Attivazione delle cellule T, induce l’espressione di CD25 e Foxp3 associati con effettrici e fenotipo di memoria differenziazione
PBMC sono state stimolate con bryostatin-1 (5 nM) e ionomicina (1 µM) (B/I) in presenza di 80 U/mL di IL-2 (Peprotech) per 16 h. L’attivazione di B / I imita i segnali intracellulari che provocano l’attivazione delle cellule T aumentando rispettivamente l’attività della protein chinasi C e il calcio intracellulare . Le cellule sono state lavate tre volte e coltivate a 106 cellule / mL in mezzo completo con 40 U/mL IL-2 (Peprotech) per 3 giorni e l’espressione di Foxp3 è stata determinata utilizzando l’analisi della citometria a flusso. L’espressione di FoxP3 è stata determinata anche su cellule T appena isolate il giorno 0. Come mostrato in Fig. 1A (pannello superiore), la presenza di IL-2 da solo per 3 giorni non ha aumentato marcatamente l’espressione di Foxp3 o CD25 sopra i livelli basali il giorno 0 (Fig. 1C). L’attivazione B / I, tuttavia, ha indotto l’espressione Foxp3 e CD25 nelle cellule T CD4+ e CD8+ (Fig. 1A, pannello centrale). All’attivazione di B/I, le cellule T CD4+CD25+Foxp3+ sono state aumentate dall ‘ 1% al 23% (P = 0,016) e le cellule T CD8+CD25+Foxp3+ sono state aumentate dallo 0,6% al 9% (P = 0,013). L’estensione della coltura in presenza di IL-2 per 6 giorni senza ulteriore stimolazione ha mantenuto le cellule T CD4+CD25+Foxp3+ al di sopra dei livelli basali nelle cellule T non attivate (1% vs. 7%; P = 0,031) mentre le cellule T CD8+CD25+Foxp3+ sono scese ai livelli basali (0,6%). Questi risultati suggeriscono che l’espressione indotta dall’attivazione di Foxp3 nelle cellule T CD4+CD25 + è più stabile di quella nelle cellule T CD8+CD25+. Numero assoluto di cellule T aumentato 3 e 6 giorni dopo la stimolazione B / I e l’espansione in presenza di IL-2 (Fig. 1 TER). L’attivazione delle cellule T mediante Abs anti-CD3 / CD28 per 3 giorni ha prodotto risultati simili a quelli dell’attivazione B/I aumentando le cellule T CD4+CD25+FoxP3+ dallo 0,4% all ‘ 8,7% (Fig. 1C). Le analisi del fenotipo delle cellule T hanno rivelato fenotipi di memoria CD44 + effector e CD44 + CD62L + prima e 6 giorni dopo l’attivazione di B / I (Fig. 1D, pannello superiore). Mentre le cellule T dell’effettore CD4 + e CD8 + sono state ridotte dopo l’attivazione (rispettivamente dal 18% al 9% e dal 21% al 13%), le cellule T della memoria CD4+ e CD8+ sono state aumentate (rispettivamente dall ‘82% al 91% e dal 79% all’ 87%). All’attivazione di B / I, le cellule T CD4 + hanno mostrato un aumento di 6 volte dell’espressione di FoxP3 nei fenotipi CD44+, CD62L+ (CD44+: dal 2,6% al 15%; CD62L+: dal 2% al 12%). Inoltre, sia le cellule T CD4+ che CD8 + hanno mostrato un’espressione FoxP3high dopo l’attivazione rispetto all’espressione FoxP3low il giorno 0 (Fig. 1D, pannelli centrali e inferiori). Tutte le cellule T CD4 + Foxp3 + hanno espresso CD44 tra cui l ‘ 80% ha espresso anche CD62L (Fig. 1D, pannello centrale, estrema destra). Questi dati mostrano che il 20% delle cellule T CD4+Foxp3+ sono effettori e l ‘ 80% sono fenotipi di memoria. Una tendenza fenotipica simile è stata rilevata per le cellule T CD8+Foxp3+, mostrando 100% CD44 + di cui 67% erano cellule T CD62L + (Fig. 1D, pannello inferiore, estrema destra). Questi risultati mostrano che il 33% delle cellule T CD8+Foxp3+ sono effettori e il 67% sono fenotipi di memoria. Dati presentati in Figg. 1A-D suggeriscono che l’aumento dell’espressione di FoxP3high nelle cellule T effettrici era dovuto alla differenziazione cellulare piuttosto che alla proliferazione cellulare, perché la percentuale relativa delle cellule T effettrici CD44+CD62L diminuiva dopo l’attivazione di B/I. Meccanismo simile può esistere nelle cellule T di memoria a causa dell’espressione di FoxP3high dopo l’attivazione rispetto a FoxP3low il giorno 0.
Espressione Foxp3 dopo l’attivazione della cella T. Le cellule T sono state isolate da volontari sani e suddivise in due gruppi. Il gruppo di controllo è rimasto non attivato e coltivato in presenza di IL-2 per 3 giorni (A; pannello superiore) e un altro gruppo è stato attivato con B/I per 16 h e coltivato in presenza di IL-2 per 3 giorni (A; pannello centrale) o 6 giorni (A; pannello inferiore). Il numero assoluto di cellule T CD4+ e CD8+ su campioni aggregati è stato determinato nei giorni 0, 3 e 6 post-coltura mediante analisi di citometria a flusso (B). L’espressione di FoxP3 e CD25 è stata determinata in cellule T CD4 + appena isolate (giorno 0) e dopo una stimolazione di 3 giorni con Abs anti-CD3/CD28 (C). Le cellule T appena isolate e attivate da B/I sono state sottoposte a citometria a flusso per determinare i fenotipi delle cellule T (D; pannello superiore); Le cellule T effettore e di memoria Foxp3+ sono state determinate in cellule CD4+Foxp3+ gated o cellule CD8+Foxp3+ gated (D; pannello inferiore). I dati rappresentativi sono mostrati da due donatori in esperimenti duplicati.
Attivazione indotta da espressione di FoxP3 nelle cellule T CD4+ non riesce a trasmettere funzione di regolamentazione in vitro
le cellule T sono state etichettate con CFSE e stimolato con anti-CD3 (1 µg/ml) e anti-CD28 (1 µg/ml) Abs, in presenza o assenza dei B/I-attivato CD4+CD25+FoxP3+ cellule T (2:1 e 20:1 risponditore:soppressore rapporti) per 3 giorni. L’analisi della citometria a flusso ha mostrato tassi simili di proliferazione delle cellule T CD8+ gated in assenza o presenza di cellule T inducibili FoxP3 + (Fig. 2A, 60% contro 61% e 65%). L’attivazione CD3/CD28 ha anche indotto l’espressione FoxP3 nelle cellule T CD4 + responder. Le cellule T CD4+FpxP3+ gated hanno anche mostrato una proliferazione del 70-75% all’attivazione (Fig. 2 BIS). L’analisi dell’apoptosi delle cellule T ha rivelato tassi simili di apoptosi nelle cellule T responder in assenza o presenza di cellule T CD4+FoxP3 +(Fig. 2B, 57% contro 57 e 59%). La maggior parte delle cellule T CD4+FoxP3+ attivate da B/I (74-76%) è risultata apoptotica durante l’attivazione anti-CD3/CD28 in co-coltura con cellule T responder.
Proliferazione delle cellule T in presenza di cellule T inducibili CD4+FoxP3+. Per eseguire un test di soppressione della co-coltura, le cellule T responder sono state etichettate con CFSE e coltivate in assenza o presenza di diversi rapporti di cellule T inducibili FoxP3+ (20:1 e 2:1) per 3 giorni in presenza di Abs anti-CD3/CD28. Le cellule T CD8+ gated hanno mostrato una diluizione CFSE (A, pannello sinistro). Le cellule T CD4+ Responder che hanno espresso FoxP3 a causa di un’attivazione di 3 giorni sono state anche gated e analizzate per la diluizione CFSE (A, pannello destro). Le cellule ottenute da un test di soppressione della co-coltura (A, pannello sinistro) sono state anche colorate per l’Annexin V al fine di determinare l’apoptosi nelle cellule T CD8+ responder (B, pannello sinistro) e nelle cellule T CD4+FoxP3+ attivate da B/I (B, pannello destro).
il trapianto Allogenico di attivazione delle cellule T durante MLR induce l’espressione di Foxp3 nelle cellule CD4+CD25+ cellule T associato con effettrici/fenotipo di memoria
Abbiamo eseguito 8 giorni di allogenico MLR per determinare se l’induzione dell’espressione di Foxp3 nelle cellule T è rimasto stabile durante MLR e se ad un indotto di Foxp3+ espressione potrebbe inibire la proliferazione delle cellule T. Le cellule responder e stimulator sono state ottenute da diversi donatori sani. Le cellule stimolatrici sono state irradiate (5000 rad) e coltivate con cellule responder per 8 giorni in presenza di 10 µM BrdU (BD Pharmingen). Le cellule sono state poi colorate con Abs rilevanti e sottoposte ad analisi di citometria a flusso. Come mostrato in Fig. 3A (pannello superiore) l ‘ 86% delle cellule T CD4+CD25+ e il 93% delle cellule T CD8+CD25+ hanno mostrato l’incorporazione di BrdU come risultato della proliferazione cellulare. Nessuna proliferazione è stata rilevata solo nelle cellule responder o stimolatore (dati non mostrati). Tale proliferazione allogenica ha avuto luogo in presenza di un’espressione Foxp3 indotta dall’attivazione nelle cellule T CD4 + tale che l ‘ 8% delle cellule T CD4+ erano CD25+Foxp3+ (Fig. 3A, pannello inferiore). Le cellule T CD8+CD25+, d’altra parte, non hanno mostrato un’espressione stabile di Foxp3. Questi risultati sono coerenti con la nostra osservazione in Fig. 1 mostrando che l’espressione di Foxp3 nelle cellule T CD4 + è più stabile di quella nelle cellule T CD8+ 6-8 giorni dopo l’attivazione delle cellule T. Nelle relazioni precedenti, i saggi soppressivi in vitro sono stati condotti in presenza di alti rapporti delle cellule T CD4+CD25+ (Tregs) alle cellule responder, per determinare la funzione soppressiva sull’attivazione e sulla proliferazione delle cellule T. Tali aumenti artificiali nel rapporto tra cellule T CD4 + CD25 + e cellule responder ridurrebbero la validità in vivo dell’osservazione. La frequenza di cellule T CD4+CD25+Foxp3+ indotte durante la MLR è stata dell ‘ 8%, che è considerata all’interno dell’intervallo fisiologicamente rilevante riportato da altri gruppi . La frequenza dei Treg naturali nel topo è anche intorno a questo intervallo, ma ha effetti regolatori per l’inibizione dell’autoimmunità. Se Foxp3 esprimendo cellule T CD4 + aveva alcuna funzione regolatrice, avrebbe dovuto inibire la proliferazione cellulare durante la coltura in vitro. Simile all’attivazione delle cellule T indotta da B / I, i fenotipi delle cellule T in un MLR includevano l’effettore CD44 + (16%) e le cellule T di memoria CD44+CD62L+ (84%) (Fig. 3 TER). Anche in questo caso, tutte le cellule T CD4+Foxp3 + espresso CD44 tra cui 90% espresso anche CD62L (Fig. 2 TER). Questi dati mostrano che il 10% delle cellule T CD4+Foxp3+ sono effettori e il 90% sono fenotipi di memoria. Una tendenza fenotipica simile è stata rilevata per le cellule T CD8+Foxp3+, mostrando 100% CD44+ di cui 76% erano cellule T CD62L+. Questi risultati mostrano che il 24% delle cellule T CD8+Foxp3+ sono effettori e il 76% sono fenotipi di memoria. La mancanza di funzione regolatrice in queste cellule T Foxp3+ può essere dovuta al loro fenotipo effettore/memoria poiché è stato riportato che l’espressione di Foxp3 nelle cellule T della memoria umana ha provocato una diminuzione dell’attività soppressore . Inoltre, le celle Treg tipo 1 (Tr1) conferiscono la funzione soppressore in assenza di espressione FoxP3 . Dato il ruolo di Foxp3 come regolatore principale dell’impegno e della manutenzione del lignaggio Treg nel topo, non sembra avere una tale funzione normativa in buona fede per l’impegno del lignaggio Treg nelle cellule T umane.
Espressione Foxp3 seguente MLR allogenico. Le cellule sono state analizzate mediante citometria a flusso dopo un MLR di 8 giorni. L’incorporazione di BrdU è stata determinata su celle T CD4+CD25+ o CD8+CD25+ (A; pannello superiore). Le cellule T CD4+ o CD8+ gated sono state analizzate per il rilevamento di cellule CD25+Foxp3+ (A; pannello inferiore). Le cellule T CD4+ gated (B; pannello superiore) o le cellule T CD8+ (B; pannello inferiore) sono state analizzate per l’espressione di CD44, CD62L, Foxp3. Le cellule T CD44+ e CD62L + sono state determinate mediante gating su cellule T CD4+Foxp3+ o CD8+Foxp3+. I dati rappresentativi sono mostrati da due donatori in esperimenti duplicati.