Diversi gruppi motif specificano le attività non ridondanti di legame al DNA dei membri della famiglia AP-1 nei macrofagi

Analisi statistiche

In Fig. 1c, le differenze nell’espressione genica sono state testate utilizzando il test T indipendente (grado di libertà = 1, a due code) su due esperimenti replicati (n = 2). Geni differenzialmente espressi in Fig. 1b sono stati identificati utilizzando EdgeR55 con parametri predefiniti e utilizzando i cut off FDR < 0.05 e log2 fold change ≥2. In Fig. 2c, le differenze tra ciascun gruppo (Veh, Condiviso e KLA 1 h) sono state esaminate utilizzando il test T indipendente (grado di libertà = 1, a due code); il numero di loci in ciascun gruppo per ciascun monomero è il seguente ATF3 (Veh = 1447, Condiviso = 7460, KLA = 6997), Jun (2390, 3751, 3401), JunD (1351, 5976, 6422). Significato per motivi in Fig. 4a è stato calcolato utilizzando il test del rapporto di verosimiglianza (grado di libertà = 1) confrontando le previsioni fatte dal modello TBA completo e dal modello TBA perturbato a tutti i loci legati nei macrofagi trattati con Veh per Atf3 (n = 23.160), Jun (n = 15.548) e JunD (n = 19.653). Significato per motivi in Fig supplementare. 4C è stato calcolato utilizzando il test del rapporto di verosimiglianza (grado di libertà = 1) confrontando le previsioni fatte dal modello TBA completo e dal modello TBA perturbato in tutti i loci legati da JunD in GM12878 (n = 7451), H1-hESC (n = 12.931), HepG2 (n = 41.318), K562 (n = 47.477) e SK-N-SH (38.960). Significato per motivi in Fig. 5b, Fig. supplementare 5B, e Fig.supplementare. 5C è stato calcolato utilizzando il test del rapporto di verosimiglianza (grado di libertà = 1) confrontando le previsioni fatte dal modello TBA completo e dal modello TBA perturbato a tutti i loci legati nei macrofagi trattati con UCK per Atf3 (n = 36.745), Jun (n = 17.481), JunD (n = 31.641), Fos (n = 24.365), Fosl2 (n = 10.619) e JunB (n = 13.376). Valori di significatività per Fig. 6f e S6F sono stati calcolati utilizzando il test F; il numero di loci analizzati per i monomeri nei macrofagi trattati con veicoli è ATF3 (n = 4163), Jun (n = 3004) e JunD (n = 4148); il numero di loci analizzati per i monomeri nei macrofagi trattati con KLA è: Atf3 (n = 4577), Jun (n = 3232), JunD (n = 4366), Fos (n = 4477) e JunB (n = 3616).

Generazione genoma personalizzato per BALB/cJ

Un genoma personalizzato per BALB / cJ sostituendo le posizioni invarianti del genoma mm10 con alleli riportati dal Mouse Genomes Project (versione 3 file VCF)43. Per C57BL / 6J è stato utilizzato il genoma di riferimento mm10 dal browser UCSC genome. Per consentire confronti tra BALB / cJ e C57BL/6J durante l’analisi, le coordinate per il genoma personalizzato per BALB/cJ sono state spostate in modo da corrispondere alle posizioni del genoma di riferimento mm10 utilizzando MARGE34. Non abbiamo analizzato alcuna lettura che rientrasse nelle eliminazioni in BALB / cJ. Legge che sovrapposti con un inserimento sono stati assegnati all’ultima posizione di sovrapposizione nel ceppo di riferimento.

Analisi dei picchi di chip-seq

Le letture di sequenziamento da esperimenti di ChIP-seq sono state mappate all’assemblaggio mm10 del genoma di riferimento del mouse (o del genoma personalizzato BALBc / J) utilizzando l’ultima versione di Bowtie2 con parametri di default56. Mappato ChIP-seq legge per identificare putative TF binding siti con HOMER57 findPeaks comando (con parametri-size 200-L 0-C 0-fdr 0.9), utilizzando il chip di ingresso esperimento corrispondente alla condizione di trattamento. Al fine di ridurre il numero di picchi falsi positivi, abbiamo calcolato l’IDR ad ogni picco (utilizzando la versione 2.0.3 del programma idr) con il punteggio di picco HOMER calcolato per ogni esperimento di replica come input per IDR e quindi filtrato tutti i picchi che avevano IDR ≥ 0.0558. I motivi De novo sono stati calcolati con l’OMERO findMotifsGenome.pl comando con parametri predefiniti. L’arricchimento dei motivi de novo è stato calcolato utilizzando findKnownMotifs.pl programma in HOMER con parametri predefiniti.

La quantificazione delle letture di espressione dell’RNA generate da esperimenti di RNA-seq è stata allineata al genoma di riferimento del topo mm10 (o al genoma personalizzato BALBc / J) utilizzando STAR aligner con parametri di default59. Per quantificare il livello di espressione di ciascun gene, abbiamo calcolato l’RPKM con le letture che erano all’interno di un esone. Le letture di sequenziamento non normalizzate sono state utilizzate per identificare i geni espressi in modo differenziale con EdgeR55; abbiamo considerato i geni con FDR < 0.05 e un cambiamento nell’espressione tra due condizioni sperimentali due volte o più espresse in modo differenziale. Per quantificare l’espressione di RNA nascenti abbiamo annotato i nostri picchi di CHIP-seq con il numero di letture GRO-seq (normalizzate a 10 milioni) che si trovavano entro 500 bps dal centro di picco usando l’HOMER annotatePeaks.pl comando.

TBA model training

Per ogni monomero AP-1 in ogni condizione di trattamento, abbiamo addestrato un modello per distinguere i siti di legame per ogni monomero da un insieme di loci genomici selezionati in modo casuale. L’insieme di loci di sfondo casuali utilizzati per addestrare ciascun modello è stato selezionato in base ai seguenti criteri: (1) la distribuzione del contenuto GC del loci di sfondo corrisponde al contenuto GC dei siti di legame per un dato monomero, (2) non contiene posizioni ambigue o non applicabili e (3) il numero di sequenze di sfondo corrisponde al numero di siti di legame k. Per ciascuna delle sequenze nell’insieme combinato dei siti di rilegatura e dei loci di sfondo, abbiamo calcolato il punteggio di log-odds più alto (noto anche come punteggio motif) per ciascuno degli n motivi che saranno inclusi nelle corrispondenze model60 Motif in entrambi gli orientamenti sono stati considerati. Log – odds punteggi inferiori a 0 sono stati impostati su 0. Per le procedure standard di pre-elaborazione prima di addestrare un modello lineare, abbiamo standardizzato i punteggi log-odds per ogni motivo, ridimensionando l’insieme di punteggi per ogni motivo in modo che il valore medio sia 0 e la varianza sia 1. La standardizzazione scala i punteggi per tutti i motivi allo stesso intervallo (i motivi più lunghi hanno un punteggio massimo maggiore) e aiuta anche a ridurre l’effetto della multi-collinearità sull’allenamento del modello. E così, le caratteristiche utilizzate per la formazione il nostro modello è una matrice n da 2k di log-odds punteggi standardizzati su ogni riga. Per generare la corrispondente matrice di etichette, abbiamo assegnato a ciascun sito di rilegatura un’etichetta di 1 e ad ogni loci di sfondo un’etichetta di 0. Utilizzando questa matrice di funzionalità e l’array di etichette, abbiamo addestrato i pesi per ciascun motivo utilizzando un modello di regressione logistica penalizzato L1 come implementato dal pacchetto scikit-learn Python 61. I pesi Motif mostrati nella nostra analisi sono i valori medi in cinque round di convalida incrociata, utilizzando l ‘ 80% dei dati per l’allenamento e il 20% per i test in ogni round. I modelli sono stati addestrati per CHIP-seqs generati in questo studio così come i dati scaricati dal NCBI Gene Expression Omnibus (accession number GSE46494) e il ENCODE data portal (https://www.encodeproject.org).

Quantificazione della collinearità multipla

Per valutare l’entità della multi-collinearità nelle caratteristiche del motif score che abbiamo usato per addestrare i nostri modelli, abbiamo preso ogni matrice di feature corrispondente a ciascun esperimento e calcolato il VIF per ogni motif38. Per calcolare il VIF, per prima cosa determiniamo il coefficiente di determinazione, R2, per ogni motivo facendo regredire i punteggi log-odds per un motivo rispetto ai punteggi log-odds dei motivi rimanenti. Successivamente, utilizzando il coefficiente di determinazione, la tolleranza per ciascun motivo può essere calcolata come la differenza tra 1 e il coefficiente di determinazione (1-R2). Il VIF è il reciproco della tolleranza \(\frac{1} {{1 – R^2}}\). Abbiamo usato il modulo linear_model del pacchetto sklearn Python per calcolare il coefficiente di determinazione.

Motif clustering and merging

Abbiamo ottenuto la somiglianza di tutte le coppie di motivi di sequenza del DNA calcolando la correlazione di Pearson delle matrici di probabilità di posizione allineate (PPMS) corrispondenti a una data coppia di motifs62. La correlazione di Pearson per un paio di motivi A e B di lunghezza mi è calcolato mediante la formula:

Ppm prima erano allineate utilizzando Smith–Waterman allineamento algorithm63. I motivi più corti sono imbottiti con valori di frequenza di sfondo prima dell’allineamento. Le lacune nell’allineamento non sono state consentite e ogni posizione nell’allineamento è stata valutata con la correlazione di Pearson. La correlazione di Pearson è stata quindi calcolata utilizzando l’allineamento ottimale. Successivamente, set di motivi che hanno PPMS con una correlazione Pearson di 0,9 o superiore sono stati uniti allineando iterativamente ogni PPM all’interno dell’insieme e quindi calcolando la media delle frequenze nucleotidiche in ogni posizione.

Valutazione del significato dei motivi per TBA

i valori p per TBA sono stati calcolati utilizzando il test log-likelihood ratio. Ogni motivo è stato rimosso dall’insieme di funzionalità utilizzate per addestrare un modello TBA perturbato (utilizzando la convalida incrociata di cinque volte). Abbiamo quindi utilizzato il modello completo (contenente tutti i motivi) e il modello perturbato per calcolare la probabilità di osservare il legame su tutti i siti di legame e le sequenze di sfondo per un dato monomero e tutte le regioni di sfondo. La differenza tra le probabilità calcolate dal modello completo e dal modello perturbato è stata quindi utilizzata per eseguire il test del chi quadrato per ciascun motivo. Il test chi-quadrato è stato eseguito utilizzando il pacchetto scipy python 64.

Confronto con altri metodi

BaMM motif e gkm-SVM erano entrambi eseguiti con parametri predefiniti. Abbiamo usato l’ultima versione del gkm-SVM su larga scala, LS-GKM (compilato dal codice sorgente scaricato da https://github.com/Dongwon-Lee/lsgkm il 25/8/16) e BAMM motif; v1.0 scaricato da https://github.com/soedinglab/BaMMmotif39, 65. Entrambi i modelli sono stati addestrati utilizzando cinque volte cross-validation. Le prestazioni del modello sono state valutate utilizzando le funzioni roc_auc_score e precision_score del modulo metrics di sklearn.

Prevedere i cambiamenti nel legame AP-1 dopo un trattamento con UCK di un’ora

Per prevedere il cambiamento nel legame dopo il trattamento con UCK, abbiamo sfruttato i pesi del motivo appresi per ciascuno dei motivi n (wn) da un modello TBA addestrato sui dati trattati con veicoli (Wveh = ) e un modello TBA addestrato sui dati trattati con UCK 1-h (Wkla = ) per ogni monomero AP-1. Il cambiamento previsto nell’associazione per ogni sequenza è quindi la differenza tra il prodotto del punto dei punteggi del motivo standardizzati calcolati per la sequenza di ciascuno dei siti di legame k (Sk = ) con i pesi del motivo KLA e il prodotto del punto dei punteggi del motivo e dei pesi del motivo Veh (Δkla−veh,k = Wkla Sk Sk − Wveh Sk Sk). Sono state fatte previsioni per tutti i loci genomici che si intersecavano con un picco per uno dei monomeri AP-1 nella condizione di trattamento del veicolo o dell’UCK.

Previsione del legame strain-specific con TBA

Per prevedere il legame strain-specific, abbiamo sfruttato i pesi motif appresi per ciascuno dei motivi n (wn) da un modello TBA (W = ) per ogni monomero AP-1 usando i dati C57BL/6J e i punteggi motif calcolati per ciascuno dei siti di legame k usando la sequenza genomica per C57BL/6J e BALBc / J (SC57, k=, SBAL , k = ). Successivamente, abbiamo calcolato la differenza dei punteggi del motivo per C57BL6/J e BALBc/J (Dn = ) e quindi abbiamo standardizzato le differenze di punteggio per ciascun motivo in tutti i siti di legame k che avevano una mutazione quando si confrontava BALBc/J con C57BL/6J, ottenendo differenze di punteggio del motivo standardizzate per ciascun sito di legame (Zn = standardize(Dn) = ). Infine, abbiamo quindi fatto una previsione per il legame specifico dello sforzo calcolando il prodotto dot dei pesi del motivo e la differenza standardizzata dei punteggi del motivo tra C57BL6/EiJ e BALBc/J per il sito di legame mutato kth (ΔC57−BAL = W⋅).

TBA-2Strain model training

Per ogni loci genomico che si intersecava con un picco per uno dei monomeri AP-1, in C57BL/6J o BALBc / J, abbiamo calcolato il punteggio log-odds più alto per ciascuno dei motivi n che saranno inclusi nel modello, usando la sequenza genomica di entrambi i ceppi, ottenendo due serie di punteggi motif per ciascuno dei siti di legame k (SC57,k = , SBAL,k = ). Sono state prese in considerazione le corrispondenze del motivo in entrambi gli orientamenti. Log – odds punteggi inferiori a 0 sono stati impostati su 0. Utilizzando i punteggi del motivo, calcoliamo la differenza standardizzata dei punteggi del motivo tra i due ceppi come descritto nella sezione precedente (Zn = ). E così, le caratteristiche utilizzate per la formazione il nostro modello è una matrice n per k di log-odds punteggi standardizzati su ogni riga. Successivamente, abbiamo calcolato il rapporto log2 fold del numero di letture di CHIP-seq in C57BL / 6J rispetto a BALBc / J per rappresentare l’entità del legame specifico dello sforzo. Usando questa matrice di funzionalità e impostando il rapporto log2 fold del legame tra i due ceppi come variabile dipendente, abbiamo addestrato i pesi per ogni motivo usando la regressione lineare implementata dal pacchetto scikit-learn Python. I pesi Motif mostrati nella nostra analisi sono i valori medi in cinque round di convalida incrociata, utilizzando l ‘ 80% dei dati per l’allenamento e il 20% per i test in ogni round. Le previsioni per il legame specifico dello sforzo possono essere fatte usando i pesi calcolati seguendo la procedura nella sezione precedente.

Protocollo chip

Proteine A e G Dynabeads 50/50 mix di Invitrogen sono citati per ChIP (10001D, 10003D). La miscela del IP consiste delle perle 20 µL/anticorpo 2 µg per 2 milione chip delle cellule. Gli anticorpi contro i membri della famiglia AP-1 sono stati scelti per il targeting delle regioni non conservate per ridurre al minimo il potenziale di legame non specifico. Gli anticorpi sono elencati nella Tabella supplementare 3. Per la preparazione, le perline sono state lavate con 2× 0,5% BSA–PBS, quindi le perline–anticorpo sono state incubate con 0,5% BSA-PBS per almeno 1 h su rotatore (4 °C). Lavare 2× con 0.5% di BSA–PBS, quindi risospeso in tampone di diluizione (1% Triton, 2 mm EDTA, 150 mM NaCl, 20 mM Tris–HCl (pH 7,4), 1 × inibitori della proteasi). Doppia reticolazione per ChIP: Media è stato decantato dalle cellule in piastre di 10 cm, lavare una volta brevemente con PBS (RT). Disuccinimidil glutarato (Pierce Cat # 20593) (diluito in DMSO a 200 mM)/PBS (RT) è stato usato per 10 min. Quindi la formaldeide è stata aggiunta ad una concentrazione finale dell ‘ 1% per altri 10 min. La reazione è stata spenta con 1: 10 1 M Tris pH 7.4 su ghiaccio. Le cellule sono state raccolte e lavate due volte con PBS freddo, ruotando a 1000 × g per 5 min. Isolamento e sonicazione dei nuclei: Risospendere i pellet cellulari in 1 mL di tampone di isolamento dei nuclei (50 mM Tris–pH 8.0, 60 mM KCl, 0.5% NP40) + PI e incubare su ghiaccio per 10 min. Centrifugare 2000 × g per 3 min a 4 °C. Risospendere i nuclei in 200 µL di tampone di lisi fresco (0,5% SDS, 10 mM EDTA, 0,5 mM EGTA, 50 mM Tris–HCl (pH 8)) + PI. Sonicazione: I nuclei sono stati quindi sonicati (10 milioni di cellule) per 25 min in un Biorupter (impostazioni = 30 s = On, 30 s = Off, Medium) utilizzando tubi a parete sottile (Diagenode Cat# C30010010). Dopo la sonicazione spin velocità massima per 10 min a 4 °C. ChIP set up: Il DNA sonicato è stato diluito 5× con un tampone di diluizione 800 (1% Triton, 2 mM EDTA, 150 mM NaCl, 20 mM Tris–HCl (pH 7,4), 1× inibitori della proteasi). Viene rimossa un’aliquota per i campioni di input (5%). Campioni su a 4 °C durante la rotazione. Lavaggio: Chip vengono lavati 1× con TSE I (20 mM Tris–HCl pH 7.4, 150 mm NaCl, 0.1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA), 2× con TSE III (10 mM Tris–HCl pH 7.4, 250 mm LiCl, 1% IGEPAL, 1% deossicolato, 1 mM EDTA), 1× con TE + 0.1% Triton X-100, trasferire al nuovo tubo e poi lavare tempo con TE + 0,1% Triton X-100. Eluizione: Eluto con tampone di eluizione da 200 µL (1% SDS, 10 mM Tris pH 7,5) per 20 min a RT, agitando sul vortice o su un nutatore o rotatore. Reticolazione: aggiungere 10 µL di NaCl da 5 M e incubare a 65 ° C (o almeno 8 h). Pulire i campioni utilizzando Zymo ChIP DNA Clean e Concentratore. Eluto in 100 µL. Prendere 40 µL e procedere al protocollo di preparazione della libreria.

Isolamento e frammentazione dell’RNA di PolyA

Isolamento dell’RNA: l’RNA è stato isolato utilizzando il reagente TRIZOLO (Ambion cat# 15596018) e il kit di preparazione mini-RNA DIRECT-ZOL (cat# 11-330MB). Poli-A RNA isolamento: Utilizzare 0.2 RNA totale come materiale di partenza per un’efficienza di mappatura ideale e una clonalità minima. Raccogliere 10 µL di oligo (dT) (NEB cat# S1419S) perline per campione di RNA. Le perle sono state lavate due volte con 1× DTBB (20 mM Tris–HCl pH 7,5, 1 M LiCl, 2 mM EDTA, 1% LDS, 0,1% Triton X-100). Le perle sono state risospese in 50 µL di 2× DTBB. 50 µL di perline sono stati mescolati con 50 µL di RNA e riscaldati a 65 °C per 2 min. RNA-perline sono stati poi incubati per 10 min a RT durante la rotazione. Le perle di RNA sono state quindi raccolte su un magnete e lavate 1× ciascuna con RNA WB1 (10 mM Tris–HCl pH 7,5, 0,12 M LiCl, 1 mM EDTA, 0,1% LDS, 0.1% Triton X-100) e WB3 (10 mM Tris–HCl pH 7,5, 0,5 M LiCl, 1 mM EDTA). Aggiungere 50 µL di Tris-HCl pH 7,5 e riscaldare a 80 ° C per 2 minuti per eluire. Raccogliere RNA ed eseguire una seconda raccolta di perline Oligo-dT. Dopo aver lavato la seconda raccolta, invece di eluire era 1× con 1× primo tampone filo; 250 mM Tris-HCl (pH 8.3), 375 mm KCl, 15 mm MgCl2 (ThermoFisher SSIII kit Cat# 18080093). Frammentazione: quindi aggiungere 10 µL di tampone 2× first strand più 10 mM DTT e frammentare il DNA a 94 °C per 9 min. Raccogliere perline sul magnete e trasferire eluato contenente mRNA frammentato ad una nuova striscia PCR. Dovrebbe recuperare 10 µL di RNA frammentato. Primo strand sintesi: Abbiamo mescolato RNA frammentato con 0.5 µL random primer (3 µg/µL) Life Tech #48190-011, 0.5 µL oligo-dT (50 µM da SSIII kit), 1 µL dNTPs (10 mM Life Tech, cat 18427088) e 0.5 µL SUPERase-In (ThermoFisher Cat # AM2696) e calore 50 °C per 1 min. Immediatamente posto sul ghiaccio. Abbiamo quindi aggiunto 5,8 µL ddH2O, 0,1 µL di actinomicina (2 µg/µL Sigma cat # A1410), 1 µL DTT (100 mm Life Tech cat# P2325), 0,2 µL di 1% Tween e 0,5 µL di Apice III e incubare 25 °C per 10 min, quindi 50 °C per 50 min. Perlina pulire: Abbiamo aggiunto 36 µL di RNAClean XP (Ampure XP) e mescolato, incubando per 15 min su ghiaccio. Le perle sono state quindi raccolte su un magnete e lavate 2× con etanolo al 75%. Le perle sono state quindi essiccate all’aria per 10 min ed elute con 10 µL di H2O privo di nucleasi. Sintesi del secondo filo. 10 µL di cDNA/RNA è stato mescolato con 1,5 µL 10× Blu Buffer (Enzimatici cat# B0110L), 1 µL di dUTP/dNTP mix (10 mM Affymetrix cat# 77330), 0,1 µL dUTP (100 mM Affymetrix cat# 77206), 0,2 µL di Rnasi H (5 U/µL Enzimatici cat# Y9220L), 1 µL di DNA polimerasi I (10 U/µL Enzimatici cat#P7050L), 0,15 µL 1% Tween-20 e 1.05 µL di acqua priva di nucleasi. La reazione è stata incubata a 16 ° C per 2,5 h. Pulizia del tallone: il DNA è stato purificato aggiungendo 1 µL di Seradyn 3 EDAC SpeedBeads (Thermo 6515-2105-050250) per reazione in 28 µL 20% PEG8000/2,5 M NaCl (concentrazione finale del 13%) e incubando a RT per 10 min. Le perle sono state quindi raccolte su un magnete e lavate 2× con 80% di etanolo. Le perle sono state essiccate all’aria per 10 min ed elutizzate in 40 µL di acqua priva di nucleasi. Il DNA è pronto per la preparazione della biblioteca.

Library prep protocol

dsDNA end repair: Abbiamo mescolato 40 µL di DNA da protocolli ChIP o RNA con 2,9 µL di H2O, 0.5 µL di soluzione di 1% Tween-20, 5 µL 10× ligasi T4 buffer (Enzimatici cat# L6030-HC-L), 1 µL di dNTP mix (10 mM Affymetrix 77119), 0.3 µL di T4 DNA pol (Enzimatici P7080L), 0.3 µL T4 PNK (Enzimatici Y9040L), 0.06 µL di Klenow (Enzimatici P7060L) e incubate per 30 min a 20 °C. 1 µL di Seradyn 3 EDAC SpeedBeads (Thermo 6515-2105-050250), nel 93 µL 20% PEG8000/2.5 M di NaCl (13% finale) è stato aggiunto e incubate per 10 min. Pulizia delle perle: le perle sono state raccolte su un magnete e lavate 2× con 80% di etanolo. Le perle sono state essiccate all’aria per 10 min e poi eluite in 15 µL ddH2O. da-Tailing. Il DNA è stato mescolato con 10.8 µL ddH2O, 0,3 µL 1% Tween-20, 3 µL Tampone blu (cat enzimatica# B0110L), 0,6 µL dATP (10 mm Tech 10216-018), 0,3 µL Klenow 3-5 Exo (Enzimatica P7010-LC-L) e incubato per 30 min a 37 °C. 55,8 µL 20% PEG8000/2,5 M NaCl (13% finale) è stato aggiunto un incubato per 10 min. Poi bead clean up è stato fatto. Le perle sono state eluite in 14 µL. Legatura dell’adattatore a forma di Y. Il campione è stato miscelato con 0,5 µL di un adattatore per codici a barre BIOO (BIOO Scientific cat # 514104), 15 µL di tampone di legatura rapida (cat enzimatica@ L603-LC-L), 0,33 µL 1% Tween-20 e 0.5 µL T4 DNA ligasi HC (Enzimatica L6030-HC-L) e incubato per 15 min a RT. 7 µL di 20% PEG8000/2,5 M NaCl è stato aggiunto e incubato per 10 min a RT. Bead clean up è stato eseguito e perline sono stati eluiti in 21 µL. 10 µL sono stati quindi utilizzati per l’amplificazione PCR (14 cicli) con primer IGA e IGB (AATGATACGGCGACCGA, CAAGCAGAAGACGGCATACGA).

GRO-seq

La trascrizione nascente è stata catturata dal sequenziamento run-on nucleare globale (GRO-seq). I nuclei sono stati isolati da TGEMs usando lisi ipotonica (10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 2 mm MgCl2, 3 mM CaCl2; 0.1% IGEPAL CA-630) e flash congelato in tampone GRO-congelamento (50 mM Tris-HCl (pH 7,8), 5 mm MgCl2, 40% glicerolo). Correte. 3-5 × 106 nuclei BMDM sono stati eseguiti con NTPs etichettati con BrUTP con buffer 3× NRO (15 mm Tris-Cl (pH 8.0), 7.5 mm MgCl2, 1.5 mM DTT, 450 mm KCl, 0.3 U/µL di SUPERasi In, 1.5% Sarkosyl, 366 µM ATP, GTP (Roche), Br-UTP (Sigma 40 Aldrich) e 1.2 µM CTP (Roche, per limitare–sulla lunghezza a ~40 nucleotidi)). Le reazioni sono state interrotte dopo 5 minuti con l’aggiunta di 500 µL di reagente Trizol LS (Invitrogen), vortexato per 5 minuti e RNA estratto e precipitato come descritto dal produttore. I pellet di RNA sono stati risospesi in 18 µL di ddH2O + 0,05% di interpolazione (dH2O + T) e 2 µL di frammentazione (100 mMZnCL2, 10 mM Tris–HCl (pH 7,5)), quindi incubati a 70 °C per 15 min. La frammentazione è stata interrotta con l’aggiunta di 2,5 µL di 100 mm EDTA. Arricchimento BrdU. L’arricchimento di BrdU è stato eseguito utilizzando anticorpi BrdU (IIB5) e perline AC (Santa Cruz, sc-32323 AC, lotto #A0215 e #C1716). Perline sono stati lavati una volta con GRO binding buffer (0.25× salina-sodio-fosfato-EDTA buffer (SSPE), 0.05% (vol/vol) Tween, 37.5 mm NaCl, 1 mM EDTA) + 300 mm NaCl seguito da tre lavaggi in GRO binding buffer e risospeso come 25% (vol/vol) slurry con 0.1 U/µL SUPERase-in. Per frammentare l’RNA, sono stati aggiunti 50 µL di tampone di legame GRO freddo e 40 µL di perle di anticorpi BrdU equilibrati e i campioni ruotati lentamente a 4 °C per 80 min. Le perle sono state successivamente filate a 1000 × g per 15 s, il surnatante rimosso e le perle trasferite su una colonna MC Ultrafree Millipore (UFC30HVNB; Millipore) in 2 × 200 µL GRO binding buffer. La reazione IP è stata lavata due volte con un tampone di legame GRO da 400 µL prima che l’RNA fosse eluito per incubazione in 200 µL di trizolo LS (ThermoFisher) sotto leggera agitazione per 3 min. L’eluizione è stata ripetuta una seconda volta, 120 µL di dH2O + T aggiunto per aumentare il surnatante ed estratto come descritto dal produttore. Fine riparazione e decapping: Per la fine riparazione e decapping, pellet di RNA sono stati sciolti in 8 µL TET (10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 1 mM EDTA, 0.05% Tween 20) da vortexing vigoroso, riscaldato a 70 °C per 2 min e posto su ghiaccio. Dopo un rapido spin, 22 µL di master mix di riparazione (3 µL 10× tampone PNK, 15,5 µL dH2O + T, 0,5 µL di inibitore della superasi in RNasi (10 U), 2 µL PNK (20U), 1 µL RppH (5U)) è stato aggiunto, miscelato e incubato a 37 °C per 1 h. Per fosforilare il 5’end, è stato successivamente aggiunto 0,5 µL 100 mm ATP e le reazioni sono state incubate 37 °C (l’alta concentrazione di ATP disseta l’attività di RppH). Dopo la riparazione finale, è stato aggiunto 2,5 µL di EDTA da 50 mm, le reazioni sono state mescolate e quindi riscaldate a 70 ° C per 2 minuti prima di essere immesse sul ghiaccio. Un secondo arricchimento BrdU è stato effettuato come descritto sopra. I pellet di RNA sono stati sciolti in 2,75 µL TET + 0,25 µL Illumina TruSeq 3’adapter (10 µM), riscaldati a 70 °C per 2 min e posti su ghiaccio. 7 di 3’master mix (4,75 µL 50% PEG8000, 1 µL 10× T4 RNA ligasi tampone, 0,25 µL SUPERasi-In, 1 µL T4 RNA Ligasi 2 troncato (200U; NEB)) è stato aggiunto, mescolato bene e reazioni incubate a 20 °C per 1 h. Le reazioni sono state diluite con l’aggiunta di 10 µL TET + 2 µL 50 mM EDTA, riscaldato a 70 °C per 2 min, posto su ghiaccio BrUTP arricchimento è stato eseguito. I pellet di RNA sono stati trasferiti su strisce di PCR durante il lavaggio con etanolo al 75% e asciugati. I campioni sono stati sciolti in 4 µL TET (10 mM Tris–HCl (pH 7,5), 0,1 mM EDTA, 0,05% Tween 20) + 1 µL 10 µM reverse transcription (RT) primer. Per temprare l’RTprimer, la miscela è stata incubata a 75 ° C per 5 min, 37 °C per 15 min e 25 °C per 10 min. Per lieve a 5′ Illumina TruSeq adattatore, 10 µL 5’master mix (1.5 µL di dH2O + 0.2% Tween 20, di 0,25 µL denaturato 5’TruSeq adattatore (10 µM), 1.5 µL 10× T4 RNA ligasi buffer, di 0,25 µL SUPERase-In, 0,2 µL 10 mM ATP, 5.8 µL 50% PEG8000, 0.5 µL T4 RNA ligasi 1 (5U; NEB)) è stato aggiunto e le reazioni sono state incubate a 25 °C per 1 h. Trascrizione inversa è stata eseguita utilizzando Protoscript II (NEB) (4 µL 5× NEB FirstStrand buffer (NEB; E7421AA), di 0,25 µL SUPERase-In, 0.75 µL Protoscript II (150U; NEB)) a 50 °C per 1 h. Dopo l’aggiunta di 30 µL di PCR master mix (25 µL 2× LongAmp Taq 2× Master Mix (NEB), 0,2 µL 100 µM forward primer, 2.8 µL 5 M betaina e 2 µL 10 µM singoli codici a barre primer), le miscele sono state amplificate (95 °C per 3 min a 95 °C per 60 s, 62 °C per 30 s, 72 °C per 15 s) x13, 72 °C per 3 min). Le reazioni di PCR sono state ripulite utilizzando 1,5 volumi di SpeedBeads (GE Healthcare) in 2,5 M NaCl/20% PEG8000. Le librerie sono state selezionate su PAGE / TBE gel a 160-225 coppie di basi. Le fette di gel sono state sminuzzate ruotando attraverso un tubo PCR perforato da 0,5 mL posto sopra un tubo da 1,5 mL. È stato aggiunto 150 µL di gel EB (0,1% LDS, 1 M LiCl, 10 mM Tris–HCl (pH 7,8)) e il liquame incubare sotto agitazione durante la notte. Per purificare il DNA eluito, 700 µL di Zymogen Chip DNA binding buffer sono stati aggiunti nel tubo da 1,5 mL contenente la fetta di gel triturato e il Gel EB, miscelato mediante pipettaggio e il liquame trasferito in una colonna ZymoMiniElute. I campioni sono stati prima filati a 1000 × g per 3 min, poi 10.000×g per 30 s. Il flusso è stato rimosso e i campioni sono stati lavati con 200 µl di Zymo WashBuffer (con EtOH). I resti di gel sono stati rimossi sfogliando e le colonne lavate con l’aggiunta di un altro WashBuffer Zymo da 200 µL (con EtOH). Il flusso è stato rimosso, le colonne filate a secco mediante centrifugazione a 14.000 × g per 1 min e il DNA eluito mediante aggiunta di 20 µL di sequenziamento pre-riscaldato TET (10 mM Tris-HCl (pH 8,0) , 0,1 mM EDTA, 0,05% Tween 20). Le librerie sono state sequenziate.

Western blotting

Le cellule sono state lisate con tampone di lisi Igepal (50 mM Tris pH 8,0, 150 mm NaCl, 0.5% Igepal) e le concentrazioni di proteine sono state determinate con il reagente Biorad protein assay utilizzando BSA come standard. Le proteine sono state separate su NuPage 4-12% Bis-Tris gradient gel (Invitrogen) e trasferite su una membrana di nitrocellulosa (Amersham). Le membrane sono state bloccate in TBS con 0.1% Tween – 20 e 5% BSA. Le membrane sono state macchiate con il primario indicato durante la notte a 4 °C. Gli anticorpi secondari coniugati con perossidasi di rafano sono stati rilevati utilizzando ECL più western blotting detection system (Amersham).

Animali e colture cellulari

I TGEMS sono stati raccolti 3 giorni dopo l’iniezione da topi maschi C57Bl/6J di 8 settimane o BALB / CJ e placcati a 20 × 106 cellule per capsula di Petri da 15 cm in DMEM più 10% FBS e 1× penicillina-streptomicina. Un giorno dopo la placcatura, le cellule sono state integrate con mezzi freschi e trattate con PBS (Veh) o 100 ng/mL KLA per 1 h, e quindi utilizzate direttamente per le analisi a valle. Gli iBMDM sono prodotti dall’infezione di BMDM con un retrovirus contenente myc e Braf V600E66. Le cellule immortalate vengono poi coltivate per diverse settimane. Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti in conformità con gli standard etici stabiliti dalla University of California, San Diego Institutional Annual Care and Use Committee (IUCAC).

La produzione di Lentivirus

pLentiguide è stata modificata per contenere uno scaffold U6-bsmbi-spgRNA e un promotore CMV che guida tagBFP2. Sono state inserite 2 guide CRISPR per ciascun target tramite amplificazione PCR con il promotore H1 (sito bsmbi/guide1/scaffold/promotore H1/guida 2/sito bsmb1) per un totale di 2 guide per virus (guidato da U6 e H1) (Tabella supplementare 4). Virus è stato fatto con pVSVg / ppAX2 sistema. Due giorni dopo la trasfezione, i media sono stati raccolti e centrifugati a 4 °C per 2 h a 20.000 × g. Il pellet cellulare è stato ricostituito durante la notte a 4 °C in OPTI-MEM e conservato a -80 °C.

Produzione di CRISPR KO iBMDMs

KO iBMDMs sono stati prodotti utilizzando l’infezione lentivirale. iBMDM-CAS9-IRES-EGFP sono stati infettati con MOI 100, come misurato su cellule 293T, con Lentiblast (OZ biosciences) (5 µL ogni reagente) in OPTI-MEM. Questo è stato poi centrifugato a 1300g per 1 h a temperatura ambiente. I media sono stati quindi rimossi e le cellule sono state integrate nei media del midollo osseo (30% L-cell, 20% FBS, 1% penicillina/streptomicina in DMEM) per 2 giorni. Le cellule sono state quindi ordinate per l’infezione mediante espressione di un transgene sulla sequenza virale (tagBFP2).

Reporting summary

Ulteriori informazioni sulla progettazione sperimentale sono disponibili nel Reporting Summary di Nature Research collegato a questo articolo.

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