DNA a tripla elica formazione: Un potenziale strumento per la genetica, riparazione

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A. Nayak, P. Khare, M. K. Chourasia, O. Silakari e D. V. Kohli*

Dipartimento di Scienze Farmaceutiche, Dr. Hari Singh Gour Vishwavidyalaya, Sagar-470 003, India

*Autore di riferimento: D. V. Kohli
Dipartimento di Scienze Farmaceutiche, Dr. Hari Singh Gour Vishwavidyalaya, Sagar-470 003, India
E-mail:

Date of Submission 25 March 2004
Date of Revision 06 July 2006
Date of Acceptance 05 November 2006
Indian J Pharm Sci, 2006, 68 (6): 697-704

DOI: 10.4103/0250-474X.30999

Abstract

DNA triple helices offer new perspectives towards oligonucleotide-directed gene regulation. La tripla elica che forma oligonucleotidi, che si legano al DNA a doppio filamento, è di particolare interesse poiché sono mirati al gene stesso piuttosto che al suo prodotto mRNA (come nella strategia antisenso). Tuttavia, la scarsa stabilità di alcune di queste strutture potrebbe limitare il loro uso in condizioni fisiologiche. Ligandi specifici possono intercalare in DNA triple eliche e stabilizzarli. Questa recensione riassume i recenti progressi in questo campo, evidenziando anche i principali ostacoli che rimangono da superare, prima che l’applicazione della tecnologia triplex alla riparazione genetica terapeutica possa essere raggiunta.

Formazione a tripla elica (fig. 1) recentemente è stato al centro di un notevole interesse per la possibile applicazione nello sviluppo di nuovi strumenti di biologia molecolare e agenti terapeutici e per la possibile rilevanza delle strutture H-DNA nei sistemi biologici . Nelle strutture intermolecolari, una sequenza oligopirimidina-oligopurina di DNA duplex è legata da un oligonucleotide di terzo filamento nel solco principale .

Figura

Figura 1: DNA tripla elica

Sono stati descritti due tipi principali di triple eliche, a seconda dell’orientamento del terzo filamento . I primi complessi triplice-elicoidali hanno coinvolto il terzo filamento pirimidico il cui legame poggia su legami idrogeno di Hoogsteen tra una coppia di basi T-A e timina e tra una coppia di basi C-G e citosina protonata . L’oligonucleotide contenente (T, C) si lega parallelamente al filamento di oligopurina nel cosiddetto motivo pirimidinico. Una seconda categoria di triple eliche contiene purine nel terzo filamento, che è orientato antiparallelo al filamento oligopurina. C·G×G e T * A×A terzine di base si formano dopo uno schema idrogeno-bonding Hoogsteen inversa . Gli oligonucleotidi contenenti T e G possono anche formare triple eliche il cui orientamento dipende dalla sequenza di base .

La formazione a tripla elica offre un mezzo diretto per manipolare selettivamente l’espressione genica nelle cellule in cui le triple eliche del DNA offrono nuove prospettive verso la regolazione genica diretta all’oligonucleotide (fig. 2). La tripla elica sintetica che forma gli oligonucleotidi (TFOs) si lega con alta affinità e specificità al filo purinico nella scanalatura principale della sequenza omopurina – omopirimidina nel DNA a doppio filamento .

Figura

Figura 2: I TFO prevengono la trascrizione del gene mutato

I TFOS sono buoni candidati per essere usati come agenti leganti il DNA site-specific e sono in fase di studio per il loro uso come potenziali agenti terapeutici. Sono stati studiati in applicazioni antisenso, dove sono progettati per indirizzare MRNA, applicazioni antigene, dove controllano l’espressione genica attraverso la formazione di tripla elica, e in applicazioni che mirano alle proteine, dove vengono utilizzati come aptamers .

I TFOS possono anche essere utilizzati nella terapia genica dove mirano alla sequenza del DNA del gene mutato per impedirne la trascrizione. I tratti ricchi di purine sono trovati frequentemente nelle regioni del promotore del gene ed i TFOs diretti a questi siti regolatori sono stati indicati per ridurre selettivamente la trascrizione dei geni mirati, probabilmente bloccando il legame degli attivatori trascrizionali e / o la formazione dei complessi di iniziazione. La modulazione triplex-mediata della trascrizione ha applicazione potenziale nella terapia poiché può essere usata; per esempio, per ridurre i livelli di proteine pensate per essere importanti nei processi di malattia. I TFOS possono anche essere usati come strumenti molecolari per lo studio dell’espressione genica e si sono dimostrati efficaci in varie strategie di targeting genico nelle cellule viventi. TFOs può legarsi alle regioni polipurina/polipirimidina nel DNA in modo sequenziale. La specificità di questo legame solleva la possibilità di utilizzare la formazione triplex per la modifica diretta del genoma, con l’obiettivo finale di riparare i difetti genetici nelle cellule umane. Diversi studi hanno dimostrato che il trattamento delle cellule di mammifero con TFOs può provocare la riparazione del DNA e la ricombinazione, in un modo che può essere sfruttato per introdurre cambiamenti di sequenza desiderati. Sono stati riportati numerosi studi in cui gli oligonucleotidi sono stati utilizzati come composti antigenici all’interno delle cellule .

Formazione di DNA a tripla elica

La formazione a tripla elica è il risultato del legame degli oligoinucleotidi con un’elevata specificità di riconoscimento al solco principale del DNA a doppia elica formando legami di tipo Hoogsteen con basi puriniche delle coppie di basi Watson-Crick, il composto razionalmente progettato per la regolazione artificiale dell’espressione genica . La formazione triplex richiede ioni Mg2 + mentre è inibita dagli ioni K+.

Nella strategia a tripla elica o antigene, l’oligonucleotide si lega nella scanalatura principale del DNA a doppio filamento tramite il legame dell’idrogeno di Hoogsteen per formare una tripla elica . TFOs legano sequenze di omopurina-omopirimidina nel DNA a doppio filamento. Ci sono quattro motivi strutturali per la formazione di triplex che sono stati descritti in base alla composizione del terzo filo e al suo orientamento rispetto al filo ricco di purine del duplex. Purine motif TFOs (quelli che sono costituiti da G e A) forma G*G:C e A*A:T triplette e si legano in orientamento antiparallelo per quanto riguarda il filo purinico del duplex. D’altra parte, i motivi pirimidinici TFOs (C/T) formano triplessi in orientamento parallelo e generalmente solo a pH basso a causa della necessità che le basi della citosina siano protonate per formare legami di Hoogsteen; formano triplette C+*G:C e T*A:T. Infine, purina mista e pirimidina TFOs si legano in orientamento parallelo o antiparallelo e formano triplette G*G:C e T*A:T. L’orientamento in cui il motivo misto TFOs si lega, dipende dal numero di passi GpA e ApG nel tratto omopurinico . L’orientamento antiparallelo è favorito da un maggior numero di passi, mentre un basso numero di passi favorisce l’orientamento parallelo .

Una volta stabilito il motivo migliore per legare una particolare sequenza target, i problemi con gli oligonucleotidi fosfodiesterici naturali limitano il successo dell’approccio antigenico e le applicazioni terapeutiche degli oligonucleotidi in generale. Gli oligonucleotidi con la spina dorsale del fosfodiestere naturale sono suscettibili alle ex e alle esonucleasi. L’attività predominante che degrada gli oligonucleotidi è l’attività 3 ‘ – esonucleasi, ma l’attività dell’endonucleasi è stata osservata anche in alcune impostazioni . Pertanto, per l’applicazione come terapeutica in vivo TFOs deve essere in grado di resistere sia all’esonucleasi che all’attività endonucleasica per raggiungere il loro obiettivo. Una modifica della spina dorsale che conferisce resistenza alla nucleasi ma consente di legarsi al DNA a doppio filamento con elevata affinità è necessaria per le applicazioni in vivo di TFOs.

Gli oligomeri del morfolino del fosforodiamidato sono oligonucleotidi modificati della spina dorsale che precedentemente sono stati studiati come agenti antisenso . Gli oligonucleotidi Morfolino hanno una spina dorsale non carica in cui lo zucchero desossiribosio del DNA è sostituito da un anello a sei membri e il legame fosfodiestere è sostituito da un legame fosforodiamidato (fig. 3). Gli oligonucleotidi di Morfolino sono resistenti alla degradazione enzimatica e sembrano funzionare come agenti antisenso arrestando la traduzione o interferendo con lo splicing pre-mRNA piuttosto che attivando la RNasi H . Sono stati consegnati con successo alle cellule di coltura tissutale con metodi che interrompono fisicamente la membrana cellulare, e uno studio che ha confrontato molti di questi metodi ha scoperto che il caricamento del raschiamento era il metodo più efficiente di consegna; tuttavia, poiché la spina dorsale del morfolino è scarica, i lipidi cationici non sono mediatori efficaci dell’assorbimento dell’oligonucleotide del morfolino nelle cellule . Un recente rapporto ha dimostrato la formazione triplex da un oligonucleotide morfolino e, a causa della spina dorsale non ionica, questi studi hanno dimostrato che l’oligonucleotide morfolino era in grado di formazione triplex in assenza di magnesio .

Figura

Figura 3: Presentazione strutturale del DNA fosfodiestere e del morfolino

I cationi hanno dimostrato di svolgere un ruolo importante nella formazione della tripla elica. Quando gli oligonucleotidi fosfodiesterici sono usati come TFOs, il magnesio è generalmente richiesto per la formazione triplex con purina e TFOS motif misto; accelera anche la reazione e stabilizza il triplex formato con TFOS motif pirimidinico . Altri cationi bivalenti hanno dimostrato di funzionare nella stessa capacità del magnesio per quanto riguarda la formazione di triplex . Il magnesio si verifica ad una concentrazione di ~0,8 mm nella cellula e ~1,5 mM nel sangue , ma la maggior parte delle reazioni triplex in vitro vengono eseguite in MgCl2 5-10 mM. Il potassio si verifica nella cellula ad una concentrazione di ~140 mM e a 4 mM nel sangue. Alte concentrazioni di potassio possono inibire la formazione triplex con oligonucleotidi ricchi di guanina progettati come TFOs favorendo altre strutture secondarie del DNA, come dimeri e quadruplex . Sarà necessario superare la limitata capacità del fosfodiestere TFOs di formare un triplex in basso magnesio e alto potassio affinché siano efficaci in condizioni fisiologiche. In un recente studio di morfolino TFOs, la formazione di triplex è stata dimostrata in assenza di magnesio e in presenza di potassio. Queste proprietà rendono morpholino TFOs buoni candidati per ulteriori studi come terapie antigene.

Modellazione molecolare

La struttura triplex del DNA può essere costruita con tecniche di modellazione molecolare utilizzando coordinate che tengano correttamente conto della conformazione zuccherina delle triple eliche (T,C)-motif . Questa struttura è più vicina a un DNA di forma B come riportato da studi NMR rispetto alla struttura proposta , basata sulla diffrazione dei raggi X della fibra. Il programma JUMNA permette di costruire strutture di DNA secondo i loro parametri elicoidali . Un sito di intercalazione può essere facilmente creato nel triplex raddoppiando il parametro di salita per due triplette di base T·A×T adiacenti (aumento = 6,8 Å) e successivamente diminuendo il parametro di torsione tra queste due triplette da 34° a 16° per ridurre i vincoli di distanza di legame.

Utilizzando la modellazione molecolare, si può dimostrare la possibilità di formare una tripla elica parallela in cui il singolo filamento interagisce con il duplex intatto nella scanalatura minore, attraverso nuove interazioni di base .

JUMNA utilizza una miscela di coordinate elicoidali e interne (valenza e angoli diedri) per descrivere la flessibilità dell’acido nucleico. I parametri elicoidali posizionano ogni nucleotide 3’monophosphate rispetto ad un sistema ad asse fisso. Le giunzioni tra nucleotidi successivi sono mantenute con restrizioni quadratiche sulle distanze O5 ‘- C5’. Oltre a un numero ridotto di variabili rispetto ai programmi di coordinate cartesiane, la scelta di variabili fisicamente significative consente grandi movimenti conformazionali concertati durante la minimizzazione, insieme a un controllo efficiente della struttura e alla facile introduzione di vincoli o restrizioni. Gli strumenti disponibili includono sia la mappatura adiabatica che le ricerche combinatorie rispetto ai parametri strutturali scelti. Le particolarità del campo di forza di flessione includono la presenza di un termine specifico per spiegare la dipendenza angolare del legame idrogeno e la possibilità di screening dell’energia elettrostatica con una funzione dielettrica sigmoidale , ε (R) =D-(D-D0)/2 exp (-RS), dove R è la distanza tra due cariche. La pendenza S, il valore di plateau a lunga distanza D e il valore iniziale D0 della funzione sono regolabili, con valori predefiniti rispettivamente di 0,16, 80 e 1,utilizzando due ipotesi già utilizzate per la costruzione della tripla elica a scanalatura minore . Innanzitutto, le terzine di base sono trattenute per essere complanari per evitare possibili interazioni tra terzine interbase. Tali interazioni si formano facilmente durante la costruzione di eliche allungate, ma non possono svolgere un ruolo nel riconoscimento o nello scambio di filamenti, poiché questi processi sono indipendenti dalla sequenza generale. È stato verificato che la struttura ottimizzata del triplex a scanalatura minore è indipendente da queste restrizioni. La seconda ipotesi, in linea con la stechiometria dei complessi RecA/ DNA, che mostra tre nucleotidi per monomero RecA, è l’uso della simmetria elicoidale trinucleotidica. Per questo motivo studi preliminari sono stati limitati a sequenze con ripetizione trinucleotidica.

Sono necessari vincoli o vincoli specifici per la costruzione e la manipolazione triplex. Questi includono i vincoli di “plateau” e i vincoli di simmetria trinucleotide, descritti in precedenza . Il sistema di ritenuta” plateau ” mantiene la co-planarità delle basi che formano una tripletta, consentendo le rotazioni e gli spostamenti necessari per la commutazione della coppia di basi. Il vincolo di simmetria trinucleotide implica l’equivalenza delle variabili che descrivono ciascun gruppo successivo di tre nucleotidi. Stretching dsDNA, in modo che la torsione diminuisce e la scanalatura minore si apre sono stati precedentemente raggiunti trattenendo la distanza tra gli atomi terminali O3′ dell’unità di simmetria trinucleotide. Questo sistema di ritenuta è stato leggermente modificato perché la distanza O3′-O3′ può essere alterata da uno spostamento laterale delle dorsali durante lo scambio del filo. In un recente lavoro, solo la componente del vettore O3′-O3′ parallela all’asse dell’elica è stata trattenuta. Le restrizioni sulla larghezza della scanalatura, calibrate con l’aiuto di calcoli numerici elettrostatici di Poisson-Boltzmann, sono state utilizzate per evitare il restringimento della scanalatura a causa della mancanza di molecole di solvente esplicite .

La commutazione della coppia di basi è studiata dalla rotazione della base, usando l’approccio definito da Bernet et al . Ciò comporta una restrizione applicata all’angolo θ tra il legame glicosidico (purina: C1′-N9 o pirimidina: C1′-N1) e il vettore che unisce i due atomi C1′ di una coppia di basi, proiettati sul piano perpendicolare a un asse elicoidale locale. θ ha un valore di 55 ° in B-DNA canonico. Modellazione coppia di base commutazione per una base scelta comporta una variazione adiabatica di θ da 65° a 10° da passi di 2° pur mantenendo sia “plateau” e stretching restrizioni.

Gli ostacoli e le limitazioni incontrate nella formazione a tripla elica

Le applicazioni biologiche di TFOs sono compromesse da considerazioni biofisiche fondamentali, così come le limitazioni imposte dalle condizioni fisiologiche. La formazione triplex comporta l’approccio e il legame di un terzo filo caricato negativamente a un duplex a doppia carica negativa. La neutralizzazione della repulsione di carica è tipicamente fornita sperimentalmente da livelli di Mg++ (5-10 mM) che sono molto più alti di quelli che si pensa siano disponibili nelle cellule . Inoltre, la formazione triplex comporta cambiamenti conformazionali da parte del terzo filamento e una certa distorsione del duplex sottostante . I triplexes del motivo della pirimidina sono instabili al pH fisiologico a causa del requisito della protonazione della citosina che si presenta al pH relativamente acido (pKa = 4,5). Ciò è necessario per il secondo legame idrogeno di Hoogsteen, sebbene la carica positiva risultante apporti apparentemente il contributo più importante alla stabilità triplex . I triplexes del motivo della pirimidina che contengono le citosine adiacenti sono spesso meno stabili che quelli con le citosine isolate. Tradizionalmente questo è stato attribuito agli effetti di repulsione carica-carica, sebbene uno studio recente suggerisca che la protonazione incompleta delle citosine adiacenti possa essere il fattore critico . Inoltre, i trefoli del motivo purinico (che sono ricchi di G) possono formare tetradi G nei livelli fisiologici di K+, che inibiscono la formazione di triplex . Tutti questi fattori impongono barriere cinetiche alla formazione di triplex e riducono la stabilità dei triplex una volta formati (la maggior parte dei triplex, anche in condizioni ottimali in vitro, sono meno stabili del duplex sottostante .

Strategie per contrastare le limitazioni

Il primo e più importante problema riscontrato nella strategia antigene a tripla elica è l’instabilità del triplex formato dal TFOs in condizioni fisiologiche che limita di conseguenza l’utilizzo di questa strategia molto affascinante destinata alla correzione genica in misura variabile. Quindi sono stati proposti vari approcci e strategie per conferire stabilità alla triplice struttura elicoidale formata.

Le triple eliche dirette da oligonucleotide potrebbero essere stabilizzate utilizzando ligandi di acido nucleico che stabilizzano selettivamente le triple eliche. Ad esempio, il bromuro di etidio ha dimostrato di legare e stabilizzare una tripla elica fatta di poli (dT)·poli (DA)× poli (dT), che contiene solo triplette T·A×T. Tuttavia, questo composto stabilizza male (o addirittura destabilizza) le triple eliche contenenti sia T·A×T che C·G×C+ triplette di base, probabilmente come risultato della repulsione elettrostatica . I derivati del benzopiridoindolo sono stati le prime molecole segnalate per stabilizzare fortemente quest’ultimo tipo di triple eliche anche se hanno una preferenza per i tratti T·A×T. Parecchi altri intercalatori come pure vari leganti minori della scanalatura del DNA egualmente sono stati indicati per legare alle eliche triple del DNA. Per esempio le eliche triple possono essere stabilizzate dalla modifica chimica degli oligonucleotidi quale, psoralene attaccato agli oligonucleotidi è stato indicato per migliorare la loro attività biologica dopo irradiazione UV . Gli intercalatori di solito stabilizzano in misura maggiore le triple eliche contenenti triplette T * A×T, mentre i leganti minori della scanalatura di solito destabilizzano i triplex, tranne in un caso particolare in cui la tripla elica coinvolgeva un filamento di RNA . Poiché non sono disponibili dati strutturali su complessi a tripla elica-ligando, non si sa molto sulle interazioni che dirigono l’intercalazione specifica in triple eliche. È stato dimostrato che i derivati BPI intercalano tra triplette di base T * A×T mediante trasferimento di energia di fluorescenza di eccitazione da triplette di base a ligandi e dicroismo lineare e circolare . Si è scoperto che gli oligonucleotidi morfolino-paralleli pirimidinici sono in grado di formare un triplex con bersaglio duplex. Come previsto, questo motivo ha richiesto un pH basso per la formazione di triplex, come richiesto dal fosfodiestere del motivo pirimidina-parallelo TFO. Può essere possibile superare questa dipendenza dal pH con tali sostituzioni come 5-metilcitosina per le citosine nel TFO .

Un approccio alternativo con cui le triple eliche possono essere stabilizzate è tramite modifiche chimiche degli oligonucleotidi, come l’attaccamento covalente di una molecola di acridina . È stato dimostrato che la sostituzione dell’acridina aumenta fortemente l’inibizione della scissione enzimatica restrictina e inoltre non compromette la specificità della sequenza per la formazione di triplex .

Applicazioni del DNA a tripla elica

La formazione di triple eliche a DNA intermolecolare offre la possibilità di progettare composti con ampie proprietà di riconoscimento delle sequenze, che possono essere utili come agenti antigenici o strumenti in biologia molecolare . Negli ultimi dieci anni, un nuovo approccio che utilizza analoghi del DNA, come agenti terapeutici, sta emergendo nella chimica medicinale. Questo si basa sulla regolazione dell’espressione di geni di proteine / enzimi correlati alla malattia bloccando la loro trascrizione (antigene) o traduzione (antisenso) (fig. 4). È influenzato attraverso il legame sequenza-specifico di oligonucleotidi complementari a DNA duplex tramite formazione triplex per inibire la produzione di mRNA o interferire nella traduzione di quest’ultimo alle proteine. Poiché gli oligonucleotidi non entrano facilmente nelle cellule e sono suscettibili di distruzione da parte delle nucleasi cellulari, una varietà di analoghi chimicamente modificati di oligonucleotidi vengono progettati, sintetizzati e valutati per lo sviluppo come agenti terapeutici.

Figura

Figura 4: Principi di terapie antigene e antisenso

Il riconoscimento specifico delle regioni omopurine-omopirimidiniche nel DNA duplex mediante oligonucleotidi triplex-forming (TFOs) fornisce una strategia interessante per la manipolazione genetica, con l’obiettivo finale di riparare i difetti genetici nelle cellule umane. La capacità di indirizzare le mutazioni può rivelarsi utile, come strumento per studiare la riparazione del DNA e come tecnica per la terapia genica e l’ingegneria genetica .

Sono stati sviluppati strumenti efficienti basati su triple eliche per varie applicazioni biochimiche come lo sviluppo di nucleasi artificiali altamente specifiche. La strategia antigene rimane uno dei campi più affascinanti di applicazione triplex per controllare selettivamente l’espressione genica (Tabella 1). Il targeting delle sequenze genomiche è ora dimostrato di essere un concetto prezioso su un numero ancora limitato di studi; la mutagenesi locale è in questo senso un’interessante applicazione di oligonucleotidi che formano triplex, su colture cellulari .

Target gene Cell line Oligomersize, andmodifications
Transfected genes CAT gene/ IL ?2Rpromoter
CAT gene/(6-16)
IRECAT gene/tkpromoter
PRE upstream
Endogenous genes
IL-2R
c-myc
SV 40 T Ag
Antivirals
SV 40
HIV-1		 HSB2 cells (T-cell) HeLacells
cv-1 cells
Human lymphocytes
HeLacells
Tsa 8 cells
CV-1 MT4		 15-mer acridine orpsoralenlinked
21-mer
38-mer
colesterol
28-mer
27-mer
15,20-mer
PNAs 8-mer, acridine
31,38-mers

Table 1: Gli studi sull’acido nucleico dell’antigene all’interno delle cellule Eucariotiche80

Le strategie antigene si concentrano principalmente sul targeting genico mediante ricombinazione omologa o oligodeossinucleotidi a tripla elica . Per molte ragioni tecniche, tra cui l’accessibilità genetica molto limitata all’interno della struttura cromosomica altamente malariacondensata, avvolta da proteine, l’applicazione clinica di questi metodi non è progredita rapidamente. Kielkopf et al hanno recentemente descritto un approccio alternativo, utilizzando poliammidi che possono diffondersi nel nucleo e riconoscere specifiche sequenze di DNA . Anche se molto eccitante, questa metodologia è ancora nella sua infanzia e la sua ultima utilità clinica rimane sconosciuta .

Applicazioni terapeutiche della tecnologia antigene

Il DNA a tripla elica ha attirato l’attenzione a causa della potenziale applicazione di TFOs come agenti terapeutici, per applicazioni come il targeting genetico intracellulare, come soluzioni chimiche razionali per sequenziare il riconoscimento specifico di un DNA duplex e l’identificazione di geni responsabili della crescita cellulare e della trasformazione maligna . Con questa conoscenza è venuto un naturale desiderio di tradurre queste informazioni in nuove strategie terapeutiche specifiche per il trattamento del cancro, delle malattie cardiovascolari e di altre malattie comuni dell’umanità (Tabella 2). Il recente sviluppo di un inibitore biochimico relativamente specifico della tirosina chinasi della proteina bcr/abl in pazienti con leucemia mieloide cronica è un esempio sbalorditivo di questa ricerca . Per le terapie mirate direttamente alla sostituzione, riparazione o disabilitazione di geni che causano malattie, i progressi sono stati molto più lenti e un successo equivalente all’inibitore biochimico bcr/abl deve ancora essere raggiunto. Le ragioni di questo sono complesse e variano con il tipo di terapia gene-diretta in uso .

Disease Cause
Cancer
Viral infection
Endocrinological
Bacterial
Neurological
Autoimmune
Parasite		 Uncontrolledcellgrowthfrommutationalactivation and activation of oncogenes
Replication of virus in host cellse.g., HIV,HSC, influenza
Abnormallevels of-renin, angiotensinaseorvasopressin precursor (highbloodpressure)-transforminggrowth factor(kidneyfailure)-growth hormone(acromegaly)-gastrins (ulcers)
Antibioticresistant tuberculosis, mycoplasmas-blocking of 3’terminus of16s RNA
Lesins in β-amyloid gene (Alzhiemer’sdisease)
Inadvertantproduction of antibodiesagainst normal tissues (degradation of
host tissue -arthritis, myasthenia
gravis), blocking β-cell, Igcellor T-cell
receptor genes byantisense
Haempolymeraseproduction (malaria­blockingexpressions of haempolymerase), la malattia del sonno(trypansoma)

Tabella 2: Alcune Patologie Suscettibili di Trattamento da parte di DNA Terapie

Stephenson e Zamecnik ha dimostrato che un breve (13nt) oligonucleotide di DNA inverso complementari in sequenza antisenso) per il virus del sarcoma di Rous potrebbe inibire la replicazione virale in coltura. Una delle proprietà più importanti degli oligonucleotidi antisenso e antigene nel loro uso come terapia è la loro resistenza alle nucleasi. Gli oligonucleotidi di fosforotioato sono il tipo più comune di oligonucleotidi con resistenza alle nucleasi relativamente elevata e sono stati introdotti sul mercato come farmaci contro la retinite indotta da citomegalovirus . Gli oligonucleotidi con un residuo di acido nucleico 2′-O,4′-C – etilene (EN) nella seconda posizione dall’estremità 3′ mostrano una resistenza alla nucleasi molto più elevata rispetto a quelli con un residuo di acido nucleico bloccato (LNA) nella stessa posizione .

Sebbene Kurreck et al abbiano riportato che gli oligonucleotidi LNA erano stabili nel siero umano , gli oligonucleotidi partially parzialmente modificati erano molto più resistenti alle nucleasi rispetto agli oligonucleotidi LNA nel plasma di ratto. Inoltre, gli oligonucleotidi modificati contiguamente con residui di EN all’estremità 3′ e 5′ mostrano una maggiore stabilità rispetto a quelli parzialmente modificati. Pertanto, gli oligonucleotidi EN hanno un alto potenziale come agenti antisenso e antigene che possono essere utilizzati in vivo . La formazione triplex Sequenza-specifica può essere applicata per il targeting genico, il silenziamento genico e la mutagenesi .

Prospettive future

Gli oligonucleotidi possono legare il sito-specificamente ad un gene dell’obiettivo di interesse dalla formazione dell’elica tripla. Gli oligonucleotidi triplex-formanti attualmente sono destinati per legarsi al gene HER-2 (human epidermal growth factor receptor 2)/ neu, un gene che è sovra-espresso in un’ampia varietà di tumori umani, compreso il cancro del polmone non a piccole cellule, il cancro al seno, il cancro ovarico ed i tumori di GI. Questa strategia sarà ampiamente applicabile per prevenire l’espressione di molti oncogeni o altri geni correlati al cancro. Questi oligonucleotidi “antigene” ora vengono utilizzati per fornire agenti DNA-alchilanti a basi specifiche nel promotore HER-2/neu e nella sequenza codificante, per prevenire l’inizio e l’allungamento della trascrizione. In particolare, gli oligonucleotidi triplex-formanti sono stati usati per consegnare la senape dell’azoto, quale il clorambucile, ad una base specifica della guanina nel gene HER-2/neu per impedire l’espressione genica. La strategia anti-cancro target-specifica che coinvolge oligonucleotidi antigene accoppiati a farmaci attivi del DNA si rivelerà una pietra miliare nel prossimo futuro.

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