per i campioni negativi, è stata eseguita l’amplificazione 16S rDNA utilizzando i primer di consenso 27f e 1525r per verificare l’assenza di inibizione delle PCR da parte dei contaminanti.

3 Risultati

3.1 Rilevazione ed enumerazione SRB

In individui sani e secondo i criteri di cui sopra, SRB sono stati trovati in 10 feci (24%) sia con il Test-kit Labège® che con il mezzo Postgate. Nei pazienti dell’unità di epato-Gastro-enterologia, SRB sono stati coltivati da 42 feci utilizzando il mezzo di Postgate. Tre ulteriori campioni sono risultati positivi con il Test-kit Labège®. Pertanto, tra i 110 pazienti studiati, gli SRB sono stati rilevati mediante coltura in 45 pazienti (41%). Tre ulteriori campioni hanno dato risultati equivoci con il Test-kit Labège® (presenza di un precipitato bruno scuro). I tempi medi di rilevamento della crescita di SRB sono stati 2 e 6 giorni utilizzando il Test-kit Labège® (intervallo 1-11 giorni) e il mezzo di Postgate (intervallo 3-39 giorni), rispettivamente. Il conteggio medio di SRB nelle feci di individui sani e pazienti era 105 g−1 (intervallo 102-109 g−1). Pertanto, la conta SRB non era correlata allo stato clinico dei pazienti.

3.2 SRB identificazione mediante PCR multiplex

La sensibilità del test PCR multiplex era di 100 batteri per ml. La sua specificità è stata accertata dall’assenza di reazioni incrociate tra le quattro genospecie differenziate. Ogni controllo positivo è stato trovato positivo solo con il corrispondente set di primer. Tutti i ceppi utilizzati come controlli negativi per verificare la specificità, compresi i ceppi di tipo D. gigas e D. vulgaris, hanno dato risultati negativi con i quattro set di primer. La specificità delle reazioni è stata ulteriormente confermata dal sequenziamento dei prodotti amplificati. Le sequenze ottenute corrispondevano sempre a quelle attese. Per i campioni SRB-negativi mediante PCR, l’amplificazione 16S rDNA ha permesso di scartare la possibilità di un’inibizione delle PCR da parte di contaminanti.